螢光檢測方法
2023-12-02 10:23:21
螢光檢測方法
【專利摘要】本發明揭露一種螢光檢測方法，首先將螢光檢測試劑加入樣品中。將樣品盛裝至一樣品盤中，其中樣品盤包含至少一列背景樣品孔，以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射樣品盤。取得樣品盤的一背景灰階影像。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出此列背景樣品孔的邊緣位置。根據此列背景樣品孔的邊緣位置，計算出此列待測樣品孔的邊緣位置。取得位於此列背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均作為一背景信號臨界值。根據背景信號臨界值對此列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
【專利說明】螢光檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明與包含酶或微生物的測定或檢驗方法有關，特別是有關於一種螢光檢測方法。
【背景技術】
[0002]利用螢光，是檢測核酸的一種技術。是利用適當波長的光照射具有螢光性質的樣品，樣品會吸收光的能量而被激發至高能量狀態，並在極短時間內回復低能量狀態，同時以放光的形式將多餘能量釋出。當樣品上結合有螢光或可呈色的化學物質，便能提供光源，使化學物質產生螢光反應。藉此，由外部觀察是否有螢光反應，便能知道樣品有沒有結合化學物質，或者是結合化學物質的樣品是否存在。
[0003]已知的螢光技術系統通常包含一激發光源、一感光元件、一聚光裝置。當光源照射在樣品上，樣品吸收能量產生光致螢光效應後發出螢光，但因為螢光信號微弱且亦受其他光源幹擾如激發光源，需通過聚光裝置收集後才能由感光元件感測。上述的聚光裝置通常由多片透鏡、反射鏡及放射光濾片(Emission Filter)組成，其光路複雜且不容易精確。而且光源通常為汞燈、氙燈或滷素燈等，雖其發光波長涵蓋範圍長，但激發光源需針對不同的螢光指示劑下去做選擇波段，所以還必須使用不同濾鏡做搭配，耗費成本高且激發能量弱。而感光元件感測光信號後將其轉為電流信號，又需通過轉阻放大器(Trans-1mpedanceAmplifier, TIA)將此電流信號轉換為模擬電壓信號，再利用模擬數字轉換電路(Analog toDigital Converter, ADC)將模擬電壓信號轉為數字電壓信號，才能得出所需的實驗要據，如此一來手續繁雜又需增加額外成本支出。
[0004]一般由外部判斷螢光反應的技術，是直接接收螢光，當螢光強度高於特定值，便視為有螢光反應。然而接收螢光的技術，容易受環境影響，難有穩定的準確度。且已知的螢光檢測技術裝置大體上為體積龐大的複雜系統，攜帶不便，如有須檢測的樣品需帶回實驗室才有辦法進行檢測，浪費時間且麻煩。
[0005]有鑑於上述問題，本發明提供了一種方便且檢測準確度更為穩定的一種螢光檢測方法。
【發明內容】
[0006]因此本發明的一目的在於提供一種螢光檢測方法，利用灰階影像與比對技術準確快速地分辨出樣品是否有螢光信號。
[0007]將螢光檢測試劑加入樣品中；將樣品盛裝至一樣品盤中。其中該樣品盤包含至少一列背景樣品孔。以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射該樣品盤。取得該樣品盤的一背景灰階影像。
[0008]根據本發明一實施方式，上述螢光檢測方法還包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
[0009]依據本發明又一實施方式，上述對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟，包含以背景光源照射樣品盤；取得樣品盤的一待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像，取得位於待測樣品孔內的灰階像素數據。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於背景信號臨界值；以及當位於待測樣品孔內的灰階像素數據大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
[0010]依據本發明另一實施方式，上述對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟，還包含根據待測灰階影像，取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據；根據位於背景樣品孔內的灰階像素數據，判斷是否讀出光源信號，當未讀出光源信號時，判斷為異常狀況，並終止實驗。
[0011]依據本發明再一實施方式，其中對於取得樣品盤的背景灰階影像的步驟是以電荷率禹合元件(Charge-couple Device, CO))或互補式金屬氧化物半導體(ComplementaryMetal Oxide Semiconductor, CMOS)等光感測器為之。
[0012]依據本發明又一實施方式，其中背景樣品孔上覆蓋有一減光片或偏光片，且待測樣品孔上覆蓋有一突光濾鏡。而背景光源為一發光二極體或一雷射光源，且背景光源照射樣品盤的方向，是選自樣品盤的上方、側邊、下方、及其組合。
[0013]根據本發明另一實施方式是在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。其中對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟，包含以背景光源照射該樣品盤。以相異曝光的時間取得該樣品盤的多個待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階像素數據。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於背景信號臨界值。以及當位於待測樣品孔內的灰階像素數據大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
[0014]依據本發明再一實施方式，上述其中取得樣品盤的待測灰階影像可為兩次、三次、四次或以上，且曝光時間隨著待測樣品距離光感測器遞增而遞增，通過擷取待測灰階影像的時間相異以浮動方式讓起始測量值一致。
[0015]根據本發明又一實施方式是在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。一定位步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
[0016]依據本發明另一實施方式，其中該定位步驟包含直接由樣品管內的樣品透出光定位。
[0017]依據本發明又一實施方式，其中該定位步驟包含實驗前樣品孔座標定位。
[0018]依據本發明再一實施方式，其中該定位步驟包含由樣品管加上一減光片或一偏光做樣品管定位。[0019]依據本發明另一實施方式，其中該定位步驟包含外加至少兩光源輔助定位。
[0020]藉此，本發明的螢光信號讀取作業不易受環境的影響，且移動後的螢光信號讀取作業也可以通過定位步驟做測量的校準；且本發明方法的穩定度與準確度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1繪示本發明一實施方式的螢光檢測方法的流程圖；
[0022]圖2繪示本發明一實施方式的螢光檢測方法的流程圖；
[0023]圖3繪示圖1的對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的流程圖；
[0024]圖4繪示對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的另一實施方式流程圖；
[0025]圖5繪示應用本發明的實施方式螢光感測裝置示意圖；
[0026]圖6繪示多次取得樣品盤的待測灰階影像的整合示意圖。
【具體實施方式】
[0027]圖1繪示本發明一實施方式是在提供一種螢光檢測方法，包含下述步驟。將螢光檢測試劑加入樣品中。將樣品盛裝至一樣品盤中，其中樣品盤包含至少一列背景樣品孔，以及至少一列待測樣品孔。以一背景光源照射樣品盤。取得樣品盤的一背景灰階影像。請參照圖2，如上述的螢光檢測方法還包含下述步驟。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
[0028]其中前述的樣品，能結合螢光或可呈色的化學物質。但不確定其中有多少部分已結合前述的化學物質，亦不知有多少部分未結合。因此需要利用前述方法分析。
[0029]其中取得灰階影像的技術，是取得背景光源中穿過背景樣品孔的可見光影像，再分析影像中每個像素的亮度所得。其中均值濾波的技術，是將背景灰階影像分割成多個由4x4立方的16像素組成的區塊。將16個像素的灰階值相加後除以16，再用此值表示此區塊的灰階值，便能完成均值濾波的技術。其中二值化的技術是將大於臨界灰階值的區塊設定為極大值，也就是黑色；將小於臨界灰階值的區塊設定為極小值，也就是白色，進而完成二值化。且臨界灰階值並非固定數值，而是依照使用者需求而調整，故於此不討論之。
[0030]背景光源所發射的光線會透過背景樣品孔，因此當背景灰階影像二值化而成黑白畫面後，便能利用白色的發光部分在背景灰階影像上找到背景樣品孔的邊緣，並確定背景樣品孔的位置。由於早已知道背景樣品孔與待測樣品孔的尺寸與位置等相對關係，因此能根據背景樣品孔的邊緣與位置，在背景灰階影像上標示出待測樣品孔的邊緣與位置。
[0031]圖3繪示圖2的對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的流程圖。根據背景灰階影像中背景樣品孔在二值化前的灰階像素數據，取平均值設定為背景信號臨界值。利用背景信號臨界值，便能對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業，判斷待測樣品孔中是否有螢光反應，其方法如下。以背景光源照射樣品盤。取得樣品盤的一待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階像素數據。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於背景信號臨界值。當位於各待測樣品孔內的灰階像素數據大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
[0032]圖4是繪示本發明的另一實施方式流程圖，其對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟如下，以背景光源照射樣品盤。以相異曝光的時間取得該樣品盤的多個待測灰階影像。均值濾波待測灰階影像。取得位於待測樣品孔內的灰階像素數據。逐個判斷位於待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於背景信號臨界值。當位於各待測樣品孔內的灰階像素數據大於背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
[0033]圖5及圖6為應用本發明一實施方式的一突光感測裝置400不意圖及繪不多次取得樣品盤的待測灰階影像的整合示意圖。其中圖6詳細說明其取得樣品盤的待測灰階影像的步驟。第一次取得樣品盤的一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像的曝光時間為2秒。第二次取得樣品盤的一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像的曝光時間為4秒。第三次取得樣品盤的一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像的曝光時間為6秒。第四次取得樣品盤的一待測灰階影像，其光感測器500擷取待測灰階影像的曝光時間為8秒。由圖6中可以看到光感測器500感測超過背景信號臨界值的待測樣品410，隨著時間變化而不同，以黑色實心表待測樣品410已到達背景信號臨界值，離光感測器500越遠的待測樣品410其大於背景信號臨界值的時間需越長，所以需使用此曝光時間隨著所述多個待測樣品距離光感測器遞增而遞增的方法，能避免不同待測樣品410起始背景信號臨界值的實驗數據上的誤差，但如果曝光時間太久，離光感測器500越近的待測樣品410其所得的灰階影像會影響整個實驗準確及一致性。最後將這四次所感測的四灰階影像再做均值濾波，藉此能得到更為精確且一致的多個待測樣品410數據。
[0034]由於前面取得背景信號臨界值的過程中，已界定出待測樣品孔的位置，因此待測灰階影像不需要二值化。只要根據待測灰階影像，找出各待測樣品孔的灰階像素數據，並與背景信號臨界值比較，便能確認各待測樣品孔內是否有螢光反應。
[0035]另外，前述的螢光信號讀取作業，除了前述方法外，還能增加下述方法。根據待測灰階影像，取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據。根據位於背景樣品孔內的灰階像素數據，判斷是否讀出光源信號，當未讀出光源信號時，判斷為異常狀況，並終止實驗。
[0036]也就是說，當所有待測樣品孔內皆無螢光反應時，便停止螢光信號讀取作業。如此實驗人員可以立刻檢查或更換樣品，以利實驗的續行。
[0037]其中取得背景灰階影像或待測灰階影像的技術，可以利用互補式金屬氧化物半導體或是電荷耦合元件等光感測器擷取。而光感測器擷取待測灰階影像的時間相異以浮動方式讓起始測量值一致，即通過預設的軟體判斷，隨著不同待測樣品的螢光強度而變化，當螢光強度遞增而其曝光時間遞減。
[0038]其中待測樣品孔上覆蓋著螢光濾鏡。由於非螢光的光線無法通過螢光濾鏡，因此能確保通過待測樣品孔的都是樣品所發射的螢光。
[0039]其中背景光源可以是發光二極體，或者是雷射光源。當要激發不同樣品發出螢光時，能選擇使用適合的色光，而不必再搭配激發光濾片(Excitation filter)加上控制馬達來替換濾片得到所需的激發波長。
[0040]值得一提的是本發明利用均值濾波其灰階影像，並使用二值化做分析樣品的技術，使用更為單純且背景信號臨界值可依據不同實驗的需求而做更動，比起已知技術還須對實驗數據圖做分析更為簡單直觀，再加上對多個待測樣品作多次相異時間擷取多個灰階影像，來整合取得多個待測樣品最準確一致的數據。
[0041]而根據本發明又一實施方式是在提供一種螢光檢測方法包含下述步驟。將樣品盛裝至一樣品盤中，其中樣品盤包含至少一列背景樣品孔，以及至少一列待測樣品孔。一定位步驟。以一背景光源照射樣品盤。取得樣品盤的一背景灰階影像。均值濾波背景灰階影像。二值化背景灰階影像。根據二值化後的背景灰階影像，計算出背景樣品孔的邊緣位置。根據背景樣品孔的邊緣位置，計算出待測樣品孔的邊緣位置。取得位於背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值。根據待測樣品孔的邊緣位置以及背景信號臨界值，對待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
[0042]依據本發明一實施方式，上述該定位步驟包含以下方式。當樣品管置放於樣品孔，樣品孔的座標可直接由樣品管內的樣品的透出光通過一分析軟體來加以定位其樣品孔座標，該透出光的分析方法不限定為影像分析或光電分析。
[0043]或者在此螢光檢測方法的實驗前通過一軟體設定好樣品孔的座標做定位。
[0044]也可在樣品管外額外加上一減光片或一偏光做樣品管的定位，利用減光片或偏光片所透射的光源通過一分析軟體來加以定位其樣品孔座標，該透出光的分析方法不限定為影像分析或光電分析。
[0045]或者通過外加至少兩光源如發光二極體來輔助定位，其光源放置在樣品孔兩側，並通過上述的分析軟體分析樣品受光照射位置並定位其座標。
[0046]雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視所附的權利要求書所界定的範圍為準。
【權利要求】
1.一種螢光檢測方法，其特徵在於，包含: 將螢光檢測試劑加入樣品中； 將樣品盛裝至一樣品盤中，其中該樣品盤包含至少一列背景樣品孔及至少一列待測樣品孔 ； 以一背景光源照射該樣品盤；以及 取得該樣品盤的一背景灰階影像。
2.根據權利要求1所述的螢光檢測方法，其特徵在於，還包含: 均值濾波該背景灰階影像； 二值化該背景灰階影像； 根據二值化後的該背景灰階影像，計算出該列背景樣品孔的邊緣位置； 根據該列背景樣品孔的邊緣位置，計算出該列待測樣品孔的邊緣位置； 取得位於該列背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值；以及 根據該列待測樣品孔的邊緣位置以及該背景信號臨界值，對該列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
3.根據權利要求2所述的螢光檢測方法，其特徵在於，對該列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟包含: 以該背景光源照射該樣品盤； 取得該樣品盤的一待測灰階影像； 均值濾波該待測灰階影像； 取得位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據； 逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於該背景信號臨界值；以及 當位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據大於該背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
4.根據權利要求2所述的螢光檢測方法，其特徵在於，取得該樣品盤的該背景灰階影像的步驟是以互補金氧式半導體或電荷耦合元件為之。
5.根據權利要求2所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
6.根據權利要求2所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該背景光源為發光二極體或雷射。
7.根據權利要求1所述的螢光檢測方法，其特徵在於，還包含: 均值濾波該背景灰階影像； 二值化該背景灰階影像； 根據二值化後的該背景灰階影像，計算出該列背景樣品孔的邊緣位置； 根據該列背景樣品孔的邊緣位置，計算出該列待測樣品孔的邊緣位置； 取得位於該列背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值；根據該列待測樣品孔的邊緣位置以及該背景信號臨界值，對該列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業； 以該背景光源照射該樣品盤；以相異曝光的時間取得該樣品盤的多個待測灰階影像； 均值濾波所述多個待測灰階影像； 取得位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據； 逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於該背景信號臨界值；以及 當位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據大於該背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
8.根據權利要求7所述的螢光檢測方法，其特徵在於，取得該樣品盤的該背景灰階影像的步驟是以互補金氧式半導體或電荷耦合元件為之。
9.根據權利要求7所述的螢光檢測方法，其特徵在於，相異曝光的時間由一軟體判斷，隨著螢光強度遞增而遞減。
10.根據權利要求7所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
11.根據權利要求7所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該背景光源為發光二極體或雷射。
12.根據權利要求1所述的螢光檢測方法，其特徵在於，還包含: 一定位步驟； 均值濾波該背景灰階影像； 二值化該背景灰階影像； 根據二值化後的該背景灰階影像，計算出該列背景樣品孔的邊緣位置； 根據該列背景樣品孔的邊緣位置，計算出該列待測樣品孔的邊緣位置； 取得位於該列背景樣品孔內的灰階像素數據，並將其平均，作為一背景信號臨界值；以及 根據該列待測樣品孔的邊緣位置以及該背景信號臨界值，對該列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業。
13.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，對該列待測樣品孔進行螢光信號讀取作業的步驟包含: 以該背景光源照射該樣品盤； 取得該樣品盤的一待測灰階影像； 均值濾波該待測灰階影像； 取得位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據； 逐個判斷位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據是否大於該背景信號臨界值；以及 當位於該列待測樣品孔內的灰階像素數據大於該背景信號臨界值時，判斷為讀出螢光信號。
14.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，取得該樣品盤的該背景灰階影像的步驟是以互補金氧式半導體或電荷耦合元件為之。
15.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該列待測樣品孔上覆蓋有一濾鏡。
16.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該背景光源為發光二極體或雷射。
17.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該定位步驟包含直接由樣品管內的樣品透出光定位。
18.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該定位步驟包含實驗前樣品孔座標定位。
19.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該定位步驟包含由樣品管加上一減光片或一偏光做樣品孔定位。
20.根據權利要求12所述的螢光檢測方法，其特徵在於，該定位步驟包含外加至少兩光源輔助定位。
【文檔編號】G01N21/64GK103472040SQ201310151570
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年4月27日 優先權日:2012年6月6日
【發明者】鄧秉華, 林清格, 陳宏銘 申請人:瑞基海洋生物科技股份有限公司