硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法

2023-12-08 20:45:06

專利名稱：硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層技術製作的一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法。
背景技術：
硝基呋喃類藥物為一種光譜抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被廣泛應用於飼料添加劑和治療藥物，用於預防和治療由沙門氏菌和埃希氏桿菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。他們對人類健康有惡性影響，有致癌性。歐盟出於食品安全的考慮，在96/23/EC法規中將硝基呋喃類抗生素列為A類禁用藥，決定從1997年I月I日起，禁止在動物飼料中添加任何硝基呋喃類抗生素。我國也於2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。歐盟委員會於2003年通過了 2003/181/EC委員會決議，建立了用於檢測禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物的代謝物的各種方法的最小要求性能限值為Iu g/kg。目前，歐盟、美國及其他國家都對進口動物性食品中硝基呋喃類抗生素殘留做了非常嚴格的限制，要求4種硝基呋喃代謝物殘留不得超過 I ii g/kg。為了人和動物的安全很有必要對水源和食品(如肉)進行抗生素殘留檢測。硝基呋喃類藥物本身的檢測很難，因為在食入這些藥物後會很快地發生代謝。這些代謝產物會在組織中存在很長時間。AOZ是呋喃唑酮代謝物、AMOZ是呋喃它酮的代謝物、SEM是呋喃西林代謝物、AHD是呋喃妥因代謝物。因此，可以通過檢測食品中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物以判定食品對人體的安全性。目前，檢測硝基呋喃類藥物代謝物的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)、酶聯免疫分析法(ELISA)。這些方法靈敏度高，結果準確，但是具有需要昂貴的儀器，檢測繁瑣、費時，檢測人員需要一定的專業培訓等缺點。本發明採用膠體金免疫層析技術製備了一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒。本發明具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、無需複雜儀器等特點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種簡單、快捷、靈敏度高、成本低的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法。硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒由呋喃唑酮代謝物檢測試紙條、呋喃它酮的代謝物檢測試紙條、呋喃西林代謝物檢測試紙條、呋喃妥因代謝物檢測試紙條組裝而成，每種試劑條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白，質控線(c線)上包被了羊抗鼠IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。偶聯硝基呋喃類藥物代謝物的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)o本發明採用納米膠體金技術及抗原抗體特異性反應，應用免疫競爭抑制反應的原理製備而成，通過待檢樣本中可能含有的硝基呋喃類藥物代謝物與硝酸纖維素膜上檢測線(T線)包被的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白競爭結合膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物抗體的反應，使T線顯現肉眼可見紅色條帶用於判定待檢樣本中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物。本發明提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟(I)製備硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白
硝基呋喃類藥物是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯後才能具有免疫原性。因此採用活性酯法將硝基呋喃類藥物代謝物半抗原與載體蛋白偶聯得到硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白作為免疫原和包被原。其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。(2)製備硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體採用硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白作為免疫原免疫BALB/C小鼠，製備硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體。(3)製備膠體金取0. 01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液，繼續煮沸約5min,出現橙紅色。這樣製成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。(4)製備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至8. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體，使硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體的濃度為10-40 ii g/ml膠體金，混合均勻後，室溫放置30分鐘；然後加入10% BSA溶液，使BSA溶液的濃度為10-30 u I/ml膠體金，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液於12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩餘的沉澱用3070%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體膠體金標記物；將硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體-膠體金標記物按15-30 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C乾燥箱乾燥2. 5-3小時，製成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含0. 30% 1^8，5%蔗糖，0. 50% PVP,0. 30% Casein-Na, pH值8. 0-9.0的溶液。(5)包被硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白、羊抗鼠IgG抗體 將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm ；將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置乾燥箱設置451，乾燥1-1.5小時。其中，T線包被液為0. 8-4. Omg/ml的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白；C線包被液為0. 6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG抗體。
(6)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡於0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩衝溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩衝溶液中含0. 5-1. 5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，於烘乾箱中38°C烘乾，保存，備用(7)組裝試劑盒取上述製備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然後膠體金墊貼於PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼於膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開切條機，按產品要求設置裁切寬度，將上述組裝好的PVC板放於切條機上，按設置寬度進行切條，得到所述用於檢測硝基呋喃類藥物代謝物的試紙條；試紙條裝入塑料卡內，組裝成試劑盒。本發明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，5-10分鐘時觀察並記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果；或將硝基呋喃類藥物代謝物檢測試紙條樣品墊末端浸入被測樣品溶液中約10秒鐘後，水平放置；5-10分鐘時觀察並記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。本發明所述的試劑盒採用膠體金免疫層析技術測定硝基呋喃類藥物代謝物，檢測樣品時，因毛細作用樣品溶液的沿試紙條向吸樣墊一端層析，若被測樣品中含有硝基呋喃類藥物代謝物，它們將和檢測線(T線)上包被的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白競爭結合膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體上有限的抗體結合位點，當樣品中的硝基呋喃類藥物代謝物達到一定濃度時，與膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體發生免疫反應並完全飽和，此時膠體金複合物已無空餘的位點和檢測線上包被的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白結合，此時T線不顯色，此為陽性結果；若被測樣品中不含硝基呋喃類藥物代謝物，標記了硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置後，與T線上包被的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白發生免疫結合反應，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現出一條肉眼可見的紅色條帶，此為陰性結果。無論被測樣品中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物，膠體金標記物均會與C線包被的羊抗鼠IgG反應形成一條肉眼可見的紅色條帶，C線顯色與否，是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。


圖I硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒示意圖；圖2硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒內試紙條的結構示意圖；附圖符號說明I :樣品墊；2 :膠體金墊(膠體金標記硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體的聚酯膜)3 :硝酸纖維素膜(T :包被了硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白的檢測線；C :包被了羊抗鼠IgG抗體的質控線);4 :吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖3本發明試劑盒的檢測結果示意圖。、
自左至右依次為C線一條線陽性檢測結果；T、C兩條線陰性檢測結果；無效。實施例I :硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒的製備I.製備硝基呋喃類藥物代謝物偶聯BSA採用活性酯法分別將AOZ、AMOZ, SEM及AHD半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到AOZ-BSA偶聯物、AMOZ-BSA偶聯物、SEM-BSA偶聯物及AHD-BSA偶聯物作為免疫原和包被原。2.製備硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體AOZ-BSA偶聯物作為免疫原免疫BALB/C小鼠，製備AOZ單克隆抗體；AM0Z_BSA偶聯物作為免疫原免疫BALB/C小鼠，製備AMOZ單克隆抗體；SEM_BSA偶聯物作為免疫原免疫BALB/C小鼠，製備SEM單克隆抗體;AHD_BSA偶聯物作為免疫原免疫BALB/C小鼠，製備AHD-單克隆抗體。。3.製備膠體金取0. 01 %的氯金酸水溶液IOOmL,加熱煮沸。根據需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液0. 75mL,繼續煮沸約5min,出現橙紅色。這樣製成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。4.製備膠體金墊取4個IOml的離心管，分別編號1、2、3、4，於4個離心管中分別加入5ml顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2C03將膠體金溶液的pH值調至9. 0，室溫放置30分鐘；於I號離心管中加入濃度為3. 8mg/ml的AOZ單克隆抗體39. 5iil ;於2號離心管中加入濃度為3. 5mg/ml的AMOZ單克隆抗體40 yl ;於3號離心管中加入濃度為4. Omg/ml的SEM單克隆抗體37. 5 yl，於4號離心管中加入濃度為3. 8mg/ml的AHD單克隆抗體39. 5 yl ;分別混合均勻後，室溫放置30分鐘；然後於1-4號離心管中均加入100 ill的10% BSA溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液於12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩餘的沉澱均用2. 5ml的膠體金復溶液溶解，得到AOZ單克隆抗體-膠體金標記物、AMOZ單克隆抗體-膠體金標記物、SEM單克隆抗體-膠體金標記物及AHD單克隆抗體-膠體金標記物。將上述四種膠體金標記物分別按20 yl/cm2的比例均勻的鋪在4個聚酯膜上，放入45°C乾燥箱乾燥3小時，製成膠體金墊。
上述膠體金復溶液為含0. 30% 1'1^8，5%蔗糖，0. 50% PVP,0. 30% Casein-Na, pH值9.0的溶液。5.包被硝基呋喃類藥物代謝物偶聯BSA、羊抗鼠IgG抗體 將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm ；將貼好的PVC板放在劃膜儀上，分別以T線包被液為AOZ-BSA偶聯物、AMOZ-BSA偶聯物、SEM-BSA偶聯物及AHD-BSA偶聯物，C線包被液為羊抗鼠IgG抗體在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置乾燥箱設置45°C，乾燥I. 5小時。其中，T線包被液AOZ-BSA偶聯物濃度為2. Omg/ml、AMOZ-BSA偶聯物濃度為
I.Omg/ml、SEM-BSA偶聯物濃度為I. 6mg/ml、AHD-BSA偶聯物濃度為2. 5mg/ml ；C線包被液羊抗鼠IgG抗體濃度為I. Omg/ml o6.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡於0. OlM pH 8. 0的磷酸鹽緩衝溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩衝溶液中含I. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-20，於烘乾箱中38°C烘乾，保存，備用
7.組裝試劑盒取上述製備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然後將AOZ單克隆抗體-膠體金標記物製備的膠體金墊貼於T線包被液為AOZ-BSA偶聯物的PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5mm，樣品墊貼於膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm ;打開切條機，設置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放於切條機上，按設置寬度進行切條，得到呋喃唑酮代謝物檢測試紙條。將AMOZ單克隆抗體-膠體金標記物製備的膠體金墊貼於T線包被液為AMOZ-BSA偶聯物的PVC板上NC膜的靠近T線端壓NC膜1-1. 5mm，樣品墊貼於膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm ;打開切條機，設置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放於切條機上，按設置寬度進行切條，得到呋喃它酮的代謝物檢測試紙條。將SEM單克隆抗體-膠體金標記物製備的膠體金墊貼於T線包被液為SEM-BSA偶 聯物的PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5mm，樣品墊貼於膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm ;打開切條機，設置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放於切條機上，按設置寬度進行切條，得到呋喃西林代謝物檢測試紙條。將AHD單克隆抗體-膠體金標記物製備的膠體金墊貼於T線包被液為AHD-BSA偶聯物的PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5mm，樣品墊貼於膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm ;打開切條機，設置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放於切條機上，按設置寬度進行切條，得到呋喃妥因代謝物檢測試紙條。將上述製備好的4種試紙條按順序組裝到塑料卡中，製備成硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒。實施例2 :硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒的檢測I.樣品的處理取Ig組織樣品組織樣品搗碎後，加入5ml蒸餾水，IM的HCl 0. 5ml和0. OlM的苯甲醛(乙醇溶液)100 ill，充分振蕩，置於38°C過夜。然後加入0. IM的K2HPO4 5ml，IM的NaOH 0. 4ml以及5ml的乙酸乙酯，劇烈振蕩30秒。室溫下4000rpm離心10分鐘，然後取2.5ml乙酸乙酯上清液轉移到新容器中。在45°C下用氮氣將其吹乾，然後用正己烷重新溶解後與 Iml 的 0. OlM PBST (pH 7. 4,0. 05% Tween-20)混勻。室溫下 4000rpm 離心 10 分鐘，最後取底部水相測定。2.檢測方法取出硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘後觀察並記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。3.結果判定陽性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽性結果；陰性T線、C線均顯色，判定為陰性結果；無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經變質損壞。
權利要求
1.一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於由呋喃唑酮代謝物檢測試紙條、呋喃它酮的代謝物檢測試紙條、呋喃西林代謝物檢測試紙條、呋喃妥因代謝物檢測試紙條組裝而成。
2.—種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所包含的試紙條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白，質控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。
3.—種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所述的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白為硝基呋喃類藥物代謝物偶聯牛血清白蛋白或卵清白蛋白；所述的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體由硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白作為免疫原免疫BALB/C小鼠獲得。
4.一種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下製成大小為20-40nm的膠體金顆粒。
5.一種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所述的膠體金墊的製備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至8. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體，使硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體的濃度為10-40 ii g/ml膠體金，混合均勻後，室溫放置30分鐘；然後加入10% BSA溶液，使BSA溶液的濃度為10-30 u I/ml膠體金，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液於12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩餘的沉澱用30-70%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體-膠體金標記物；將硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體-膠體金標記物按15-30 u 1/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C乾燥箱乾燥2. 5-3小時，製成膠體金墊。
6.一種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所述的膠體金復溶液為含0. 30% Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na, pH值8. 0-9. 0的溶液。
7.—種權利要求I所述的硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒及其製備方法，其特徵在於所述的硝酸纖維素膜上T、C線的包被方法為將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 y 1/cm,T線I. 0 ii 1/cm ;將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置乾燥箱設置45°C，乾燥1-1. 5小時。其中，T線包被液為0. 8-4. Omg/ml的硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白；C線包被液為0. 6-2. Omg/ml的羊抗鼠IgG抗體。
全文摘要
本發明提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物檢測試劑盒，試劑盒由呋喃唑酮代謝物檢測試紙條、呋喃它酮的代謝物檢測試紙條、呋喃西林代謝物檢測試紙條、呋喃妥因代謝物檢測試紙條組裝而成，試紙條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，其中膠體金墊為膠體金標記的硝基呋喃類藥物代謝物單克隆抗體聚酯膜，硝酸纖維素膜上依次包被了硝基呋喃類藥物代謝物偶聯載體蛋白作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG抗體作為質控線(C線)。本發明採用納米膠體金技術及抗原抗體特異性反應，應用免疫競爭抑制反應的原理製備而成，用於檢測樣品中是否含有硝基呋喃類藥物代謝物。
文檔編號G01N33/577GK102759622SQ20111010847
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優先權日2011年4月28日
發明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請人:寶瑞源生物技術(北京)有限公司