一種高通量斑點酶聯免疫陣列檢測方法

2023-12-09 06:42:31 2

專利名稱：一種高通量斑點酶聯免疫陣列檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種快速、高通量的斑點酶聯免疫陣列檢測方法，用於檢測藥物濫用， 屬於免疫分析測定領域。
背景技術：
藥物濫用一般是指違背了公認的醫療用途和社會規範而使用不當藥物，藥物濫用問 題現已成為全世界面臨的重大社會問題之一。隨著濫用藥物的使用範圍蔓延，對檢測技 術的要求也隨之增加，檢測領域也逐漸廣泛，如在軍隊、工作場所、學校、法醫學鑑定 以及興奮劑檢測等處均有涉及，而且部分檢測領域需要同時對大量人員進行篩選排查。 研究開發出靈敏、高效的檢測方法，特別是適合較大規模排査使用的高通量的檢測方法， 既是社會的需要，也對控制藥物濫用起到重要的作用。基於免疫學方法而產生的檢測法 操作簡單，易於自動化和高通量，能快速準確地給出結果，而且無需繁瑣的樣品前處理 過程，比較適合於對大量樣本進行初査和篩選，適合現場快速檢測，在進行藥物濫用領 域具備很大優勢。
另外，目前藥物濫用呈現多元化趨勢，而由於吸食藥物在體內的代謝特性和相伴雜 質的情況，我們有必要將相關因素一起考慮，從而得出精確的藥物濫用信息。例如在分 析海洛因(3， 6-二乙醯嗎啡)的濫用情況時，就需要充分了解其代謝情況。海洛因的代 謝物主要有嗎啡和6-單乙醯嗎啡(6-MAM)。其中，6-單乙醯嗎啡是海洛因的一種特異 性水解代謝物，可以在海洛因濫用者的血液、尿液或頭髮等檢材中檢測到。可待因是一 種在海洛因濫用者體內與6-單乙醯嗎啡相伴隨的雜質物，也可以作為海洛因濫用的信息。 單一的嗎啡陽性測試結果不易說明問題，無法確定濫用者是吸食了嗎啡還是海洛因。另
一方面，美沙酮經常作為一種海洛因戒毒過程的替代藥物使用，它的代謝物也可能同時 被檢測到。
目前，用於藥物濫用檢測的免疫分析技術主要有放射免疫分析、酶免疫分析、螢光 偏振免疫分析等。放射免疫分析由於其自身的放射性危害而難於普及使用。同時，螢光 偏振免疫分析等方法，由於需要藉助大型設備，不利於現場大規模檢測。酶免疫分析技 術是使用具有催化活性的生物酶作為免疫反應標誌的一種技術，是各種抗原、抗體檢測 的常規方法，適合於多種用途。酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)和後來發展起來的金標試紙檢測以其性能的優越性在毒品分析中展現出了廣闊的 應用前景。但是，傳統方法也同樣存在檢測指標單一、分析能力不足等缺陷，而且實驗結果無法長期保存，不宜長期留存備份。
斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Dot-ELISA)是 一種傳統ELISA法的修飾形式，最早見於1982年Hawkes等人研究的Dot-Immunobinding Assay,其特點為將NC膜作為固相反應界面進行免疫反應。Dot-ELISA法常用於血清學 診斷，如蛋白質、病毒的抗原抗體檢測，人類和動物的疾病診斷、感染分析等範圍。與 傳統ELISA法相比，Dot-ELISA法主要在於使用的基質材料不同。採用NC膜(或PVDF 膜)較酶標板具有一定優勢1)對蛋白質的吸附能力較強，可高效包被抗原；2)所需 待測物體積少，僅需一個斑點的範圍即可鑑定出結果，適用於微量待測物的測試情況；3) 背景為不透光的白背景，可通過如DAB顯色等化學顯色反應肉眼鑑別，無需酶標儀等分 光光度測量裝置；4)反應快速，檢測時間短等。雖然Dot-ELISA方法不適合定量化檢測， 但在進行定性檢測方面較之傳統ELISA方法有其特有的優勢。

發明內容
本發明採用在同一膜片上點入不同的藥物抗原，通過多種藥物的混合抗體進行高通 量篩選，以補充現有藥物濫用檢測技術，為實現快速現場檢測，提供一種高效便捷的藥 物檢測方法。此方法可應用到實際檢測中去，現場對大量樣品進行定性分析，找出多種 分析物的濫用情況。
本方法的特徵在於，將膜相材質製成適當大小的膜片，根據實際檢測需要排布膜相 陣列，粘覆於固體支持物上，每份膜片上分區點入1微升的不同待測藥物抗原，待其充 分結合後，向膜片上加入封閉液(2%牛血清白蛋白)，進行孵育；在這個過程中將待測 藥物的混合抗體與待檢物(尿樣、血樣等)預反應一段時間；衝掉封閉液，向膜片上加 入預反應的上述混合物(一張膜片對應一種待檢物)，再次進行孵育；用PBST清洗測試 板；再向膜面加入酶標第二抗體工作液，進行孵育；用PBST重複清洗，最後使用化學 顯色試劑(作為酶的底物)顯示結果，可通過肉眼辨別測試結果。
膜相材質使用的是NC膜(硝酸纖維素膜)或PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)，膜面吸附 蛋白的能力強，NC膜無需預處理即可高效吸附，PVDF膜經甲醇活化後的吸附能力也很 強，使抗原物質包被充分。
膜片經切割製成，直徑介於5mm到100mm之間。
加入被測試樣品後,通過膜上的特異性抗原-抗體反應和酶標記的第二抗體進行檢測。 選擇可以呈現出顏色反應的底物(如二氨基聯苯胺，DAB)或化學發光的底物(如魯米 諾試劑)，顯色或曝光後直接通過肉眼辨別。定性判斷藥物的濫用為通過觀察膜上斑點的 有無鑑定出測試結果的陰、陽性，即體液中待測藥物及其代謝物的存在與否。通過競爭抑制法，測試結果顯示出有斑點的情況為陰性結果，無斑點的為陽性結果。 本方法與傳統檢測試劑盒的單人份測定方式相比，有如下優點
1、使用微量移液器在每份膜片上分區點上不同樣品，同時由於每份膜片面積很小， 將多張膜片固定於單塊固體支持物上形成陣列的方式，大大提高檢測通量，縮短檢測時 間。無論在檢測項目或者檢測量上均具有的高通量分析的特點，表現出此免疫檢測陣列 更經濟，從而可進行大批量人員測試樣品的篩選。
2、 膜相具有白色背景，同時膜板結果可以保存較長時間，方便進行日後數據的調取 與比較。
3、 有效解決了目前對於藥物濫用的測試通常一次只能針對一種藥物，對於大規模人 群以及濫用者可能在一段時間內同時吸食幾種藥物而言，進行多種藥物的排查工作費時 費力，更需要大量檢測用品的問題。
4、 通過多種藥物的混合抗體進行高通量篩選。不僅可對測試樣品多種非相關性分析 物測試，還可對一組關係緊密的分析物進行測試比較，從而挖掘複雜數據間的具體信息。


圖1為本斑點酶聯免疫陣列檢測法通過競爭抑制原理對戒毒所病人尿樣的實際檢測 結果。
具體實施例方式
對44例戒毒所病人尿樣同時進行4種藥物濫用篩選，實現高通量(多藥多尿)檢測。 隨著毒品藥品濫用範圍的蔓延，濫用者可能會同時吸食幾種藥物，使得以往的逐個 逐項排查費時費力。因此研究開發出能同時檢測多種指標的新技術、新方法並應用於實 際的査毒過程十分必要。
測試前需通過藥物標準物質對抗原、抗體的工作濃度及檢測限進行標準化，找到最 優的測試條件。實驗具體操作步驟同前描述1)將打孔器裁剪的NC膜圓片粘覆在塑料 板上；2)用微量移液器點上四種待測藥物抗原(藥物-BSA); 3)用2^BSA封閉膜片1 小時；4)孵育抗四種藥物的混合抗體與待測尿樣的混合液(1: l混合)l小時，終濃度 為各抗體的工作濃度；5)孵育HRP標記的第二抗體30分鐘；6) DAB顯色(用PBST 洗滌步驟省略)。
實例是對四種常見毒品進行的測試，分別為嗎啡、美沙酮、甲基苯丙胺和巴比妥。 如圖1所示，在一張板上放置48個膜片， 一張膜片對應一個待測尿樣。其中前五排及第 六排的前四個膜片為1-44的44例尿樣的測試結果；最後四個膜片依次為陰性尿樣對照、 陰性對照(磷酸鹽緩衝液)、陽性對照和空白對照。每個膜片上的四個點依次對應所檢測的四種常見毒品左上角為嗎啡，右上角為甲基苯丙胺，左下角為美沙酮，右下角為巴 比妥。由於測試小分子藥物採用的是競爭性抑制原理，所以觀察到的結果為陰性結果有 斑點，陽性結果無斑點。所測試的44種尿樣基本上為嗎啡陽性或甲基苯丙胺陽性，也有 雙陽性的情況，還有一例樣品檢出為雙陰性；結果中沒有美沙酮或巴比妥陽性的情況。 由於所有尿樣都是經過商品化金標記試紙條測試過的，其結果可作為此方法的驗證對照。 驗證結果表明，Dot-ELISA檢測板的測試結果和商品化試紙條是一致的，從而確定了此 方法的實用性。
權利要求
1、一種高通量斑點酶聯免疫陣列檢測方法，其特徵在於，將膜相材質製成適當大小的膜片，根據實際檢測需要排布膜相陣列，粘覆於固體支持物上，每份膜片上分區點入1微升的不同待測藥物抗原，待其充分結合後，向膜片上加入封閉液，進行孵育；衝掉封閉液，向膜片上加入預反應的待測藥物的混合抗體與待檢物混合物，一張膜片對應一種待檢物，再次進行孵育；用PBST清洗測試板；再向膜面加入酶標第二抗體工作液，進行孵育；用PBST重複清洗，最後使用化學顯色試劑顯示結果。
2、 如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，膜相材質使用的是硝酸纖維素膜或 聚偏氟乙烯膜。
3、 如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，膜片經切割製成，直徑介於5mm 到100mm之間。
全文摘要
一種高通量斑點酶聯免疫陣列檢測方法，用於檢測藥物濫用，屬於免疫分析測定領域。本方法將膜相材質製成適當大小的膜片，根據實際檢測需要排布膜相陣列，粘覆於固體支持物上，在同一膜片上點入不同的藥物抗原，通過多種藥物的混合抗體進行高通量篩選。與傳統檢測試劑盒的單人份測定方式相比，本方法不僅可對測試樣品多種非相關性分析物測試，還可對一組關係緊密的分析物進行測試比較，從而挖掘複雜數據間的具體信息，有效解決了目前對於藥物濫用的測試通常一次只能針對一種藥物，而對於大規模人群以及濫用者可能在一段時間內同時吸食幾種藥物，進行多種藥物排查時費時費力和需要大量檢測用品的問題。
文檔編號G01N33/551GK101603963SQ200910085580
公開日2009年12月16日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者李傳寶, 杜宏武, 爽 王, 金海明 申請人:北京科技大學