針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體的製作方法

2023-12-02 16:15:11 1

專利名稱：針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及單域重鏈抗體技術(又稱為納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術， 特別是涉及針對免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG ) Fc 段(fragment crystalline, Fe)的單域重鏈抗體或多肽。
背景技術：
重鏈抗體(Heavy-chain antibody)是一種天然缺失輕鏈，僅由重鏈組成的抗體， 存在於駱駝、鯊魚等動物中。單域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)是指僅由重鏈抗體可變區(Variable region) 組成的基因工程抗體。與普通抗體相比，單域重鏈抗體具有分子量小，穩定性高，水溶性好等優點，目前已廣泛應用於基礎研究、醫學診斷和檢測、藥物研發等領域。免疫球蛋白G (immunoglobulin G，IgG)由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。每條鏈都含有可變區(variable region，V區)和恆定區(constant region，C區)，其中可變區提供抗原結合位點和特異性，恆定區構成免疫球蛋白的框架，具有生物效應功能。 用木瓜蛋白酶消化IgG，可將其分成3個功能區，即2個相同的抗原結合片段(fragment antigen binding, Fab)禾口一個可結晶片段(fragment crystalline, Fe)。 Fc 段位於十亙定區，由兩條重鏈羧基端的一半組成。由於Fc段遠離抗原結合部位，因此提供了一個與抗體結合而不影響抗原抗體反應的區域，是最有效的二抗試劑結合的表位區。目前，已有針對IgG Fc段的多克隆抗體、單克隆抗體的公開報導。與單域重鏈抗體相比，這些抗體存在生產成本較高，製備過程繁瑣等缺點。單域抗體具備分子量小、穩定性高、易於表達等性質，具有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明之目的是提供針對免疫球蛋白G的Fc段的單域重鏈抗體(包括含有所述單域重鏈抗體全部或部分功能區域的蛋白質或多肽)及其胺基酸序列，可被用於製備檢測或純化、富集IgG的試劑和工具。本發明提供一種針對免疫球蛋白G的Fc段的單域重鏈抗體，具有SEQ ID N0. 1 所示的胺基酸序列，其胺基酸序列的IMGT編號和結構域的劃分如圖1所示。本發明所提供的單域重鏈抗體包括4個框架區(Framework region, FR)和三個互補決定區(Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架區(FR1-FR4)分別選自 SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8，互補決定區(CDR1-CDR3) 分別選自SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7。互補決定區主要負責抗原的識別，框架區結構相對穩定，主要起著維持蛋白質結構的作用。本發明提供一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. :8中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與其中的一個胺基酸序列具有90%同源性。
本發明提供一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID NO. :3,SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與其中的一個胺基酸序列具有80% 同源性。本發明還提供了一種核酸分子，其特徵是編碼SEQ ID NO. :1, SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :5, SEQ ID NO. :6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8, 通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。本發明所提供的核苷酸序列或部分序列可以通過合適的表達系統進行表達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞， 植物細胞，或無細胞表達系統。本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由於遺傳密碼子具有簡併性，該核酸序列可以根據不同的應用目的而不同。本發明還提供一種宿主細胞，包含所述蛋白質或多肽的表達載體。本發明還提供了一種純化或檢測免疫球蛋白G的方法，其特徵是含有上述蛋白質或多肽。基於本發明提供的蛋白質或多肽與免疫球蛋白G特異性結合的能力，建立免疫球蛋白G的純化或檢測方法。其中，優選的方法包括酶聯免疫吸附法 immunosorben t assay, ELISA )，焚光免疫法 iFluoroimmunoassay, FIA )，免疫晶片法禾口親禾口層析法。本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造， 能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用於醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。本發明中所敘述的一些術語具有如下含義。同源性描述兩個或更多胺基酸序列的相似程度，第一個胺基酸序列和第二個胺基酸序列之間同源性的百分比可以通過第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置處的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的數量除以第一個胺基酸序列中胺基酸總數再乘以100%來計算，其中第二胺基酸序列中的某個胺基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一胺基酸相比)被認為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用於序列匹配的計算機運算程序如NCBI Blast獲得。結構域蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。IMGT H IMGT ^ig(The International ImMunoGeneTics Database) ψ ^ 一種已經標準化的抗體胺基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenmarm， F. , Q. Kaas, et al. (2010). 〃IMGT/3Dstructure_DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. 〃 Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D301-307. Lefranc, M. P. , C. Pommie, et al. (2003). "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-Iike domains. 「 Dev Comp Immunol 27(1) : 55-77.)中的描述。密碼子(codon):又稱為三聯體密碼(triplet code)，指對應於某種胺基酸的核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種胺基酸插入生長中多肽鏈的位置。


圖1胺基酸編號及結構域示意圖。圖2間接phage-ELISA法測定噬菌體結合活性。縱坐標表示ELISA讀數計測定 450nm處吸光度值，橫坐標表示按照表1加樣，其中1表示實驗組，2表示背景對照，3表示空白對照a，4表示空白對照b。圖3噬菌粒pHEN-T6結構圖。圖4表達質粒pRXS-T6結構圖。圖5融合表達質粒pAP-T6。
具體實施例方式下面通過單域中鏈抗體的製備、分析以及應用，對本發明作進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用範圍。應用實例1。抗IgG Fc段單域重鏈抗體的淘選與鑑定。採用固相親和淘選的方法從駝源天然單域重鏈抗體噬菌體展示文庫禮+1 2中淘選針對IgG Fc段的單域重鏈抗體。採用親和層析法純化小鼠血清，得到IgG溶液。用PBS稀釋 IgG溶液至5(Tl00 yg/mL，每孔加入100 yL,4 °C，包被過夜；吸出包被液，PBS洗板3次， 每孔加入300 μ L 3% BSA-PBS,37 °C，封閉2 h ;PBS洗板6次，加入100 μ L噬菌體抗體庫 (約含2 X IO11 CFU)，37 °C，孵育1.5 h ；吸出未結合的噬菌體，用PBST(含0. 5 % Tween-20) 洗板5次(逐輪增加1次)，再用PBS洗板10次(洗板次數逐輪增加5次)；以100 μ L洗脫液(甘氨酸-鹽酸，PH 2. 2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50 μ L Tris-HCKl mol/L, PH 8.0)中和洗脫物，取10 μ L用於滴度測定，其餘洗脫物擴增後用於下一輪淘選。經三輪淘選後，採用輔助噬菌體ΚΜ13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用間接ELISA測定噬菌體顆粒的結合活性(圖2)，實驗設定陽性對照、陰性對照及背景對照，具體加樣步驟見表1。表1間接phage-ELISA加樣表
權利要求
1.一種針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的胺基酸序列， 包括4個框架區和三個互補決定區，其中，框架區分別選自SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :6 禾口 SEQ ID NO. :8，互補決定區分別選自 SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5 禾口 SEQ ID NO. :7。
2.一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :6禾口 SEQ ID NO. :8中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與其中的一個胺基酸序列具有 90%同源性。
3.一種蛋白質或多肽，其特徵是包含SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一個或者兩個以上的胺基酸序列，且至少與其中的一個胺基酸序列具有80%同源性。
4.一種核酸分子，其特徵是編碼 SEQ ID NO. :1, SEQ ID NO. :2, SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :4, SEQ ID NO. :5, SEQ ID NO. :6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8。
5.一種包含權利要求4所述的核酸序列的載體。
6.一種包含權利要求5所述的載體的宿主細胞。
全文摘要
一種針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體，具有SEQIDNO.:1所示的胺基酸序列，包括4個框架區和三個互補決定區，其中，框架區分別選自SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:6和SEQIDNO.:8，互補決定區分別選自SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:7；本發明還涉及編碼所述單域重鏈抗體和多肽的核酸；製備所述單域重鏈抗體和多肽的方法。該單域重鏈抗體或多肽可以用於製備檢測或純化抗體的試劑或材料。
文檔編號C12N15/63GK102399288SQ201110318630
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者付金衡, 塗追, 許楊, 陶勇 申請人:山西德豐信成生物科技有限公司