生物體試樣中的l-色氨酸分析方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法
2023-12-10 07:06:57
生物體試樣中的l-色氨酸分析方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種包括將樣品、L-色氨酸氧化酶和水混合的步驟、將所得反應液在氧的存在下放置指定時間的步驟、測定放置後的反應液中存在的因所述酶的作用而產生的反應產物的步驟的L-色氨酸的定量方法。所述L-色氨酸氧化酶具有指定胺基酸序列，且具有在氧和水的存在下，作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0～3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性。本發明還公開了包含上述L-色氨酸氧化酶的L-色氨酸的定量用試劑盒和使用上述L-色氨酸氧化酶的酶傳感器。本發明的方法、試劑盒和酶傳感器使用了L-色氨酸特異性酶，因此即使在其他胺基酸共存下也能對L-色氨酸進行定量。
【專利說明】生物體試樣中的L-色氨酸分析方法以及用於該方法的試劑盒
[0001]相關申請的相互引用
[0002]本申請要求2011年3月4日申請的日本特願2011-48101號的優先權，其全部內容在此援引作為特別公開。
【技術領域】
[0003]本發明涉及使用L-色氨酸氧化酶的L-色氨酸分析方法以及用於其的試劑盒，其中，所述L-色氨酸氧化酶適合於將生物體試樣中的L-色氨酸轉化為可定量的產物、通過該產物的檢測或定量來測定L-色氨酸的含量。
【背景技術】
[0004]以血中為代表的生物體試樣中的胺基酸濃度的定量是各種疾病檢測的標誌物，其定量方法的開發是醫療立場上強烈需求的。胺基酸濃度的酶定量方法與儀器分析相比具有迅速、簡便等特點，是一種適合於在實際的醫療現場進行各種疾病檢測的方法。
[0005]作為對L-色氨酸進行酶學定量的傳統技術，已知有使用(i)L_色氨酸單加氧酶(非專利文獻A、非專利文獻B)、和(ii)L-胺基酸氧化酶的方法(專利文獻A)。
[0006]專利文獻A:日本特開2001-069974號公報
[0007]非專利文獻 A:Emanuele, J.J.,Heasley, C.J., and Fitzpatrick,P.F.(1995) ArchBiochem Biophys316，241-248
[0008]非專利文獻B:Simonian，A.L.，Rainina，E.1.，Fitzpatrick, P.F.，and Wild,J.R.(1997)Biosens Bioelectronl2，363-371
[0009]非專利文獻C:Balibar，C.J.，and Walsh, C.T.(2006)Biochemistry45,15444-15457
[0010]非專利文獻D:0naka，H.，Taniguchi，S.，Igarashi, Y.，and Furumai, T.(2002) JAntibiot55，1063-1071
[0011]非專利文獻E:Tonismagi，K.，Samel, M.，Trummal, K.，Ronnholm，G.，Siigur, J.，Kalkkinen，N.，and Siigur，E.(2006) Toxicon48，227-237 非專利文獻 F:Tan，N.H.，andSaifuddin，M.N.(1991) Int J Biochem23，323-327
[0012]非專利文獻G:Yang，H.，Johnson，P.M.，Ko，K.C.，Kamio，M.，Germann, M.W.，Derby，C.D.，and Tai』P.C.(2005) J Exp Biol208，3609-3622
[0013]非專利文獻H:Ehara, Τ.，Kitajima，S.，Kanzawa, N.，Tamiya，T.，and Tsuchiya，T.(2002) FEBS Lett531，509-512
[0014]非專利文獻1:Geueke，B.，and Hummel, W.(2002)Enzyme Microb Technol31，77-87
[0015]非專利文獻J:Tong，H.，Chen, W.，Shi, W.，Qi，F.，and Dong, X.(2008) JBacterioll90，4716-4721[0016]非專利文獻K:0naka, Η.，Taniguchi, S.，Ikeda, H.，Igarashi, Y.，and Furumai,T.(2003)J Antibiot56,950-956
【發明內容】
[0017]在上述的使用(i)L_色氨酸單加氧酶的方法中，有必要檢測伴隨L-色氨酸氧化的氧減少量。因此，需要原理上複雜的裝置(非專利文獻B)。此外，上述L-色氨酸單加氧酶在對L-色氨酸的活性設為100%時，對L-苯丙氨酸顯示出83%、對L-甲硫氨酸顯示出42%的高相對活性(非專利文獻A)。因而，使用該酶的方法不適合進行簡便、廉價且L-色氨酸特異性高的檢測。
[0018]對於上述的使用(ii)L-胺基酸氧化酶的方法，公知的L-胺基酸氧化酶一般而言底物特異性低，L-色氨酸以外的多種L-胺基酸也可作為反應底物。因此，尚不知曉在雜質存在下利用L-胺基酸氧化酶進行L-色氨酸特異性檢測的例子。例如，作為L-胺基酸氧化酶，已知蛇毒中的多種酶。但是，上述酶均對廣泛的胺基酸種類具有活性(非專利文獻E、F)。此外，軟體動物、細菌來源的L-胺基酸氧化酶也有報告。但是，這些也均已知底物特異性寬泛(非專利文獻G，H，I，J)，使用這些酶對L-色氨酸進行定量在原理上是不可能的。
[0019]作為對L-色氨酸的底物特異性較高的酶,報告了擔子菌Coprinus sp.來源的L-胺基酸氧化酶(專利文獻A)。但，上述酶對L-苯丙氨酸等其他種類的胺基酸也顯示7%左右的反應性。因而，依然不適合於雜質多的生物體試樣的測定。此外，上述酶對L-色氨酸的Km值為650 μ Μ，為了對血中中僅以數十μ Μ數量級的濃度存在的L-色氨酸準確進行定量，底物親和性低也成為問題。實際上，目前為止尚不知有使用L-胺基酸加氧酶對試樣中的L-色氨酸進行定量的例子。而且，上述酶未經基因鑑定，擔子菌的長期(約1個月)培養和複雜的純化過程對其製造而言是必要的。基於以上理由，利用上述酶的生物體試樣中的L-色氨酸定量、以及需要大量的酶的實用化是困難的。
[0020]因此，本發明的目的在於，探索即使在共存有其他胺基酸的生物體試樣中，也能夠用於L-色氨酸特異性定量的新酶，提供使用該酶的、L-色氨酸的新的分析方法。
[0021 ] 而且，本發明的目的還在於提供可在實施上述酶的分析方法時利用的測定用試劑盒。而且，本發明的目的還在於提供可在上述酶的分析方法中利用的酶傳感器。
[0022]本發明人從細菌的雙吲哚類抗生素生物合成途徑中的基因中發現了對L-色氨酸底物特異性高的L-色氨酸氧化酶。通過使該酶與生物體試樣中所含的L-色氨酸反應，可以生成可檢測的化合物，而且，發現該酶不受生物體試樣中混合存在的其他胺基酸的影響，能夠進行L-色氨酸特異性定量，從而完成了本發明。
[0023]本發明如下。
[0024][1], 一種分析樣品中的L-色氨酸的方法，所述方法包括
[0025]步驟(Α):將樣品、L-色氨酸氧化酶以及水混合，
[0026]步驟(Β):將通過所述混合而得到的反應液在氧的存在下放置指定時間，
[0027]步驟(C):對放置後的反應液中存在的因所述酶的作用而產生的反應產物中的至少一種的存在進行確認，或對所述反應產物中的至少一種的量進行測定；
[0028]其中，在所述L-色氨酸氧化酶中
[0029](al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且[0030](a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；
[0031](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列；
[0032](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或
[0033](3)與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0034][2],根據[1]所述的方法，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L_苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。 [0035][3], [1]或[2]所述的方法，其中，在步驟㈧中用於與樣品混合的所述L-色氨酸氧化酶在所述酶的穩定劑的存在下保存。
[0036][4],根據[3]所述的方法，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
[0037][5], [1]~[4]中任一項所述的方法，其中，所述步驟(C)中進行確認或測定的反應產物是過氧化氫。
[0038][6],包含以下試劑的用於L-色氨酸分析的試劑盒:(K1)L_色氨酸氧化酶，所述L-色氨酸氧化酶
[0039](al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且
[0040](a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；
[0041](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列；
[0042](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或
[0043](3)與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0044][7], [6]所述的試劑盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L_苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0045][8], [6]或[7]所述的試劑盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶是與所述酶的穩定劑的混合物。
[0046][9],根據[8]所述的試劑盒，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
[0047][10].根據[6]~[9]中任一項所述的試劑盒，其還包含(K2)反應用緩衝液、(K3)過氧化氫檢測用試劑、(K4)氨檢測試劑和(K5)吲哚丙酮酸檢測試劑中的至少一種。
[0048][11].一種含L-色氨酸氧化酶的用於L-色氨酸分析的組合物，其中，在所述L-色氨酸氧化酶中
[0049](al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且
[0050](a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；
[0051](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列；
[0052](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或
[0053](3)與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0054][12].根據[11]所述的組合物，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L_苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0055][13].根據[11]或[12]所述的組合物，其中，含有所述酶的穩定劑。
[0056][14].根據[13]所述的組合物，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
[0057][15].—種使用L-色氨酸氧化酶的用於L-色氨酸的檢測或定量的酶傳感器，其中，所述檢測用電極是過氧化氫檢測用電極，且所述L-色氨酸氧化酶
[0058](al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且
[0059](a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；
[0060](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列；
[0061](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或
[0062](3)與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0063][16].根據[15]所述的酶傳感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L_苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0064][17].根據[15]或[16]所述的酶傳感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶與所述酶的
穩定劑一起使用。
[0065][18].根據[17]所述的酶傳感器，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
[0066][19.]根據[15]~[18]中任一項所述的酶傳感器，其中，過氧化氫檢測用電極是酶式過氧化氫電極或隔膜式過氧化氫電極。
【發明內容】
[0067]根據本發明，通過使用對L-色氨酸特異性的色氨酸氧化酶，即使在包含其他胺基酸等許多雜質的試樣中，也能夠L-色氨酸特異地進行迅速、簡便的檢測。特別是，對於血漿、血清或尿這樣的生物體試樣，本發明是有效的，通過與過氧化物酶等酶偶聯，不僅能夠採用生色法、螢光法對L-色氨酸進行定量，還能夠提供電極型酶傳感器。【專利附圖】
【附圖說明】[0068][圖1]顯示各L-色氨酸濃度中的StaO的活性。
[0069][圖2]顯示StaO引起的L_色氨酸標準曲線製作樣品的吸光度的時間性變化。
[0070][圖3]顯示利用使用StaO的樣品製作的L-色氨酸標準曲線。
[0071][圖4]顯示VioA引起的L-色氨酸標準曲線製作樣品的吸光度的時間性變化。
[0072][圖5]顯示利用使用VioA的樣品製作的L-色氨酸標準曲線。
[0073][圖6]顯示利用儀器分析或L-色氨酸氧化酶進行的人血漿試樣中L-色氨酸定量結果。
[0074][圖7]顯示各種甘油濃度存在下的StaO殘存活性的時間性變化。
[0075][圖8]顯示各種甘油濃度存在下的VioA殘存活性的時間性變化。
[0076][圖9]顯示10%甘油存在下或不存在下的、4°C或_80°C過夜保存VioA後的殘存活性。
[0077]發明的【具體實施方式】
[0078]
[0079]本發明的L-色氨酸的分析方法包括:將樣品和L-色氨酸氧化酶和水混合的步驟(A);將通過所述混合而得 到的反應液在氧的存在下放置指定時間的步驟(B);確認放置後的反應液中存在的因所述酶的作用而產生的反應產物中的至少一種的存在、或者測定所述反應產物中的至少一種的量的步驟(C);其是通過這些步驟來確認樣品中的L-色氨酸的存在、或對其進行定量的方法。
[0080]在本發明的方法中，作為樣品使用的生物體試樣是具有包含L-色氨酸的可能性的試樣即可，可以是任何生物體試樣。生物體試樣可以根據通過使L-色氨酸氧化酶作用於生物體試樣、對哪個產物進行確認或定量，來對生物體試樣中的L-色氨酸進行確認或對其濃度進行測定，來適宜地選擇。例如，在利用生色劑、螢光劑對上述產物進行確認或定量的情況下，優選無色的水溶液，作為例子可以列舉出血清和血漿等。
[0081]本發明中使用的所述L-色氨酸氧化酶
[0082](al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，且對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性。
[0083](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列；
[0084](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列中，具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或
[0085](3)與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列
[0086](1)具有序列表的SEQ ID NO:1所述的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性的酶是VioA,其是紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)來源的酶。VioA是作為催化紫色色桿菌生產的抗生素紫色桿菌素的生物合成途徑的一部分的酶被鑑定出來的，該酶被報告具有L-色氨酸氧化活性(非專利文獻C)。但是，本酶的以底物特異性為代表的酶學的性質目前尚未開展研究，因而，VioA是具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，且對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸不具有氧化酶活性的酶這一事實，是在本發明中首次明確的。而且，對於將VioA用於L-色氨酸的定量，目前尚無報告。
[0087](1)具有序列表的SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性的酶是作為鏈黴菌屬種(Streptomyces sp.) TA-A0724來源的酶的StaO。關於StaO,該酶的基因是在該菌所生產的抗生素星形孢菌素(staurosporine)的生物合成基因簇中被發現的(非專利文獻D)。本基因與上述VioA的基因不具有顯著同源性，此外，對基因產物未進行過生化解析，其基因產物的性質是未知的。因而，StaO是具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸不具有氧化酶活性的酶這一事實，是在本發明中首次明確的。
[0088]而且，在本說明書中，「對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%」中的「對L-苯丙氨酸的氧化酶活性」和「對L-色氨酸的氧化酶活性」是指:在實施例中的「4.L-色氨酸氧化酶對胺基酸的底物特異性」的試驗方法中，分別使用L-苯丙氨酸和L-色氨酸作為組成蛋白質的胺基酸的情況下得到的相對活性。上述「4.L-色氨酸氧化酶對胺基酸的底物特異性」的試驗方法中得到的活性值的檢測限均為0.5%。此外，本發明中使用的L-色氨酸氧化酶從提高分析精度的觀點來看，優選對L-苯丙氨酸的氧化酶活性為對L-色氨酸的氧化酶活性的0~2%的範圍，更優選0~1.5%的範圍，更優選0~1%的範圍。
[0089]而且，「對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸不具有氧化酶活性」中的「對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸的氧化酶活性」是指:在實施例中的「4.L-色氨酸氧化酶對胺基酸的底物特異性」的試驗方法中，作為組成蛋白質的胺基酸分別使用L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸的情況下所得的相對活性。而且，「不具有氧化酶活性」是指相對活性為1%以下，優選不顯示超過檢測限(0.5%)的相對活性。
[0090]而且，具有作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性、對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%、對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性，這些分別可以採用實施例所述的分析方法(定量方法)來確認。此外，組成蛋白質的胺基酸是指:L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-穀氨酸、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬醯胺、L-脯氨酸、L-穀氨醯胺、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-。
[0091]本說明書中提及的「具有1~50個的胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列」中的「1~50個」的範圍是指:具有缺失等的蛋白質是具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸不具有氧化酶活性的酶。所述「1~50個」的範圍從是具有所述氧化酶活性的蛋白質的比例高的觀點來看，可以是例如，1~40個、優選1~30個、更優選1~20個、更優選1~10個、更優選1~7個、更優選1~5個、特別優選1~3個左右。
[0092]本說明書中提及的「與序列表的SEQ ID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列」中的同一性是指:具有所述胺基酸序列的同一性的蛋白質是具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的範圍，對L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的胺基酸不具有氧化酶活性的酶即可，沒有特殊限制。所述胺基酸序列的同一性是90%以上即可，沒有特殊限制，優選95%以上、更優選96%以上、更優選97%以上、更優選98%、特別優選99%以上。
[0093]本發明中使用的L-色氨酸氧化酶不限於是由特定的種生產的，其是指:伴隨特異地對L-色氨酸的氨基的氧化脫氨基化，生產過氧化氫。
[0094]而且，本發明中使用的L-色氨酸氧化酶具有同樣的活性即可，包括從自然界分離出的生物來源的，也包括將編碼本酶的基因以大腸桿菌、其他生物作為宿主進行表達而得到的酶或蛋白質。
[0095]此外，作為利用異種表達的生產方法，可以列舉出例如，由從具有同樣的活性的生物物種抽提的基因組DNA對該基因進行PCR擴增，將其插入pET或pUC等中構建質粒載體，然後轉化BL21、JM109等宿主菌株，再進行培養的方法。也可以適宜採用這些以外的公知的方法。
[0096]對於本發明中使用的L-色氨酸氧化酶的取得方法沒有特殊限制，可以是化學合成的蛋白質，也可以是採用基因重組技術製作的重組蛋白質。在製作重組蛋白質的情況下，如後述地取得編碼該蛋白質的基因(DNA)。通過將該DNA導入適當的表達系統，可以產生上述的L-色氨酸氧化酶。
[0097]上述L-色氨酸氧化酶可以通過下述上述生產方法來製備，所述生產方法包括:將編碼L-色氨酸氧化酶的基因搭載在載體上，利用該載體轉化宿主細胞後，培養轉化的宿主細胞，在培養物中蓄積編碼所述基因的蛋白質，收集蓄積的蛋白質。
[0098]對編碼上述L-色氨酸氧化酶的基因的取得方法沒有特殊限制。編碼本發明的L-色氨酸氧化酶的基因例如可以基於SEQ ID NO:1或者2所述的胺基酸序列或SEQ ID NO:3或者4所記載的鹼基序列的信息，採用化學合成、基因工程方法或突然誘變等本領域技術人員已知的任意方法來製作。
[0099]可以通過採用例如，對於具有序列表的SEQ ID NO:3或4所述的鹼基序列的DNA，使之與作為突變原的藥物接觸作用的方法、照射紫外線的方法、基因工程的方法等來進行。作為基因工程方法之一的定點誘變是一種能夠針對特定的位置導入特定的突變的方法，因而是有用的，可以採用公知方法 來進行。
[0100]基於本說明書中的序列表的SEQ ID NO:1或者2所記載的胺基酸序列或SEQ IDNO:3或者4所示的鹼基序列的信息，製備適當的探針、引物，通過使用它們對紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或鏈黴菌屬種(Streptomyces sp.) TA-A0724的基因組文庫進行篩選，能夠分離出本發明的基因。基因組文庫可以從紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或鏈黴菌屬種(Streptomyces sp.) TA-A0724 米用常規方法來製作。[0101]還可以採用PCR法取得編碼本發明的L-色氨酸氧化酶的基因。使用上述紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或鏈黴菌屬種(Streptomyces sp.) TA-A0724的基因組文庫作為模板，使用設計成可擴增SEQ ID NO:3或者4所記載的鹼基序列的1對引物，進行PCR。PCR的反應條件可以適宜設定，可以列舉出例如下述條件等:將由94°C 30秒(變性)、55°C 30秒~1分鐘(退火)、72°C 2分鐘(延伸)組成的反應步驟作為1個循環，例如進行30個循環後，72°C反應7分鐘。然後，可以將擴增得到的DNA片段克隆至可在大腸桿菌(E.coli)等宿主中擴增的適合的載體中。
[0102]上述的探針或引物的製備、基因組文庫的構建、基因組文庫的篩選、以及目的基因的克隆等操作可以按照本領域技術人員已知的方法適宜進行。
[0103]上述L-色氨酸氧化酶的基因可以插入到適當的載體中來使用。對本發明中使用的載體的種類沒有特殊限制，例如，可以是可自主複製的載體(例如質粒等)，或者可以是導入到宿主細胞中時能夠整合到宿主細胞的基因組中、並與被整合的染色體一起複製的載體。優選載體是表達載體。在表達載體中，上述基因與轉錄所必需的元件(例如啟動子等)可操作連接。啟動子是在宿主細胞中顯示轉錄活性的DNA序列，可以根據宿主的種類適宜選擇。
[0104]作為可在細菌細胞中工作的啟動子，可以列舉出:嗜熱脂肪土芽孢桿菌麥芽糖澱粉酶基因(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、地衣芽胞桿菌α 澱粉酶基因(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、解澱粉芽胞桿菌BAN澱粉酶基因(Bacillus amylo liquefaciens BAN amylase gene)、枯草芽抱桿菌喊性蛋白酶基因(Bacillus subtilis alkaline protease gene)或短小芽抱桿菌木糖苷酶基因(Bacilluspumilus xylosidase gene)的啟動子、或Lambda曬菌體的PK或者Pl啟動子、大腸桿菌(E.coli)的lac、trp或者tac啟動子等。
[0105]作為可以在哺乳動物細胞中工作的啟動子的例子，有SV40啟動子、MT-1 (金屬硫蛋白基因)啟動子、或腺病毒2主後期啟動子等。作為可以在昆蟲細胞中工作的啟動子的例子，多角體蛋白啟動子、P10啟動子、Autographa californica polyhedrosis鹼性蛋白啟動子、棒狀病毒即時型早期基因1啟動子、或棒狀病毒39K延遲型早期基因啟動子等。作為可以在酵母宿主細胞中工作的啟動子的例子，可以列舉出酵母解糖系基因來源的啟動子、醇脫氫酶基因啟動子、TPI1啟動子、ADH2-4C啟動子等。作為可以在絲狀真菌細胞中工作的啟動子的例子，有ADH3啟動子或tpiA啟動子等。
[0106]此外，上述L-色氨酸氧化酶的基因可以視需要與適合的終止子可操作連接。含L-色氨酸氧化酶的基因的重組載體還可以具有Poly A信號(例如SV40或腺病毒5Elb區域來源的)、轉錄增強子序列(例如SV40增強子)等元件。含L-色氨酸氧化酶的基因的重組載體還可以具備使得該載體能夠在宿主細胞內複製的DNA序列，作為一例，可以列舉出SV40複製起點(宿主細胞為哺乳類細胞時)。
[0107]含L-色氨酸氧化酶的基因的重組載體還可以含有選擇標誌物。作為選擇標誌物，可以列舉出例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI基因等這樣的宿主細胞內缺乏其補體的基因，或者例如氨苄西林、卡那黴素、四環素、氯黴素、新黴素或者潮黴素這樣的藥物抗性基因。將L-色氨酸氧化酶的基因、啟動子、和視需要的終止子和/或分泌信號序列分別連接，再將其插入適合的載體的方法是本領域技術人員周知的。[0108]通過將含L-色氨酸氧化酶的基因的重組載體導入適當的宿主，可以製作轉化體。被導入含L-色氨酸氧化酶的基因的重組載體的宿主細胞表達L-色氨酸氧化酶的基因即可，可以是任意細胞，可以列舉出細菌、酵母、真菌和高等真核細胞等。
[0109]作為細菌細胞的例子，可以列舉出芽孢桿菌或streptomyces等革蘭氏陽性菌或大腸桿菌(E.coli)等革蘭氏陰性菌。這些細菌的轉化可以採用原生質體法、或按公知的方法使用感受態細胞來進行。作為哺乳類細胞的例子，可以列舉出HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞或CH0細胞等。轉化哺乳類細胞、並在該細胞中表達導入的DNA序列的方法也是公知的，可以採用例如，電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法等。
[0110]作為酵母細胞的例子，可以列舉出屬於酵母或裂殖酵母的細胞，可以列舉出例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)等。作為對酵母宿主導入重組載體的方法，可以列舉出例如，電穿孔法、球狀體法、醋酸鋰法等。 [0111]作為其他真菌細胞的例子，是絲狀真菌，例如屬於麴黴、脈孢菌、鐮孢菌、或木黴菌的細胞。在使用絲狀真菌作為宿主細胞的情況下，可以通過將DNA構建物整合至宿主染色體得到重組宿主細胞。來進行轉化。DNA構建物對宿主染色體的整合可以採用公知方法、例如同源重組或非同源重組來進行。
[0112]在使用昆蟲細胞作為宿主的的情況下，可以採用公知的方法將重組基因導入載體和棒狀病毒共導入昆蟲細胞，在昆蟲細胞培養上清中中得到重組病毒後，在用重組病毒感染昆蟲細胞，從而表達蛋白質。
[0113]作為棒狀病毒，可以使用例如，作為感染夜蛾科昆蟲的病毒的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
[0114]作為昆蟲細胞，可以使用作為草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞的Sf9、Sf21〔棒狀病毒表達載體，實驗室操作手冊，W.H.Freeman and Company, (NewYork)、(1992)〕、作為甘藍尺蠖(Trichoplusia ni)的卵巢細胞的 HiFive (Invitrogen 公司製造)等。
[0115]作為用於製備重組病毒的、針對昆蟲細胞的重組基因導入載體以及上述棒狀病毒的共導入方法，可以列舉出例如，磷酸鈣法或脂質體法等。
[0116]將上述的轉化體在導入的基因可表達的條件下在適合的營養培養基中進行培養。為了從轉化體的培養物分離純化出本發明中使用的L-色氨酸氧化酶，可以採用通常的蛋白質分離、純化方法。例如，在本發明中使用的L-色氨酸氧化酶以溶解於細胞內的狀態表達的情況下，培養結束後，將細胞通過離心分離回收，懸浮於水系緩衝液後，利用超聲波破碎機等破碎細胞，得到無細胞抽提液。從將該無細胞抽提液離心分離而得到的上清中，單獨或組合使用通常的蛋白質分離純化方法，即溶劑抽提法、利用硫酸銨等進行的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑進行的沉澱法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)瓊脂糖等樹脂的陰離子交換色譜法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製造)等樹脂的陽離子交換色譜法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂的疏水性色譜法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和色譜法、色譜聚焦法、等電點電泳等電泳法等方法，可以以純化標準品的形式得到本發明的L-色氨酸氧化酶。
[0117]利用L-色氨酸氧化酶進行的L-色氨酸的氧化反應如以下的反應式A所示。
[0118][化學式1][0119]
【權利要求】
1.一種分析樣品中的L-色氨酸的方法，所述方法包括步驟(A):將樣品、L-色氨酸氧化酶以及水混合，步驟(B):將通過所述混合而得到的反應液在氧的存在下放置指定時間，步驟(C):對放置後的反應液中存在的因所述酶的作用而產生的反應產物中的至少一種的存在進行確認，或對所述反應產物中的至少一種的量進行測定；其中，在所述L-色氨酸氧化酶中(al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或(3)與序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
3.權利要求1或2所述的方法，其中，在步驟(A)中用於與樣品混合的所述L-色氨酸氧化酶在所述酶的穩定劑的存在下保存。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
5.權利要求1~4中任一項所述的方法，其中，所述步驟(C)中進行確認或測定的反應產物是過氧化氫。
6.包含以下試劑的用於L-色氨酸分析的試劑盒:(Kl)L-色氨酸氧化酶，在所述L-色氨酸氧化酶中，(al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或(3)與序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
7.權利要求6所述的試劑盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
8.權利要求6或7所述的試劑盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶是與所述酶的穩定劑的混合物。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
10.根據權利要求6~9中任一項所述的試劑盒，其還包含(K2)反應用緩衝液、(K3)過氧化氫檢測用試劑、(K4)氨檢測試劑和(K5)吲哚丙酮酸檢測試劑中的至少一種。
11.一種含L-色氨酸氧化酶的用於L-色氨酸分析的組合物，其中，在所述L-色氨酸氧化酶中(al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或(3)與序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
13.根據權利要求11或12所述的組合物，其中，含有所述酶的穩定劑。
14.根據權利要求13所述的`組合物，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
15.一種使用L-色氨酸氧化酶的用於L-色氨酸的檢測或定量的酶傳感器，其中，所述檢測用電極是過氧化氫檢測用電極，且在所述L-色氨酸氧化酶中，(al)具有下述⑴~(3)中的任一個的胺基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用於L-色氨酸而生成過氧化氫和氨的氧化酶活性，對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，對除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的組成蛋白質的胺基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列中具有1~50個胺基酸的缺失、取代和/或添加的胺基酸序列；或(3)與序列表的SEQID NO:1或2所述的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
16.根據權利要求15所述的酶傳感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的對L-苯丙氨酸的氧化酶活性是對L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
17.根據權利要求15或16所述的酶傳感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶與所述酶的穩定劑一起使用。
18.根據權利要求17所述的酶傳感器，其中，所述穩定劑是選自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1種。
19.根據權利要求15~18中任一項所述的酶傳感器，其中，過氧化氫檢測用電極是酶式過氧化氫電極或隔膜式過氧化氫電極。
【文檔編號】C12N9/06GK103635589SQ201280011699
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年3月2日 優先權日:2011年3月4日
【發明者】淺野泰久, 龜谷將史, 尾仲宏康 申請人:富山縣, 味之素株式會社