下調gdf－8活性的方法

2023-12-09 09:20:46 3

專利名稱：下調gdf－8活性的方法
技術領域：
本發明主要涉及動物和禽類的養殖以及人類醫藥領域。特別是，本發明致力於改善調控和增加肌肉的生長，尤其是肉食飼養動物。因此，本發明提供了增加肉食動物肌肉生長的新方法和新手段。
背景技術：
目前，有兩種不同的醫療手段用於提高飼養動物的生長速度一方面是給飼養動物使用抗生素或抗生素類化合物；另一方面是給予生長激素。
給飼養動物(尤其是豬)使用抗生素和抗生素類的化合物以促進其生長的方法近年來已引起了許多問題。這些化合物中有一些在化學結構上與治療人類疾病所用的抗生素密切相關，已有越來越多的證據表明，飼養動物大量應用此類化合物會引起人類致病微生物對人用抗生素的交叉抗藥性。而且，使用這些化合物只能取得約1-3％的相對較低的生長率提高。
飼養動物給予生長激素是非常昂貴的，由於生長激素的半衰期相對較短，因此必須在相當短的間期內重複使用這些激素。而且，由於經過該處理得到的動物肉中殘留一定的生長激素，所以引起了歐洲的消費者的特別關注。GDF-8GDF-8，或稱氯化筒箭毒鹼是1997年5月發現的，作為一種選擇性下調平滑肌生長的生長調節因子(McPherron等，Nature，387，83-90，1997)。GDF-8的表達僅限於發育期胚胎體節的肌節腔隙，但在成年動物全身許多肌肉組織中也有表達。
GDF-8敲除小鼠表現平滑肌重量顯著增加，平滑肌重量的增加廣泛存在於機體各部分，從GDF-8陰性小鼠分離的肌肉重量比野生型小鼠的肌肉重約2-3倍還多。基因敲除小鼠的總體重比野生型小鼠約高35％，而缺乏GDF-8基因小鼠的肌纖維含量比正常小鼠高80％還多。然而，在基因敲除小鼠體內觀察到的平滑肌重量明顯增加不僅僅是因為其肌纖維數量的增多，還與其肌纖維明顯肥大有關。GDF-8敲除小鼠的橫切面肌肉麵積按照肌肉類型的不同增加了約14-49％。
有趣的是，與成年非轉基因鼠比較，成年轉基因鼠的肌肉重量增加速率更快。而且，所有GDF-8陰性小鼠均可存活且能生育。
1997年11月，首次發現GDF-8的作者又發表了兩種比利時藍及皮埃蒙特牛，具有肌肉重量增加的顯著特徵，而其GDF-8編碼序列是突變的，這正是它們肌肉增強的原因(McPherron及Se-Jin Lee，1997，PNAS 94，12457-12461)。這種「雙重肌肉」(「double muscling」)的現象在過去190年中的許多頭牛身上都發現過，這些動物的肌肉重量平均增加20-25％，其餵養效率也明顯增加，但仍然產生高質量的牛肉。
然而與GDF-8敲除小鼠不同，比利時藍牛的大多數其它器官的重量也減輕。這種「敲除牛」同樣也有雌性生育能力降低，後代存活率降低以及性成熟延遲的問題。
「敲除牛」肌肉重量相對增加並不象在基因敲除小鼠身上觀察到的那樣明顯，實際上，它與在小鼠身上觀察到的肌肉肥大的程度相關。McPherron等推測一種解釋可能是正常牛在經過選擇飼養生育之後可能比鼠更接近於肌肉體積的上限(同樣也更接近於肌纖維數目的上限)。並沒有作者發表關於牛類肌纖維增生與肥大數量關係的資料，但基於這個假設以及在基因敲除小鼠身上觀察到的肌肉肥大，在諸如比利時藍牛身上觀察到的肌肉重量及生長速率的提高很大程度上歸因於肌肉肥大，而不是肌肉增生。GDF-8的生理功能GDF-8的表達高度局限於骨骼肌。有脂肪組織中也有低水平表達，但值得注意的是在心肌中沒有表達。在成年個體中GDF-8的生理功能仍不清楚，儘管看起來GDF-8可能作為骨骼肌生長的特異負調節因子在起作用。關於其生理功能的推測大都集中於其在誘導肌肉肥大的訓練或在肌肉損傷後的再生中的重要作用。然而GDF-8也可能抑制脂肪組織的生長。至於GDF-8在動物生長過程中是局部還是全身性起作用仍不清楚。GDF-8的結構GDF-8屬於轉化生長因子β(TGF-β)超家族，該家族包括一系列與胚胎發育有關的結構相關的蛋白。人及牛的GDF-8以長約375個胺基酸的前體蛋白形式存在。正如其他TGF-β超家族蛋白一樣，GDF-8可能需經過蛋白水解產生一更短的約109個胺基酸的C末端片段，並由二硫鍵連接形成同源二聚體。該同源二聚體可能是GDF-8的生理活性形式。
小鼠、大鼠、人、狒狒、牛、豬、綿羊、雞及火雞GDF-8的胺基酸序列是已知的，而且GDF-8分子是高度保守的(McPherron及Se-JinLee，PNAS，94，12457-12461，1997)。小鼠、大鼠、人、豬、雞及火雞GDF-8的序列在C-末端區域是100％相同的，這個區域可能包含GDF-8的生理活性功能域。牛及綿羊的GDF-8與人的GDF-8在C-末端區域內僅有兩個胺基酸殘基不同。牛GDF-8在356-357位的序列為-Glu-Gly-，而不是-Lys-Glu-，而綿羊GDF-8則有兩處保守的替代(在316位有一個Val，在333位有一個Arg，而不是Leu及Lys)。所有已知的GDF-8蛋白在它們的活性C-末端區域都不含有潛在的N-糖基化位點。
本發明目的本發明的一個目的是提供一種重組治療疫苗，它能夠有效下調生長分化因子8(GDF-8)(也稱作氯化筒箭毒鹼myostatin)以增加飼養動物的肌肉生長率。另一個目的是提供一種免疫動物的方法以提高其肌肉生長速率。另外提供GDF-8的變異體也是一個目的，它能糾正抗自體GDF-8的自身耐受性。本發明的再一個目的是提供核酸片段，載體以及轉化細胞，它們均可用於製備疫苗及GDF-8變異體。發明概要鑑於以上關於轉基因GDF-8敲除動物及比利時藍以及皮埃蒙特牛所述的發現，本發明的發明者建立了如下理論在動物中通過誘導一有效的高度協調的抗GDF-8的免疫應答以下調GDF-8活性是可能的。因此，本發明提供了一種最基本的方法和手段，它可以從免疫學角度下調GDF-8的活性，有效增加動物肌肉的重量。本方法與其它已知的促進飼養動物生長的方法相比有如下優點。首先，當使用本方法時，避免了微生物病原體的交叉耐受。其次，本方法處理的動物的肉中將不會殘留外源給予的生長激素。最後，通過動物出生後(即僅在成熟個體)才下調其GDF-8水平，完全避免了餵養及生產諸如比利時藍及皮埃蒙特牛(許多牛藉助於剖腹產手術出生，且伴隨其它器官體積減小)的倫理學問題。——實際上，肌肉重量增加的動物根本不必繁殖後代，因此本措施可以用於那些以肉食為目的的動物。
由於肌纖維的數量及類型在胚胎時期就已經確定了，所以一種抗GDF-8疫苗似乎不太可能增加成年飼養動物體內的肌纖維數量。因此抗GDF-8疫苗可以將GDF-8抑制至與GDF-8敲除動物一樣的水平是極不肯定也不太可能的。這可能也不是我們所希望的，因為它有可能對肉的質量，飼養性能以及脂肪比例有負面影響。然而，由於注射疫苗後使動物出生以後肌肉肥大，使其生長速度和/或最大體重增加5-25％(一個看起來很有可能的數字範圍)在牛、豬及家禽的肉類生產中仍是值得關注的。
GDF-8與其它TGF-β家族成員在胺基酸水平上的序列一致性僅佔30-40％。這種較低的序列一致性將不會產生針對GDF-8誘導的抗體的交叉反應問題。
因此，就其本身最廣泛及最普遍的範圍而言，本發明涉及一種在動物，包括人類，體內下調生長分化因子8(GDF-8)活性的方法，該方法包括影響提呈至動物免疫系統的，免疫學水平上有效用量的-至少一種GDF-8多肽或其亞序列(subsequence)，已經被製成製劑，使用該GDF-8多肽或其亞序列(subsequence)免疫動物誘導產生抗GDF-8多肽的抗體，和/或-至少一種GDF-8類似物，其中在GDF-8胺基酸序列的至少一處修飾插入結果，導致用該類似物免疫動物時可以誘導抗GDF-8多肽的抗體產生。
依據本發明可以預計每年給動物注射1-4次免疫源性組合物將足以產生預期的效果，而應用生長激素和抗生素的動物則需要更多的使用次數。
本發明還涉及GDF-8類似物以及編碼一系列這樣的序列的核酸片段。包含類似物或核酸片段的免疫源性組合物也是本發明的一部分。
本發明還涉及一種識別免疫源上有效的GDF-8類似物的方法，以及製備含有GDF-8類似物組合物的方法。
圖表說明


圖1GDF-8來源的自身免疫構建模型。深灰色的伸展分別是將用P2及P30發生替代的部分。
AP2表位插入的單體構建。「1」指P2替代了GDF-8的C-末端109個胺基酸片段的18-32位胺基酸殘基，「2」指P2替代了GDF-8的C末端109個胺基酸片段的52-66位胺基酸殘基，「3」指P2替代了GDF-8的C-末端109個胺基酸片段的83-97位胺基酸殘基。
BP30表位插入的單體構建。「1」指P30替代了GDF-8的C-末端109個胺基酸片段的第21-41位胺基酸殘基；「2」指P30替代了GDF-8的C-末端109個胺基酸片段的第49-69位胺基酸殘基；「3」指P30替代了GDF-8的C-末端109個胺基酸片段的第79-99位或第84-104位胺基酸殘基。
CP2及P30替代進入GDF-8的C-末端160個胺基酸片段的延伸單體構建。
D兩個GDF-8的C-末端109片段之間的P2及P30表位序列連接的二聚體構建。
圖2TGF-β蛋白的預計三維結構。該模型基於TGF-β蛋白的一個類似的結構域(TGJ-1)。β-片層用箭頭表示，螺旋用圓柱體表示。
發明的詳述定義接下來，為了明確該發明的公認範圍，我們對本說明書和權利要求中使用的一些術語給予了詳細的定義與解釋。術語「T-淋巴細胞」和「T-細胞」對那些胸腺來源的淋巴細胞來說是可以互換使用的概念，這些淋巴細胞負責許多細胞介導的免疫反應，在體液免疫反應中起輔助作用。同樣地，術語「B-淋巴細胞」和「B-細胞」對生成抗體的淋巴細胞來說是可以互換使用的。
這裡的「GDF-8多肽」是指具有上述來源於許多動物的GDF-8蛋白的胺基酸序列(或其與完整GDF-8具有相同數量B細胞表位的縮短物)的多肽，該術語還包括與其他物種分離出的這兩種蛋白的外源類似物相同胺基酸順序的多肽。通常情況下，使用這個術語時是指其生物活性形式，例如，人類的C-末端肽具有109個胺基酸長度。原核系統製備的非糖基化形式的GDF-8也在本術語的範圍之內，如由於使用酵母或其他非哺乳動物真核表達系統所產生的可變的O-糖基化的形式。然而，值得注意的是，當我們使用「一個GDF-8多肽」這一術語時，是指它通常對所要處理的動物是非免疫原性的。換句話說，GDF-8多肽是自身蛋白，或者是在一般情況下不會引起對GDF-8多肽產生免疫反應的自身蛋白的一種外源類似物。
一個「GDF-8類似物」是指一級結構已經發生改變的GDF-8多肽。這種改變可能例如，是以GDF-8多肽與合適的融合配體作用的融合形式(例如，一級結構上的一個改變，不包括C-末端和/或N-末端附加的胺基酸殘基)和/或可能是在GDF-8多肽胺基酸序列中插入和/或缺失和/或替代的形式。術語「GDF-8類似物」還包括衍生的GDF-8分子，見下面對GDF-8修飾的討論。
應該注意的是，人GDF-8的犬科類似物作為疫苗在人類使用時能夠對GDF-8產生預期的免疫。這類外源類似物用作免疫反應也被認為是上述定義的「GDF-8類似物」的一種。
術語「多肽」在本文中不但指2～10個胺基酸殘基的小肽、11～100個胺基酸殘基的寡肽，還包括超過100個胺基酸殘基的多肽。甚至也包括蛋白質，例如至少包括一個多肽的功能生物分子；至少有兩個多肽組成的複合物，它們之間既可共價連接又可非共價連接。蛋白質中的多肽可以是糖基化和/或脂化和/或包括輔基。
術語「亞序列」(subsequence)表示任何至少三個胺基酸的連續片段或，相對應的，至少三個核苷酸，分別直接來源於天然存在的GDF-8胺基酸序列或核苷酸序列。
術語「動物」在本文中通常指一個動物物種(優選哺乳動物)，如人類、家犬等，並不指單個動物。然而，該術語也指這樣一個動物品種的群體，因為根據本發明方法被免疫的個體實際上全部包含相同的GDF-8，使動物被相同的免疫原免疫是很重要的。例如，如果另外一個群體GDF-8發生遺傳變異，為了打破這些群體對GDF-8的自身耐受性，在這些群體中就必須使用不同的免疫原。對於本領域技術人員來說，能夠很清楚認識到在本文上下文中一個動物就是一個有免疫系統的生物。尤其是指脊椎動物，如哺乳動物。
至於「體內GDF-8活性下調」這個術語，在這裡是指生物體中GDF-8和它的受體之間(或者GDF-8和該分子的其它可能的重要生物結合配體之間)相互作用的數目下降。下調通過幾種機制實現所有機制中最簡單的就是通過抗體結合簡單幹擾GDF-8的活性位點。但是，抗體結合導致清除細胞(如巨噬細胞和其它吞噬細胞)清除GDF-8也在本發明的範圍之內。
「影響提呈……給免疫系統」的表述意指動物的免疫系統通過可控制的方式被一種免疫原刺激。像下面的公開材料中出現的，這種免疫系統的刺激可受到多種方式影響，最重要的是用多肽「藥物疫苗」(如用於治療或減輕所患疾病的疫苗)或核酸「藥物疫苗」進行接種。取得的重要成果是，動物中的合適免疫細胞以免疫學有效的方式接受抗原，而取得這樣成果的精確模式與本發明中的創造性的方法相比就不那麼重要了。
名詞「免疫有效量」在本領域中有其通用意義，如，一定數量的免疫原能夠誘導一種免疫反應，能夠和與免疫原有共同免疫學特徵的病原體發生顯著的反應。
當使用GDF-8被「修飾」的表達時，這裡意味著對構成GDF-8骨架的多肽進行化學修飾，這種修飾可以是GDF-8序列上這類胺基酸殘基的衍生作用(如烷化作用、醯化作用、酯化等)，但是就如下面的公開的內容所提出的，優選的修飾包括GDF-8胺基酸序列一級結構的改變(或添加)，例如，那些通過改變一級結構產生GDF-8類似物的修飾作用。
討論「GDF-8的自身耐受」時應該將其理解為因為GDF-8在將被接種的人群中是一種自身蛋白，正常的個體不會增加對GDF-8的免疫反應性；儘管不能排除偶爾動物種群中某些個體能夠產生天然GDF-8的抗體，如自身免疫紊亂的一部分。無論如何，一種動物通常只對自身的GDF-8產生自身耐受，但是也不能排除所述動物對其它物種來源的或具有不同GDF-8表型的該物種另一群體來源的GDF-8類似物的耐受情況。
「外源T細胞表位」(或者「外源T淋巴細胞表位」)是指能與MHC分子結合的肽，刺激動物種屬的T細胞。該發明優選的外源T-細胞表位是「隨意性」表位，例如，在一種動物種群中能夠和特定類型MHC分子的實質片段結合的表位。只有非常有限的幾個這樣的表位被認識並將在下面詳細討論。應該注意的是，為了使根據本發明使用的免疫原在儘可能大的動物群中有效，有必要1)在相同的GDF-8類似物中插入幾個外源性T細胞表位或者2)準備幾種GDF-8類似物，其中每一種類似物有一種不同的隨意性表位插入。還應該注意的是，外源性T細胞表位的概念也包括隱蔽性T細胞表位，例如，來源於自身蛋白的表位和當以分離形式而不是作為問題中自身蛋白的一部分存在時，才發揮免疫原行為的表位。
一種「外源T輔助淋巴細胞表位」(一種外源TH表位)是能結合MHC II分子，並且能被提呈在抗原提呈細胞(APC)表面與MHC II分子結合的外源T細胞表位。
一個生物分子「功能部分」在本上下文中意指能夠負責整個分子的至少一種生化或生理功能的部分。眾所周知，許多酶和其它效應分子都有一個活性位點來負責執行該分子的功能。分子的其它部分起穩定或者提高溶解性的作用，因此，如果這些作用與本發明的具體實例不相關的話，那麼這些部分就可以略去。例如，在GDF-8分子中利用一些特定的其他細胞因子作為一種修飾部分是可能的(詳述如下)，並且在這樣一個實例中，穩定性問題就可以說是不相關的，因為和GDF-8的偶聯已提供了穩定性。
術語「佐劑」在疫苗技術領域中有其通用意義，例如，一種物質或一種組合物1)本身不能對疫苗中的免疫原產生免疫反應，但是2)它卻能增強對免疫原的免疫反應。或者，換句話說，僅用佐劑接種不能引起對免疫原的免疫反應，用免疫原接種也許會或者也許不會增強對免疫原的免疫反應，但免疫原和佐劑的聯合接種會引起比單用免疫原強得多的免疫反應。
分子的「靶向」在本上下文中意指這樣一種情形引入動物的一種分子將優先出現在一定組織中，或與一定的細胞或細胞類型優先關聯。這種效果通過許多方式獲得包括組合物易化靶向中的分子的配方或易化靶向基團分子的引入。這些將在下面詳細討論。
「免疫系統的刺激作用」意指一種物質或組合物表現出的一般的、非特異性的免疫刺激效應。許多佐劑和推定的佐劑(如一些細胞因子)都有刺激免疫系統的能力。使用免疫刺激製劑的結果是提高了免疫系統的「敏感性」，這意味著與免疫原同時或隨後使用誘導的免疫反應比單獨使用免疫原要更有效。
GDF-8活性下調的優選方案在本發明的方法中優選用作免疫原的GDF-8多肽是一種修飾的分子，其中在GDF-8胺基酸序列上至少存在一處改變，因為這一改變很大程度上促進了首要的GDF-8自身耐受打破的獲得機會。需要指出的是，這並不排除在配方中使用這種修飾的GDF-8的可能性，該配方進一步促進了對GDF-8自身耐受的打破，如含有以下會詳細討論的的佐劑的配方。
有人指出正常個體中生理上存在潛在的自反應性B淋巴細胞識別自身蛋白(Dalum Iet.al，1996，J Immunol.1574796-4804)。然而，為了誘導這些B淋巴細胞確實產生對相關自身蛋白反應的抗體，需要產生細胞因子的T-輔助淋巴細胞(TH-細胞或者TH-淋巴細胞)的幫助。一般來講，這種幫助並不會發生，因為T-淋巴細胞一般不會識別抗原提呈細胞(APCs)提呈的來源於自身蛋白的T-細胞表位。但是，通過在自身蛋白上引入一個「外來」成分，(即通過引入一種免疫學上顯著的修飾)，就會激活T細胞識別該外來成分，識別APC上的外來表位(例如，最初是一個單核細胞)。能夠識別修飾的自身蛋白上的自身表位的多克隆B型淋巴細胞(它們也是特殊的APCs)也能夠使抗原表現出來，隨後提呈抗原的外源T-細胞表位，活化的T-淋巴細胞隨後提供細胞因子，幫助這些自身反應的多克隆B淋巴細胞。由於這些多克隆B淋巴細胞產生的抗體可以與修飾多肽上的不同表位反應，包括天然多肽中存在的表位，因此可能誘發抗體與非修飾自身蛋白的交叉反應。總之，T-淋巴細胞似乎與多克隆B型淋巴細胞識別整個的外來抗原一樣起作用，但實際上對宿主來說，僅有插入的表位是外源的。這樣，誘導產生了能夠與非修飾自身抗原交叉反應的抗體。
本技術領域中已經知道了幾種為了克服自身耐受修飾肽自身抗原的方法。因此，本發明的修飾包括-引入至少一個外源T-細胞表位，和/或-引入至少一個第一部分基團，影響修飾分子對抗原提呈細胞(APCs)的靶向作用，和/或-引入至少一個第二部分基團，刺激免疫系統，和/或-引入至少—個第三部分基團，優化修飾GDF-8多肽對免疫系統的提呈。
但是，所有這些修飾都應該在下述前提下進行，即維持活化GDF-8中足夠比例的初始B型淋巴細胞表位。因為，這樣就提高了B型淋巴細胞對這些天然分子的識別。
在一個優選的實例中，以共價或者非共價的方式引入側鏈基因(以外來T-細胞表位的形式或者上述第一、第二和第三部分基團形式)。這就表明來源於GDF-8的胺基酸殘基支鏈衍生物並沒有改變一級胺基酸順序，或者說至少鏈上每個胺基酸之間的肽鍵沒有發生改變。
另外一種優選的實例利用胺基酸替代和/或缺失和/或插入和/或增加(這可以通過重組或者多肽合成的方法實現。較長胺基酸鏈的修飾可以產生融合多肽)。本實例的一個特別優選的文本是WO 95/05849描述的技術，他公開了一種通過與自身蛋白類似物進行免疫反應以下調自身蛋白的方法，其中一些胺基酸序列已經被相應數目的含有一個外源免疫顯性T-細胞表位的胺基酸序列取代，而同時又保存了類似物中自身蛋白的整體三級結構。基於本發明的目的，如果修飾(插入，增加，刪除或者替代一個胺基酸)增加了外源T-細胞表位，同時又能保留一定數目的GDF-8中B-細胞表位就足夠了。然而，為獲得最大效率誘的導免疫反應，優選保留修飾分子中的整體三級結構。
下述通式描述了此項發明中涵概的GDF-8構建物MOD1)S1(GDF-8e1)n1(MOD2)S2(GDF-8e2)n2…(MODx)SX(GDF-8ex)nx(I)-其中GDF-8e1-GDF-8ex是GDF-8亞序列包含的X個B細胞表位，互不依賴，或者相同，或者不同，或者含有外源側鏈基團或者不含有外源側鏈基團，X是≥3的整數，n1-nx是X個≥0(至少有1個，≥1)的整數，，MOD1-MODx是保守的B細胞表位中引入的X個修飾結構，S1-Sx是X個≥0的整數(至少一個是≥1，如果在GDF-8e序列中沒有引入側鏈基團的話)。因此，考慮到構建物免疫原性的一般功能的限制，本發明允許所有原始GDF-8序列的變換，以及所有的修飾。因此，本發明還包括了通過省略部分在體內具有相反作用基團的GDF-8序列修飾獲得的GDF-8，或通過省略增加非預期免疫反應基團的GDF-8序列修飾獲得的GDF-8。
可以有幾種途徑獲得這裡描述的修飾一種蛋白的足夠比例的B-細胞表位或整體三級結構的保留。一種是簡單製備直接抗GDF-8的多克隆抗血清(例如用兔製備的抗血清)，隨後將這種抗血清作為一種檢測試劑(例如用於競爭性ELISA)，檢測生成的修飾蛋白。與GDF-8反應具有相同程度的抗血清反應的修飾產物視為與GDF-8具有相同的整體三級結構，然而與抗血清表現出有限的(但仍是顯著並且特異的)反應性的類似物則視為保留了實質的原始B-細胞表位部分。
或者，可以選擇性製備與GDF-8上獨特表位反應的單抗，並將其作為檢驗模板。該方法有以下好處1)可以給出GDF-8表位圖譜，並且，2)製備的類似物上保持了表位圖譜。
當然，另外一種方法能夠解決GDF-8的三維結構或其具有生物學活性的截尾類似物(上述)，並將此與製備的類似物的三級結構進行比較。三維結構可以通過X-線衍射法和NMR光譜法獲得。進一步與三級結構有關的信息，可以通過圓二色譜法在一定程度上獲取，這種檢驗方法的好處是只需要純化的多肽(X-線衍射法需要提供多肽晶體，而NMR光譜法需要提供多肽不同的同位素異構體)就可以獲得檢定分子的有關三級結構的有益的信息。然而，最終仍需用X-線衍射法和/或NMR光譜法給出結論性的數據，因為圓二色譜法只能通過二級結構成分的信息間接地給出正確的三級結構的證據。
本發明的一個優選的實例利用了GDF-8 B淋巴細胞表位的多重提呈(即公式I，其中至少一個B型細胞表位在兩個位置存在)。這種作用可以通過不同的方法實現，例如，通過簡單製備含有(GDF-8)m結構的融合多肽，其中m是≥2的整數，隨後將這裡討論的修飾體導入至入一個GDF-8序列，或者插入至少兩個GDF-8胺基酸序列間。優選導入的修飾體包括至少一個B-淋巴細胞表位的複製體和/或引入一個半抗原。
如上所述，引入外源T-細胞表位可以通過引入至少一個胺基酸插入、添加、缺失或者替代等方式完成。當然，通常情況下將在胺基酸序列中引入超過一處的改變(例如，完整T-細胞表位的插入或替代)，但是，要達到的重要目的是，當GDF-8類似物被抗原提呈細胞(APC)提呈時，增加了APC表面MCH II類分子上存在的外源顯性T-細胞表位。因此，如果GDF-8胺基酸序列在合適位置上含有一些胺基酸殘基，而這些胺基酸殘基也存在於外源TH表位的話，那麼，外源TH表位的引入可以通過胺基酸的插入、添加、缺失和替代等方法提供外源表位的胺基酸殘基來完成。換言之，就是不需要用插入或者替代的方法引入一個完整的TH表位。
優選的胺基酸插入、缺失、替代或者增加的數目是至少2個，如3，4，5，6，7，8，9，，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20和25個插入、替代、增加或者缺失。更優選的是插入、替代、增加或者缺失的胺基酸數目不超過150個，例如最多100個，最多90個，最多80個，最多70個。更優選的的是，替代、插入、刪除或增加的次數不超過60次，優選的次數是不超過50次甚至不超過40次。最優選的次數是不超過30次。需要指出的是，關於胺基酸增加的情況，如果產生的構建體是以融合多肽的形式存在，那麼通常要遠遠大於150。
本發明優選的實例包括通過引入至少一個外源免疫顯性TH表位的修飾方法。大家知道，一個TH表位的免疫顯性問題依賴於所採用的動物種屬。在此，術語「免疫顯性」僅指該表位在接種個體體內能夠產生顯著的免疫反應，但是一個眾所周知的事實是，TH表位在一個個體體內表現為免疫顯性，但不一定在另一個相同種屬體內表現為免疫顯性，儘管這在後者個體中它可能與MHC-II分子結合。
另一重要的控制點是TH表位的MHC限制問題。總的來講，自然產生的TH表位是MHC限制的，即由一定的肽組成的TH表位只能與一種MHC II型分子亞型有效結合。相應的，這就會產生以下結果大多數情況下使用一種特定的TH表位會產生一種疫苗成分，它只對整體中的某一部分有效，其效應依賴於這一部分的大小，因此有必要在同一個分子中儘可能多地包含TH表位，或者是製備多組分疫苗，其中的組分是GDF-8的變型，它們彼此之間由於引入的TH表位本質不同而不同。
如果所使用的T-細胞MHC限制性是完全未知的(例如所接種動物的MHC組成限定較差的情況下)，那麼動物群體中被一種特定疫苗組分所覆蓋的部分可以利用下述公式計算 -其中pi是疫苗組分中存在的對第i個外源T-細胞表位起反應的群體頻數，n是疫苗組分中外源T-細胞表位的總數。因此，一個含有3個外源T-細胞表位的疫苗組分，它們對群體的反應頻數分別為0.8，0.7和0.6，會產生1-0.2×0.3×0.4＝0.976-即群體的97.6％在統計學上會參與MHC-II介導的疫苗的反應。
上述公式不適用於所使用多肽MHC限制方式已知的情形。舉例如下如果一個多肽，僅與HLA-DR等位基因DR1，DR3，DR5和DR7編碼的MHC-II分子結合，那麼將此肽與由HLA-DR等位基因編碼的MHC-II分子的剩餘部分結合的另一個多肽聯合使用，將能達到對所討論群體的100％覆蓋。類似的，如果第二個肽僅與DR3和DR5結合，加入此肽根本不會提高覆蓋率。如果我們將計算整體反應的基礎僅僅定位於疫苗中T-細胞表位的MHC限制性上，那麼一個特定疫苗組分覆蓋的群體部分可以用以下公式進行計算 其中，j是編碼MHC分子的等位基因單倍型群體的頻數總和，該分子能與疫苗中的任何一個T-細胞表位結合，屬於3個已知HLA位置(DP，DR和DQ)中的第j個；在實際應用時，首先測定哪種MHC分子識別的疫苗中的每一種T-細胞表位，並將這些MHC分子按類型列出(DP，DR和DQ)-然後，將所列不同的等位單倍型每一反應頻率按類型進行歸納加和，即可得到ф1，ф2和ф3。
公式II中的pi值有可能超過相應的理論值πii=1-j=13(1-vj)2---(IV)]]>其中，Vj是編碼MHC分子的等位基因單倍型群體的頻數總和，該分子能與疫苗中第i個T-細胞表位結合，屬於3個已知HLA位置(DP，DR和DQ)中的第j個。這表明，在群體的1-πi中有一個效應子的反應頻率是f殘基I＝(pi-πi)/(1-πi)。因此，公式III可以調整為公式V 其中，1-f殘基I如果是負值就調整為零。需要指出的是，公式V要求所有的表位都需進行單倍型圖譜確認，避免相同的單倍型。因此，在選擇T-細胞表位以引入IL5類似物時，了解所有已知表位的情況十分重要，該表位是否1)對群體中每一表位的反應頻率；2)MHC限制數據，3)群體中相關單倍型的頻率。
有時在一個動物種類或動物群體中的大部分個體中存在許多天然的「有前途的」活性T-細胞表位，優選將它們引入疫苗中，以降低對相同疫苗中大量不同GDF-8類似物的需求。
根據本發明所述，有前途的表位可以是自然產生的人T-細胞表位，如破傷風類毒素(例如，P2和P30表位)，白喉類毒素，流感病毒白凝素(HA)和P.falciparumCS抗原等來源的表位。當然，如果用在接種除人之外的其它動物時，應該有意利用自然產生的所述動物的有前途的T-細胞表位。
在過去的幾年裡已經識別了一些其它的有前途的T-細胞表位。特別是能夠結合大部分由不同HLA-DR等位基因編碼的HLA-DR分子的肽已經被識別，根據本發明，這些是引入所用的GDF-8類似物中所有可能的T-細胞表位。參看下列參考文獻中所討論的表位，以下文獻在此引入以供參考WO 98/23635(Frazer IH等，Queensland大學)；Southwood S等，1998，J Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336778-780；Chicz RM等，1993，J Exp Med 17827-47；Hammer J等，1993，Cell 74197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39230-242。以後的文獻也涉及HLA-DQ和-DP配體。這5篇文章所列的所有表位都與本發明中所使用表位相關，是候選的天然表位，它們之間具有相同的操縱子。
另外，所述的表位可以是任何能夠與大部分MHC II型分子結合的人工合成的T-細胞表位在此上下文中WO 95/07707以及相關的論文Alexander J等，1994，Immunity 1751-761(這兩篇公開本均在此引入以供參考)中描述的全部DR表位肽(「PADRE」)，按照本發明的觀點，都是令人感興趣的候選表位。需要指出，這些文章中公開的最有效的PADRE肽在C和N末端都具有D-胺基酸，以提高給藥時的穩定性。但是，由於本發明主要定位於引入相關的表位，並作為修飾GDF-8的一部分，它隨後在APCs的溶酶體內被酶降解，繼之提呈給所述的MHC-II型分子，因此，在本發明使用的表位中整合入D-胺基酸並不合適。
一種優選的的PADRE肽具有AKFVAAWTLKAAA的胺基酸序列或者其免疫有效序列。該PADRE肽以及其它具有相同的MHC限制缺失的表位是優選的T-細胞表位，在該發明中應該在GDF-8類似物中存在。這種具有「卓越前途」的表位可以將本發明的最簡單實例，其中僅有單個修飾的GDF-8，提呈給接種動物免疫系統。
如上所述，GDF-8的修飾也可以包括引入第一部分基團(firstmoiety)，它可以將修飾的GDF-8指引至APC或者B型淋巴細胞。例如，第一部分基團可以是B淋巴細胞特異表面抗原或APC特異表面抗原的特異結合配體。在本領域中許多這樣的特異抗原已經被人所知。例如，這一基團可以是糖類，在B-淋巴細胞或者是APC上有其受體(如甘露聚糖和甘露糖)。或者是，第二部分基團是一個半抗原。同樣能夠特異識別APCs或者淋巴細胞表面分子的抗體片段也可以作為第一部分基團(例如表面分子可以是巨噬細胞和單核細胞的FC口受體，如FC口RI，或，另外任何一種其它特異表面標誌物，像CD40或者CTLA-4)等。需要指出的是，所有舉例的這些靶向分子同樣都可以用做佐劑的一部分，參看以下。
為將修飾的GDF-8多肽靶向引至某些類型的細胞，增強免疫反應，作為一種替代或者補充，可以將上述提及的第二部分基團(secondmoiety)引進，刺激免疫系統，提高免疫系統的反應水平。該第二部分基團的典型例證是細胞因子和熱休克蛋白，及其效應部分。
根據本發明，所用的合適細胞因子在疫苗組合物中通常應該具有佐劑的功能，即，例如，幹擾素γ(IFN-γ)，Flt 3L，白細胞介素1(IL-1)，白細胞介素2(IL-2)，白細胞介素4(IL-4)，白細胞介素6(IL-6)，白細胞介素12(IL-12)，白細胞介素13(IL-13)，白細胞介素15(IL-15)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；另外，細胞因子分子的功能部分足以作為第二部分基團。關於細胞因子作為佐劑的用法，參考以下討論。
根據發明，適於用作第二部分基團的熱休克蛋白可以是HSP70，HSP90，HSC70，GRP94(也稱為gp96，參考Wearsch PA等，1998，Biochemistry 375709-197)，和鈣網硬蛋白CRT(calreticulin)。
另外，第二部分基團可以是毒素，如listeriolycin(LLO)，脂質A和不耐熱腸毒素。而且，一些分支桿菌衍生物，像MDP(muramyl二肽)和海藻糖二酯TDM和TDE都是比較合適的候選物。
同時，引入第三部分基團(third moiety)，使其增加修飾GDF-8對免疫系統的提呈，也是本發明的一個重要實例。本領域的技術人員已經出具了這一原理的幾個實例。例如，已知包柔氏螺旋體菌burgdorferi蛋白OspA上軟脂醯脂化抗基可以用於提供自我輔助多肽(參考見WO 96/40718)。脂化蛋白質似乎形成了微團樣結構，其核心由多肽的脂化抗基部分組成，分子的其他部分從此處突出，形成了抗原決定簇的多樣呈現。因此，本發明實例優先使用了這種方法及其相關方法，採用不同的脂化抗基(如十四烷基基團，十四烷基基基團，法呢基基團，香葉基-香葉基基團，GPI-抗基和N-乙醯二甘油脂基團)，尤其是由於重組產生的蛋白質提供了脂化抗基，使這一方法更加直接，只需要利用諸如自然產生的信號序列作為融合配體用於修飾的GDF-8多肽。另一種可行的方法是利用補體因子C3的C3d片段或者是C3本身(參考Dempsey等，1986，Science 271，348-350。和Lou Kohler，1998，Nature Biotechnology，16，458-462)。
本發明另一個實例，產生優化的多拷貝(≥2)GDF-8重要表位區域對免疫系統的提呈，是將GDF-8及其亞序列或者變異體通過共價或非共價鍵與一定的載體分子偶聯起來。例如可以使用聚合體，像糖類，如葡聚糖，參考見LeesA等，1994，Vaccine 121160-1166；LeesA等，1990，J Immunol.1453594-3600，但甘露聚糖和甘露糖也是較好的替代品。像從大腸桿菌和其它細菌分離的膜嵌蛋白也是非常有用的結合體，傳統的載體分子像匙孔鹼血藍素(KLH)，破傷風類毒素，白喉毒素和牛血清白蛋白(BSA)都是優選有用的結合體。
天然GDF-8的一定區域被認為非常適合進行修飾。有人推測，在GDF-8 C末端的下列亞序列的至少一處進行修飾都可以產生合適的免疫源分子序列信號為11或12的殘基18-41，49-69或79-104，或者不同來源的除了人，牛，豬，雞或者火雞相應亞序列。選擇這些區域的理由是a)B細胞表位的保守性；b)二級、三級和四級結構的保守性等。從任何角度上講，正如此處所說，篩選一系列修飾的GDF-8分子(已經在不同位點引入T-細胞表位)都非常容易，用它們與天然GDF-8抗體進行免疫反應。優選的修飾是通過利用至少一個相等或不等長度含有外源TH表位的胺基酸序列替代原有胺基酸序列。這類構建物的理論基礎在實例中有詳細討論。同樣優選的還有在GDF-8片段的C末端的環區或者是游離末端(殘基1-12，18-30，42-51，82-86和105-109)進行插入(或者替代)。
GDF-8以及修飾的GDF-8多肽的配製當通過給動物使用GDF-8多肽或修飾的GDF-8多肽以觀察其在動物免疫系統的呈現形式時，多肽的配製原則在本領域的技術人員中是公知的。
含有肽片段作為活性成分的疫苗的製備方法在本技術領域是已知的，如U.S.專利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792及4,578,770，在此引入以供參考。通常，將此疫苗製備成溶液或混懸液以作注射劑用，也可將它製備成適合形成溶液或混懸液的固態。也可將它製成乳化劑。活性免疫成分通常與藥物活性上可以接受並可共存的活性成分混合，適合的成分有，例如水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇或類似物及其組合物。此外，如果需要的話，此疫苗可以含有少量的輔料如溼化或乳化劑、pH緩衝劑、或者增強疫苗效應的佐劑，參考以下關於佐劑的詳細描述。
該疫苗通常通過消化道以外的其他方式給藥，如通過注射，例如或者皮下注射，皮內注射，真皮內注射，真皮下或肌肉注射。適合其他給藥途徑的一些劑型包括栓劑和，在一些實例中，如口服，口腔內(buccal)，舌下，腹膜內，陰道內，肛門，硬膜外，脊髓及顱骨內劑型。對於栓劑來說，傳統的結合劑和轉運載體包括，如，polyalkalene乙二醇或甘油三酯；這些栓劑由含0.5％到10％，優選1-2％活性成分的混合物形成。口服劑型包括一些常用的賦形劑如甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。這些組分以溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉末的形式出現，其中含有10-95％，優選25-70％的活性成分。對於口服劑型來說，霍亂毒素是一種很有趣的劑型輔助劑(也可能作為一種結合輔助劑)。
多肽可以以中性或鹽的形式配成疫苗中。藥學上可接受的鹽類包括酸添加鹽(與肽的自由胺基形成)以及由無機酸如鹽酸或磷酸，或這樣的有機酸如醋酸，草酸，酒石酸，苯乙醇酸等形成的鹽。由自由羧基基團形成的鹽類也可以來源於無機鹼，如鈉，鉀，銨，鈣，或氫氧化三鐵和這樣的有機鹼如異丙胺，三甲胺，2-乙胺基乙醇，組氨酸，普魯卡因等。
這種疫苗通過與劑量配方相適應的途徑給藥，這種劑量將是治療有效的和致免疫作用的。給藥的劑量隨著不同的治療對象而有變化，包括，例如能夠產生免疫反應的個體免疫系統能力和預期的保護程度。合適的劑量範圍是每一疫苗中的幾百微克的活性成分，優選的範圍是大約0.1μg～2000μg(甚至可以考慮1-10mg的更高的劑量範圍)，如在0.5μg～1000μg之間，優選的範圍是在1μg～500μg間，尤其是在10μg～100μg的劑量範圍內。初始的給藥途徑及加強劑量的給藥方案也會變化，但是通常在最初的給藥途徑後加以預防注射或其他給藥途徑。
應用方式可以有很大的變化。任何傳統的疫苗給藥方式都是可行的，其中包括口服給予生理可接受的固體鹼或膠體溶液，胃腸外的注射液等等。疫苗的劑量依賴於用藥的方法，根據接受疫苗接種的人的年齡以及抗原的配方的不同而變化。
疫苗中的某些多肽足以能夠產生免疫反應，但是如果疫苗中加入一些佐劑，其他的一些多肽所產生的免疫反應會增強。
我們已經知道了許多不同的在疫苗中加入佐劑從而增強其作用的方法。一般的原則及方法在「佐劑的理論和實際應用」，1995，DuncanE.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley Sons Ltd，ISBN0-471-95170-6中，以及在「疫苗新的免疫佐劑的產生」，1995，Gregoriadis G等.(eds)，Plenum Press，New York，ISBN0-306-45283-9中，有詳細的描述，這兩份文獻在此引入以供參考。
優選使用的佐劑是能夠幫助消除對自身抗原而產生的自身耐受性；事實上，應用未經修飾的GDF-8作為自身疫苗的活性成分時必需要用佐劑。合適佐劑的非限定性實例選自基團包括免疫靶向佐劑；如免疫調節佐劑如毒素，細胞素和分枝桿菌衍生物；油劑；聚合物；微團形成佐劑；皂甙；免疫刺激複合基質(ISCOM Matrix)；微粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉和膠囊佐劑。總之，我們應注意到，上述公開涉及類似物中用作第一部分，第二部分和第三部分基團的化合物和試劑，是指它們在本發明疫苗佐劑中使用的mutatis mutandis。
佐劑的應用通常包括應用某些試劑，例如氫氧化鋁或磷酸鋁，在緩衝鹽溶液中一般加入0.05％到0.1％，並且與合成的0.25％的糖聚合物(如卡波普)相混合，通過在70℃-101℃間加熱3秒～2分鐘的熱處理將疫苗中的蛋白質聚集，也可以通過交聯試劑達到此目的。也可應用以下方法聚集，將胰酶處理過的抗體(Fab片段)與白蛋白反應，將細菌細胞如C.parvum或革蘭氏陰性菌內的內毒素或脂多糖成分相混合，用生理上可接受的油性載體進行乳化，如甘露醇單油酸酯(Aracel A)或者也可以應用20％Perfluorocarbon(Fluosol-DA)作為阻斷取代物來進行乳化，也常與角鯊烯及IFA等油劑混合。
根據本發明，DDA(二-甲基二-十八烷基溴化銨)與DNA和γ-菊粉同樣是一種有趣的佐劑候選物，但弗羅因德的完全和不完全的佐劑以及皂樹皂苷如QuilA和QS21都是與RIBI相同的有趣的佐劑，此外，還有單磷醯醯脂A(MPL)，以上提過的C3和C3d，胞壁醯二肽(MDP)。
脂質體也有佐劑的作用，所以根據本發明常優選脂質體佐劑。
根據本發明也優先選用免疫刺激複合基質(ISCOM Matrix)佐劑，尤其是因為這種佐劑可以通過APCs來上調MHC II類的表達。ISCOM基質包含(隨意分離)的皂皮樹中的皂角甙(三萜烯酯)，膽固醇和磷脂。當與免疫激發蛋白相混合後形成的微粒製劑就是ISCOM基質，其中含皂角甙60-70％w/w，膽固醇及磷脂10-15％w/w，蛋白質10-15％w/w。關於免疫刺激複合物的具體組成成分和使用方法細節可以在上述關於佐劑的手冊中查到，下列文獻也提供了有關製備完全免疫刺激複合物的有用介紹Morein B et al.，1995，Clin.Immunother.3461-475，以及Barr IG和Mitchell GF，1996，Immunol.和Cell Biol.748-25(在此引入以供參考)另外一種十分有趣的(因此，也是優選的)獲得佐劑效果的方法是應用在Gosselin et al.，1992中描述的技術(在此引入以供參考)。簡而言之，將抗原與單核細胞/巨噬細胞上的Fcγ受體的抗體(或結合於抗體片段上的抗原)結合後可以增強相關抗原如本發明抗原的提呈。抗原與抗FcγRI的結合尤其可以增加疫苗的免疫激發活性。
其它可能的佐劑包括使用上述靶向及免疫調節物質(如細胞因子)作為修飾GDF-8中一級及二級基團的侯選物。在連接過程中，也可以應用如Poly IC的合成細胞因子誘導劑。
可以從包括胞質二肽，完全弗羅因德佐劑，RIBL和海藻糖二酯如TDM和TDE等基團中選擇適合的分枝桿菌衍生物。
可以從包括CD40配體及CD40抗體或其特殊結合片段(參考上述討論)，甘露糖，Fab片段，及CTLA-4基團中選擇適合的免疫靶向佐劑。
可以從包括碳水化合物如葡聚糖，PEG，澱粉，甘露聚糖和甘露糖；以及含有塑料聚合物及膠乳(如膠乳珠)的團體中選擇適合的聚合物佐劑。
另外一種調節免疫反應的方法包括在「人工虛擬淋巴結」(Virtual Lymph Node，VLN)(由Immuno Therapy，Inc.開發的一種醫療器械，360 Lexington Arenue，New York，NY 10017-6501)中的GDF-8免疫原(可與佐劑和藥學上可接受的載體任意結合)。VLN(一種細管裝置)能夠模擬淋巴結的結構及功能，將VLN埋入皮下可產生富含細胞因子及趨化因子的無菌炎性區域。T細胞和B細胞以及APCs對危險信號快速作出反應，遊走到炎症部位並且在VLN的多孔基質中聚集。我們已經知道應用了VLN後，為了對抗原產生免疫反應所需的抗原劑量減小，並且應用VLN進行的疫苗接種所產生的免疫保護作用超過了傳統的應用Ribi作為佐劑的免疫化作用。該技術在Gelber C等人.1998.「使用名叫人工虛擬淋巴結的新醫療儀器對小量免疫原誘發出巨大的細胞和激素免疫反應」，「從實驗到臨床(From the Laboratoryto the clinic)，摘要手冊，October 12th-15th1998，SeascapeResort，Aptos，California」中有簡單描述。
預期的接種應至少一年使用一次，如一年至少1，2，3，4，5，6，和12次。特別是，對一個有需要的個體來說，每年1-12次是可以接受的，如一年1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12次。以前曾有報導，根據本發明使用的優選自體接種誘導的記憶免疫並不持久，因此，免疫系統需要定期用類似物進行接種。
由於遺傳差異，不同的個體對同一多肽產生的免疫反應強度會有差別。因此本發明中的疫苗包含幾種不同的多肽，以增強免疫反應(同樣參見上述提及的關於選擇性引入外源T細胞抗原表位的討論)。疫苗中可能包括兩種或兩種以上的多肽，其中所有的多肽上面已經介紹過。
所以，本疫苗中可能包括3-20種已修飾的或未修飾的不同多肽，如3-10種不同多肽。但通常多肽的種類將儘可能減少到1或2種。
核酸疫苗作為傳統多肽疫苗的替代品，核酸疫苗技術(亦稱為「核酸免疫接種」、「遺傳免疫接種」、「基因免疫接種」)具有一些優點。
首先，與傳統的疫苗接種方法相比，核酸疫苗勿需大規模生產免疫原(如微生物工業發酵生產修飾的GDF-8)。其次，免疫原勿需儀器設備純化和重摺疊過程。最後，由於核酸疫苗依賴於被接種者自身的生化過程來產生引入的核酸的表達產物，表達產物會得到充分的翻譯後加工，這對一點對自體疫苗而言尤其重要，因此，如上所述，在修飾分子中原來GDF-8 B細胞抗原表位中的重要組分必須保留，而且，原則上B細胞抗原表位可由任何(生物)分子(如糖類、脂類和蛋白質)中的某些部分組成。因此，免疫原的天然糖基化和脂化方式對其總免疫原性十分重要，而讓宿主自行產生免疫原可以確保這一點。
由此，本發明的一個優選實例包括向動物細胞中導入編碼修飾型GDF-8的核酸並在其中得以表達，進而影響免疫系統對修飾型GDF-8的抗原提呈過程。
在該實例中，導入的核酸優選是DNA，其形式可以是裸露的DNA、與帶電荷或不帶電荷脂類配方的DNA、脂質體中配方的DNA、病毒載體中的DNA、與轉染易化蛋白或多肽配方的DNA、與靶向蛋白或多肽配方的DNA、與Ca2+沉澱劑配方的DNA、與插入載體分子偶聯的DNA以及與佐劑配方的DNA。在上下文中值得注意的是實際上所有適用於傳統疫苗配方的佐劑方法都適用於DNA疫苗配方。因此，這裡公開的涉及對適用於多肽疫苗的免疫佐劑適用方法做了必要的修正，使之也適用於核酸疫苗技術。
前面已詳細討論過多肽疫苗的給藥途徑和給藥方案，它們也同樣適用於本發明中的核酸疫苗，並且已對其作了必要的修正，使之也適用於核酸疫苗。應該補充的是核酸疫苗也適於靜脈或動脈給藥。另外，本領域的技術人員都知道也可使用所謂的「基因槍」來給藥，因此，這一點和相同的用藥方法也被認為是本發明的一部分。最後，已有報導表明使用人工虛擬淋巴結(VLN)對核酸給藥也可產生良好的效果，因此這種特殊給藥方法尤其可取。
此外，作為免疫接種製劑的核酸可含有第1、2或(和)3種基團的編碼區，如上面提到過的各種形式的免疫調節劑，其中細胞因子是一種有效的佐劑。該優選的實例包括抗原類似物和免疫調節劑各自的編碼區有不同的讀碼框或者至少是受不同的啟動子控制，這樣可避免抗原類似物或者抗原表位與免疫調節劑表達為融合蛋白。另外，也可將這兩種不同的核酸分開使用，但這種方法並不可取，因為當這兩種編碼區包含在同一核酸分子中時才可以保證共表達。
因此，本發明還涉及一種組合物，它可以誘導GDF-8抗體產生，該組合物包括-本發明的一段核酸片段或者載體(參見下面對載體的說明)。
-一種藥學和免疫學上可接受的運載工具和/或載體和/或上面已討論過的免疫佐劑。
通常情況下，GDF-8變體的編碼核酸以載體方式導入，其表達置於病毒啟動子控制之下。本發明中對載體和DNA片段的詳細說明請參見下面的討論。另外，對核酸疫苗的製備和用法也有詳細的公開說明，參見Donnelly JJ等人.1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和Donnelly JJ等人.1997，生命科學(Life Science)60163-172.這兩篇文獻在此引入以供參考。
活疫苗第三種可影響修飾型GDF-8向免疫系統提呈過程的替代方法是使用活疫苗技術。在動物接種活疫苗時，通過給予用修飾型GDF-8編碼核酸片段或攜帶該核酸片段的載體轉化的非致病微生物，影響其對免疫系統的抗原提呈過程。非致病微生物可以是任何合適的減活菌株(可通過改變微生物侵入方式或利用重組DNA技術除去致病表達產物而減活)，例如，牛屬結核分支桿菌BCG、非致病性鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌屬、霍亂弧菌和志賀氏菌屬等。有關活疫苗當前製備水平的綜述請參見Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和WalkerPD，1992，Vaccine 10977-990，這兩篇文獻在此引入以供參考。有關在這些活疫苗中所用的核酸片段和載體的細節請參見下面的論述。
作為細菌活疫苗的替代品，可以將下面論及的核酸片段整合到非致病性病毒疫苗載體如牛痘病毒株或者其他任何合適的痘病毒當中去，感染要接種的動物。
通常對動物一次性給予非致病性微生物或病毒即可，但在某些情況下為了維持保護性免疫，一生中需要不止一次給予微生物。在使用活疫苗或者病毒疫苗時仔細考慮採用類似前述多肽疫苗的免疫接種方案是有益的。
另外，接種活疫苗或者病毒疫苗前後可合併使用多肽疫苗和/或核酸疫苗。例如，初次免疫接種時用活疫苗或病毒疫苗，然後用多肽或者核酸疫苗進行強化免疫接種是可行的。
可以給微生物或者病毒轉化含有第1、2或(和)3種基團編碼區的核酸，如以上面提到過的免疫調節劑的形式，如細胞因子被認為是一種有效的佐劑。該實例的優選部分包括抗原類似物和免疫調節劑各自的編碼區有不同的讀碼框或者至少是受不同的啟動子控制。因此可避免抗原類似物或者抗原表位與免疫調節劑表達為融合蛋白。另外，這兩種不同的核酸片段可以分別用於轉化。當然，將第1和/或第2和/或第3種基團置於同一讀碼框中可以產生一種表達產物，即本發明的類似物，而根據本發明，這樣的實例是優選的。
本發明方法在肉類生產和疾病治療中的應用正如以上所討論的內容一樣，本發明方法通過下調GDF-8活性刺激動物骨骼肌生長。因此，本發明下調GDF-8活性方法的一個重要方案包括增加動物骨骼肌質量的方法，該方法包括根據本發明方法將GDF-8活性下調至，與具有正常GDF-8活性的正常動物比較，骨骼肌質量具有統計學顯著增加(達到95％可信限)至少5％的程度。
骨骼肌質量的增加可能會更高，如至少達到增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或甚至45％，參見在轉基因小鼠和天然GDF-8缺陷鼠動物身上觀察到的骨骼肌質量的增長。
肌肉質量可用該領域內任何方便的方法測定，如評估整個肌肉質量和/或相關肌肉質量。
抗GDF-8疫苗可能可用於特定人類疾病如癌症惡病質的治療，此疾病已報導有肌肉萎縮現象，它在其他肌肉萎縮性疾病的治療或改良中也具有可行性。最近有報導稱GDF-8抑制有助於治療急性和慢性心臟衰竭。
肽、多肽以及本發明的組合物通過以上的敘述顯而易見本發明是基於個體對GDF-8抗原進行免疫以提高肌肉生長率。優選的獲得這樣免疫的方法是運用修飾的GDF-8，因此就提供了本領域先前未公開的分子。
一般認為本文討論的修飾的GDF-8分子是其自身有創造性的，因此本發明的一個重要部分在於定位於來源於動物GDF-8的GDF-8類似物，其中GDF-8引入了一種修飾，從而導致用該類似物免疫動物得到的抗體能與未修飾GDF-8多肽鏈特異的作用。優選的，當使用修飾的GDF-8討論本發明方法的不同技術方案時，該修飾特徵符合上述的修飾類型。因此這裡展示的任何與GDF-8分子有關的公開都與本發明描述GDF-8類似物的目的有關，任何公開都作了修訂以描述這些類似物。
值得注意的是優選的GDF-8分子修飾體包括那些獲得與GDF-8序列至少70％相同或其亞序列的胺基酸鏈長度至少10個胺基酸相同的肽鏈的修飾。優選更多的序列相同，如至少75％、甚至80％、85％相同的修飾體。核苷酸和蛋白質的序列同一性可以用如下公式計算(Nref-Ndif)×100/Nref，其中Ndif表示兩個序列在序列對比中不一致的殘基數，Nref表示一個序列中的總殘基數。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC具有75％的同一性(Ndif＝2 Nref＝8)。
本發明同時涉及對運用本發明的方法有用的組合物。因此本發明還涉及到作為一種免疫原組合物包括一種免疫有效數量的GDF-8多肽，該多肽是一種動物自身蛋白。所述GDF-8多肽與免疫學上可以接受的佐劑共同配方以阻斷動物對GDF-8多肽的自體耐受性，該組合物還進一步包括藥學和免疫學上可以接受的媒介和/或載體。換句話說，本發明的該部分涉及天然GDF-8多肽的製劑，GDF-8多肽已經在本發明方法的實例中有描述。
本發明還涉及免疫源組合物，包括上述免疫活性量的GDF-8類似物，所述組合物進一步包括藥學和免疫學上可以接受的稀釋液和/或媒介和/或載體和/或賦形劑以及佐劑。換句話說，本發明的此部分包括GDF-8修飾體的配方，其本質已在前面闡釋。佐劑、載體以及媒介的選擇已在前面有關經修飾或未經修飾的GDF-8製劑在本發明下調GDF-8方法有討論。
本發明的多肽依據已知的方法製備。長些的多肽通常通過基因重組技術製備，包括將編碼GDF-8類似物多肽的核酸序列導入一個合適的載體，然後用這個載體轉染合適的宿主細胞，表達這段核酸序列，從宿主細胞或培養上清液中回收表達產物，後續純化以及進行進一步的修飾如再摺疊及衍生化作用。
稍短一些的肽優選通過已知的技術，如固相或液相多肽合成的方法來製備。然而，最近這方面技術已經發展到能夠製備全長的多肽或蛋白質產品。因此，用合成方法製備長鏈結構也在本發明的範圍之內。
本發明的核酸片段和載體從以上的公開中可以知道修飾的GDF-8多肽可以通過基因重組技術或化學合成或半合成來製備，當修飾位於與蛋白質載體(如KLH、白喉類毒素、破傷風毒素、BSA)和非蛋白質分子如碳水化合物聚合體偶聯處時，後兩種選擇更適宜。同時，當修飾體包含在多肽衍生肽鏈上附加側鏈基團時，後兩種選擇也是適宜的。
出於重組基因的目的，當然也是出於核酸免疫的目的，編碼GDF-8修飾體的核酸片段是十分重要的化學產物。因此，編碼GDF-8類似物的核酸片段也是本發明一個重要的組成部分，如一條由GDF-8衍生而來的多肽包括天然的GDF-8序列，經加入或插入融合部分，或者優選一條由GDF-8衍生而來的多肽，其中經插入和/或附加，優選經替代和/或刪除方法導入一個外來的T細胞表位。本發明涉及到的核酸片段可以是DNA，也可以是RNA片段。
本發明的核酸片段通常被插入適宜的載體中以形成攜帶該核酸片段的克隆和表達載體；這樣的新載體同時也是本發明的一部分。關於本發明這些載體構建將在下面有關轉染細胞或轉染微生物的篇幅中詳細描述。依據應用的目的和類型的不同，載體可以是如下形式質粒、噬菌體、粘粒、微染色體或病毒，同時，那些僅能在特定細胞中短暫表達的裸露DNA也是重要的載體。本發明中的優選的克隆和表達載體具有自主複製能力，因此它們能達到較高的拷貝數以獲得高水平表達或亞克隆的高水平複製。
通常本發明的載體按5』→3』方向及可操作的連接具有以下基本特徵用於啟動本發明中核酸片段表達的啟動子、編碼前導肽的核酸序列，以使多肽片段能夠分泌(分泌到細胞外或者進入細菌周質)或整合到多肽片段的膜上、本發明中核酸片段、編碼終止子的核酸序列。在生產菌株或細胞系中用表達載體時，應考慮到轉染細胞的基因穩定性，優選的載體是當導入宿主細胞時是整合入宿主基因組中的載體。相反，當載體用於動物體內表達(如在DNA疫苗中使用載體)，出於安全的原因，優選的載體是不能整合入宿主細胞基因組的載體；通常在這種情況下使用裸DNA或非整合病毒載體。這些選擇對於本領域的技術人員來說是已知的。
本發明的載體用於轉染宿主細胞以產生本發明中的GDF-8多肽修飾體，這些經傳染的細胞(也是本發明的一部分)可以是培養的細胞或細胞系，用於產生本發明的核酸片段和載體；或用於生產本發明重組的GDF-8多肽修飾體。另外，轉染的細胞可以是合適的活疫苗菌株，其中的核酸片段(單拷貝或多拷貝)已經插入菌株，以此來影響GDF-8修飾體的分泌和整合入細胞膜或細胞壁。
本發明優選的轉染細胞是微生物，例如細菌(埃希桿菌如大腸桿菌、桿菌如枯草桿菌、沙門菌屬、或分枝桿菌優選非致病菌株如M.bovis BCG)、酵母(如釀酒酵母)和原生動物。另外，轉染細胞可以來源於多細胞生物體如黴菌、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。最近有研究顯示利用可以商品化得到果蠅melanogaster細胞系(S2細胞系及載體系統可從Invitrogen公司買到)重組生產本發明的IL-5類似物，因此，優選利用這種表達載體也是本發明的目的。
出於克隆和/或優化表達的目的，優選的轉染細胞是能複製本發明核酸片段。表達該核酸片段的細胞是本發明優選的有用實例；它們可以用來小量或大量製備GDF-8修飾體，或者對於非致病細菌，可以作為活疫苗的疫苗組成部分。
當利用轉染細胞方法製備本發明的GDF-8修飾體時，表達產物無論是外排到培養基中還是轉運到轉染細胞表面都是十分方便的(儘管這並不是不可缺少的)。
如果鑑定了一個有效的生產細胞，在此基礎上，優選建立一個攜帶本發明載體，表達編碼GDF-8修飾體核酸片段的穩定細胞系。優選的，該穩定細胞系可以分泌或攜帶本發明的GDF-8類似物，因此可以有利於純化。
通常，含有來源於與宿主細胞具有種屬相容性種屬的複製子和調控序列的質粒載體可以用於與宿主間連接。該載體通常攜帶一個複製位點及可以在轉染細胞中提供表性選擇的標誌序列。如大腸桿菌通常用pBR322(來源於一個大腸桿菌種屬的質粒)質粒轉染(見，Bolivar等人.1997)。pBR322質粒含有氨苄抗性基因和四環素抗性基因，這就為鑑定轉化細胞提供了方便簡單的方法。pBR質粒或其他微生物質粒或噬菌體必須包含，或經修飾後含有，用於在原核生物中表達的啟動子。
通常最多被用於重組DNA構建的啟動子包括β-內醯胺酶(青黴素酶)及乳糖啟動子系統(Chang等人.1978；Itakura等人.1977；Goeddel等人.1979；)和色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel等人.1979；EP-A-0 036 776)。雖然以上啟動子通常是應用最多的，同時也發現和利用了其他微生物啟動子，關於它們的核酸序列的詳細資料均已發表，該領域熟練的技術人員能將其有效的與載體連接(Siebwenlist等人.1980)。來源於原核細胞的特定基因可以以自己的啟動子序列在大腸桿菌中有效地表達，而不需要額外通過人工的方法加入其他啟動子。
除了原核細胞，真核微生物如酵母也可以應用於這方面，在這裡，啟動子應該具有啟動表達的能力。在真核微生物中，儘管也經常用到其他一些細胞株，但釀酒酵母和baker’s酵母是最常用的。對於在酵母中的表達，例如，質粒YRp 7是經常用到的，(Stinchcomb等人.1979；Kingsman等人.1979；Tschemper等人.1980；)這個質粒已含有tryl基因，它可以對不能在色氨酸中生長的酵母突變菌系提供一個選擇標誌，例如ATCC 44076號或PEP4-1(Jones，1977)。當酵母在缺乏色氨酸的環境中生長時，存在trpl損傷作為一個酵母宿主細胞基因組的特徵，為探測轉化提供了有效的環境。
在酵母載體中適宜的啟動子序列包括3-磷酸甘油激酶啟動子(Hitzman等人.1980)或其它甘油酶的啟動子(Hess等人.1968；Holland等人.1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖磷酸激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、；葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油醛變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、葡萄糖激酶。在構建適宜的表達載體時，與這些基因相關的末端序列與序列3』端表達載體相連，提供mRNA的多聚腺苷酸化和終止信號。
其它具有被生長條件調控的轉錄活性的啟動子包括以下啟動子區乙醇脫氫酶2、細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、上述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負責麥芽糖、半乳糖利用的酶。任何包含酵母相容性的啟動子、複製起點、以及終止序列的載體都是適合應用的。
除了微生物，從多細胞生物體分離得到的培養細胞也可被用作宿主。原則上，所有這樣的細胞都是可用的，無論其來自於脊椎動物或非脊椎動物。然而，我們最感興趣的是脊椎動物細胞，脊椎動物細胞培養增殖最近幾年已有固定的方法(組織培養，1973)。這種宿主細胞的例子是VERO和HELa細胞、中國倉鼠卵巢細胞系CHO、W138、BHK、COS-7 293、果蠅melanogaster細胞和草地夜蛾(SF)細胞(完全的表達系統可以從蛋白科學(Protein Science)，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen購買)和MDCK細胞系。在本發明中，尤其優選的細胞系是S2細胞和SF21細胞購自invitrogene，PO Box 2312，9704 CH Groningen，The Netherlands。
細胞的表達載體一般包括(如果需要的話)複製起點、位於要表達基因前面的啟動子，以及必要的核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點、轉錄終止序列。
當一個表達載體要用於哺乳動物細胞表達時，其控制功能序列常來自病毒。例如，通常的啟動子來自多形瘤，腺病毒2，最經常的是來自猿猴病毒(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動子尤其有用，因為二者作為一個片段均非常容易的從SV40病毒中獲得，該片段也包含SV40病毒的複製起點。也可以使用更大或更小一些的SV40片段，只要其包括病毒複製起點上的HindIII位點到Bgl I位點的大約250bp的序列。而且，利用啟動子或正常與期望基因序列相關的控制序列也是可能的，並且經常是期望的，只要這段調控序列能與宿主細胞系統相容。
複製起點既可以來自於構建的載體中包含的一個外源起點，如來自於SV40或其它病毒(如多形瘤，腺病毒，VSV，BPV)，也可以由宿主細胞本身的複製機制提供。如果載體被整合入宿主細胞染色體，僅用後者就足夠了。
GDF-8類似物的鑑定在本領域的技術人員都知道，並不是所有天然GDF-8的變體或修飾體在動物體內都能產生與天然形式有交叉反應的抗體。然而，建立一個高效的標準篩選方法來篩選具有免疫活性的GDF-8修飾體，以滿足這裡討論的免疫反應的最小需要量並不難。因此，本發明的另一個方面涉及到鑑定GDF-8多肽修飾體的方法，該方法能夠在動物體內誘導產生抗未修飾的GDF-8的抗體，其中未修飾的GDF-8是一種自身蛋白，篩選方法包括- 通過多肽合成或基因工程的方法製備一系列彼此不同的GDF-8多肽修飾體，其中的胺基酸被增加、插入、刪除或者替代進入這些動物的GDF-8多肽胺基酸中，因此增加了該系列中的胺基酸序列，而這些序列具有與動物本身不同的T細胞表位，- 檢測這一系列成員的誘導動物產生抗未修飾GDF-8的抗體的能力；和- 分離明顯誘導動物體內抗未修飾GDF-8的抗體的系列成員。
上文中「一系列彼此不同的GDF-8多肽修飾體」是指一系列不同一的修飾的GDF-8多肽，它們的選擇基於上述標準(如與圓二色法、NMR光譜、和/或X-衍射成像研究結合)。這一系列可能只包含幾個成員，但預期該系列可包含幾百個成員)。
這一系列多肽可以通過體內方法「製備」一種可以使用的系統是製備編碼這些成員的核酸片段，然後將此片段用於我們這裡所描述的核酸免疫來檢測表達產物是否具有免疫原性。因此，該系列成員的檢測可以在體內進行，但也可以應用一些體外檢測，這些方法縮小了修飾的GDF-8分子的數量，從而能夠符合本發明的目的。
既然引入外源的T細胞表位是為了支持T細胞輔助的B細胞反應，首要決定條件是GDF-8修飾體能夠誘導T細胞的增殖。T細胞的增殖可以在體外用標準的增殖實驗來檢測。簡言之，富含T細胞的樣品可以從受試者獲得並隨後培養保存。培養的T細胞與受試者的ARCs反應，該受試者以前曾接受過修飾的分子，將它提呈至T細胞表位。我們檢測T細胞的增殖，與合適的對照比較(如培養的T細胞與曾經過完整，天然的GDF-8處理的APCs反應)。另外，可以通過檢測T細胞識別外源T細胞時釋放的相關細胞因子的濃度監測細胞的增殖。由於該系列至少有一種GDF-8修飾體能誘導抗GDF-8抗體產生的的高度的可能性，因此製備一種含有至少一種GDF-8修飾體多肽的免疫源組合物也是可能的，該多肽能誘導動物產生抗未修飾的GDF-8的抗體，其中該未修飾的GDF-8多肽是自身蛋白，該方法包括將能在動物體內顯著誘導對抗GDF-8的抗體產生的該系列成員與合適的藥學和免疫學上可以接受的載體和/或運載工具和/或稀釋劑和/或賦型劑混合使用，選擇性與至少一種藥學和免疫學上可以接受的佐劑結合使用。
以上本發明的各個方面可以方便的通過以下方法實現開始製備一定數量的彼此不同的本發明核酸序列和載體；將它們插入合適的表達載體；用載體轉染適宜的宿主細胞；表達本發明所約定的核酸序列。接著可以分離表達產物。優選的核酸序列和/或載體是通過包括應用分子擴增技術如PCR或核酸合成方法製備的。
實施例的引言GDF-8的C端109個胺基酸殘基與N端組氨酸尾巴形成的融合蛋白已經從大腸桿菌中表達得到，純化的融合蛋白已經被用於免疫兔子。全長的GDF-8已在CHO中表達，可以分別以加工過的GDF-8二聚體和未加工過的GDF-8二聚體形式分泌(McPherron等人.自然雜誌(Nature)387，83-90，1997)。因此，以下所討論的GDF-8自體疫苗的結構是不存在問題的。最常應用於GDF-8自體疫苗構建的表達系統有大腸桿菌、酵母P.pastoris、CHO細胞、以及昆蟲細胞如我們上面提到的果蠅細胞。
實施例一疫苗設計本發明的基本原則是用外源或人工合成的T細胞表位取代靶蛋白中胺基酸殘基的側鏈，如破傷風毒素T細胞表位P2和P30。優選的這些取代僅僅最低程度打亂了靶蛋白的三維空間結構。
這裡所指的靶蛋白是指GDF-8 C端的109個胺基酸殘基，其同源二聚體形式被認為是GDF-8的生物活性形式。GDF-8這一區域的三維結構目前仍未知，但根據同源TGF-β蛋白結構，單體GDF-8的模型見圖2，此結構預期接近於真正結構。在野生型GDF-8模型中，α-螺旋呈現圓筒形，β-片層呈現箭型。半胱氨酸殘基和相對應的二硫鍵在結構中位置很靠近。
值得注意的是在GDF-8 C端的109個胺基酸殘基中有相對較多數量的半胱氨酸(9個)以及因此形成的二硫鍵，限制了外源T細胞表位所能處的可能的位置。
除了製備無替代的GDF-8 C端的109個胺基酸殘基(即第1-10個序列號中殘基267-375)，下列GDF-8自身疫苗結構也需指出GDF-8 P2-1(序列號15)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基18-32被P2取代。
GDF-8 P2-2(序列號16)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基52-66被P2取代。
GDF-8 P2-3(序列號17)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基83-97被P2取代。
GDF-8 P30-1(序列號18)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基21-41被P30取代。
GDF-8 P30-2(序列號19)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基49-69被P30取代。
GDF-8 P30-3A(序列號20)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基79-99被P30取代。
GDF-8 P30-3B(序列號21)GDF-8 C端的109個胺基酸殘基84-104被P30取代。
GDF-8二聚體(序列號22)兩個GDF-8 C端的109個胺基酸殘基通過P2和P30表位共價鍵連接。換句話說，此分子包括兩半，一半是GDF-8 C端的109個胺基酸殘基的P2融合入其C端，另一半是GDF-8 C端的109個胺基酸殘基的P30融合入其N端。
GDF-8 ext(序列號23)包括GDF-8 C端的160個胺基酸殘基的第16-36殘基被P30取代，第37-51殘基被P2取代。這個結構是將GDF-8C端的109個胺基酸殘基在它的N端都含有P2和P30表位。
在所有可以模仿的結構中，除了最後第二種，都是企圖通過產生變體，其中以絲氨酸Ser取代半胱氨酸Cys 73，以避免通過二硫鍵形成二聚體。在GDF-8 ext中也企圖在相應位置(即Cys 124→Ser124)實現類似的取代。
實施例2體外模型我們預期最初用上述純化的GDF-8變體來免疫小鼠。在例如三次免疫以後，以未經修飾的GDF-8分子做抗原用ELISA方法測定。做這些預實驗的主要理由是想證明AUTOVACTM技術可以用於產生抗GDF-8交叉反應自身抗體，更重要的是確定一個最佳劑量和免疫治療方案。然而，利用當前技術不能產生抗GDF-8的抗體將是十分奇怪的，因為這一反應的基本免疫機制更象是與已經證實了的TNFα相同(WO98/46642及WO 95/05849)。
實施例3體內模型每組小鼠用實例1中描述的不同結構的多肽免疫，小鼠在第4周開始免疫，因為此時小鼠對疫苗具有可免疫性。實驗要用到弗羅因德的完全佐劑，或者也可以用到類似AdjuphosTM的鋁佐劑，該佐劑以前曾成功地應用於TNFα自身疫苗構建的混合物中。AdjuphosTM鋁劑既可用於人類又可用於動物。在整個免疫階段，要定期對GDF-8免疫的小鼠及對照組小鼠的體重進行監測。當小鼠接近16周齡時，處死並測定肌肉重量。
因為小鼠處於可免疫但又不是完全成熟的時期相對較短，在這些動物體內證明抗GDF-8的疫苗的效果可能十分困難。如果發生這種情況時，可以嘗試用大鼠代替，或其它大點的動物如豬、牛等。
那些能夠顯著增加動物生長率和/或顯著增加肌肉的最大重量的GDF-8修飾體可以選擇性的用於向臨床發展。
序列表110ME生物工程A/S120下調GDF-8活性的方法130AutoVacGDF-8 DK 116023170PatentIn Ver.2.12101211375212PRT213人類4001Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1 5 10 15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu65 70 75 80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys245 250 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 3752102211362212PRT213Meleagris gallopavo4002Met Gln Ile Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro1 5 10 15-Thr Glu Asn Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg20 25 30Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu35 40 45Ser Lys Leu Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile50 55 60Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln65 70 75 80Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp85 90 95Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser100 105 110Asp Phe Leu Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys115 120 125Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp130 135 140Ile Tyr Leu Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile145 150 155 160Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile165 170 175Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser180 185 190Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser195 200 205Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu210 215 220Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu225 230 235 - 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160
權利要求
1.一種在體內下調動物包括人類生長分化因子8(GDF-8)活性的方法，所述的方法包括給動物免疫系統有效提呈免疫上有效數量的- 至少一種GDF-8多肽或其亞序列，用GDF-8多肽或其亞序列免疫動物能誘導產生抗GDF-8多肽抗體，和/或- 至少一種GDF-8類似物，其中在GDF-8胺基酸序列上至少引入一個修飾，使用該類似物免疫動物會誘導產生抗GDF-8多肽的抗體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中對GDF-8胺基酸序列進行至少一個修飾產生的GDF-8類似物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述的修飾的結果是保留GDF-8的B-細胞表位的實質部分和- 至少引入一個外源T輔助淋巴細胞表位(TH表位)，和/或- 至少引入一個第一部分基團，影響修飾的分子與抗原提呈細胞(APC)或B-淋巴細胞靶向作用，和/或- 至少引入一個第二部分基團，激活免疫系統，和/或- 至少引入一個第三部分基團，以更好地向免疫系統提呈被修飾的GDF-8多肽。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的修飾包括通過共價或非共價鍵與GDF-8或其亞序列上適宜的化學基團相連，引入作為側基團的外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分基團。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中所述的修飾包括胺基酸的替代和/或缺失和/或插入和/或添加。
6.根據權利要求5所述的的方法，其中所述的修飾的結果是產生一個融合多肽。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述引入的胺基酸替代和/或缺失和/或插入和/或添加，其結果實質上是要保留GDF-8的整體三級結構。
8.根據權利要求2-7的任何一項所述的方法，其中所述的修飾包括複製至少一個GDF-8 B-細胞表位和/或引入一個半抗原。
9.根據權利要求3-8的任何一項所述的方法，其中所述的外源T-細胞表位在動物中是免疫顯性的。
10.根據權利要求3-9的任何一項所述的方法，其中所述的外源T-細胞表位是混雜的，同自然混雜的T-細胞表位以及人工MHC-II結合肽序列一樣。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述的自然T-細胞表位選自破傷風類毒素表位如P2或P30，白喉毒素表位，流感病毒血球凝集素毒素，和P.falciparum CS表位。
12.根據權利要求3-11中的任一項所述的方法，其中所述的第一部分基團實質上是一個對B淋巴細胞特異的表面抗原或是對APC特異的表面抗原特異結合的配體，例如一個半抗原或是碳水化合物，在B淋巴細胞或APC上有一個它們的受體，如甘露聚糖或甘露糖。
13.根據權利要求3-12中的任一項所述的方法，其中所述的第二部分基團選自細胞因子，激素或熱休克蛋白。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的細胞因子選自下列因子或是作為下列因子的有效成分幹擾素γ(IFN-γ)，F1t3L，白細胞介素1(IL-1)，白細胞介素2(IL-2)，白細胞介素4(IL-4)，白細胞介素6(IL-6)，白細胞介素12(IL-12)，白細胞介素13(IL-13)，白細胞介素15(IL-15)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；其中所述的熱休克蛋白是從包括HSP70，HSP90，HSC70，GRP94和鈣網硬蛋白(calreticulin(CRT))，或有效成分中選擇。
15.根據權利要求3-14中的任一項所述的方法，其中所述的第三部分基團是脂質性質的，如棕櫚醯基，肉豆寇基，法尼基，香葉-香葉基，GPI錨，以及一個N-乙醯雙甘油酯基。
16.根據上述權利要求中的任何一項所述的方法，其中所述的GDF-8亞序列或GDF-8類似物來源於GDF-8的C末端，活性形式的GDF-8如亞序列或類似物可以選自牛，豬，人，雞，羊或火雞的GDF-8多肽。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的GDF-8多肽可通過以下修飾在序列號為11或12處的胺基酸序列至少有一個被一相同或不同長度的含有外源TH表位的胺基酸序列所替代；其中被替代的胺基酸序列包括序列號為11或12的殘基1-12，18-41，43-48，49-69或79-104；或其中GDF-8多肽可由插入至少一個含有外源TH表位的胺基酸序列修飾，其中所述的插入在序列號為11或12中的位置1-12，18-30，42-51，82-86和105-109中的任一個進行。
18.根據上述任一項權利要求所述的方法，其中所述的對免疫系統的提呈是通過至少兩份GDF-8多肽，或其亞序列或修飾的GDF-8多肽與一個可以有效地提呈多備份抗原決定簇的載體分子共價非共價相連拷貝來完成的。
19.根據上述任一項權利要求所述的方法，其中所述的給予動物以有效劑量的GDF-8多肽或GDF-8多肽類似物的方法選自腸道外途徑，如真皮內，真皮下，皮內，皮下和肌內；腹膜；口服；口腔；舌下；硬腦膜；脊髓；肛門；和顱骨內。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的GDF-8多肽，其亞序列或其類似物的有效劑量為0.5μg到2000μg之間。
21.根據權利要求19或20所述的方法，包括每年服用GDF-8多肽或類似物至少一次，如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次和至少12次。
22.根據權利要求19-21中的任何一項所述的方法，其中所述的GDF-8多肽，其亞序列，或GDF-8修飾體可選擇性的與藥學上及免疫學上可接受的載體和/或工具配方，也可與促進打破對自身抗原的自身耐受性的佐劑配方，如選自以下基團的佐劑包括免疫靶向佐劑；免疫調節佐劑如毒素，細胞因子以及一種分支桿菌衍生物；油性製劑；聚合體；膠粒形成的佐劑；皂甙；免疫刺激複合物基質(一種ISCOM基質)；微粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉以及包裹佐劑。
23.根據權利要求20-22中的任一項所述的方法，其中所述的GDF-8多肽或類似物包含在一種虛擬淋巴結(VLN)裝置中。
24.根據權利要求1-18中的任一項所述的方法，其中將編碼修飾的GDF-8的核酸導入動物細胞以及由此獲得的導入核酸在細胞內的表達影響所述的修飾GDF-8對免疫系統的提呈。
25.根據權利要求24所述的方法，其中導入的核酸選自裸DNA，DNA與帶電荷或不帶電荷的脂質形成的複合物，DNA與脂質體形成的複合物，病毒載體中包含的DNA，DNA與一種轉染易化蛋白或多肽形成的複合物，DNA與靶向蛋白或多肽形成的複合物，DNA與鈣沉澱試劑形成的複合物，DNA偶聯於一種惰性載體分子，DNA與幾丁質或脫乙醯幾丁質形成的複合物以及DNA與一種佐劑形成的複合物。
26.根據權利要求24或25所述的方法，其中所述的核酸是通過動脈內，靜脈內或權利要求19所述的方法給藥。
27.根據權利要求24或25所述的方法，其中所述的核酸包含於一種虛擬淋巴結(VLN)裝置中和/或按照權利要求22所述的方法配製。
28.根據權利要求25-27中任一項所述的方法，包括每年給予至少一次核酸，如每年給予至少2次，至少3次，至少4次，至少6次以及至少12次。
29.一種以增加動物肌肉質量為目的方法，該方法包括依據權利要求1-28中任一項所述的方法下調GDF-8活性，與表現正常GDF-8活性的動物相比，使肌肉重量至少增加至5％的程度，如至少增加10，15，20，25，30，35，40及45％的情況。
30.衍生於動物GDF-8多肽的一種GDF-8類似物，其中引入一處修飾，該類似物免疫動物誘導產生抗GDF-8多肽的抗體，如權利要求1-18中的任一項所述的修飾。
31.一種免疫源性組合物，包括免疫有效量的某種動物自身的GDF-8多肽，該GDF-8多肽與一種免疫學上可以接受的佐劑一起配方以打破動物對GDF-8多肽的自身耐受性，該組合物還含有藥學和免疫學上可以接受的的載體和/或工具。
32.一種免疫源性組合物包含權利要求29所述的一種免疫有效量的GDF-8類似物，該還含有製藥學及免疫學上可以接受的的載體和/或工具以及適當的佐劑。
33.根據權利要求31或32所述的免疫源性成分，其中所述的佐劑選自權利要求22所述的佐劑群體。
34.根據權利要求29所述的編碼GDF-8類似物的核酸片段。
35.一種攜帶根據權利要求34所述的核酸片段的載體，如一種能自主複製的載體。
36.根據權利要求35所述的載體選自質粒，噬菌體，粘粒，微染色體及病毒。
37.根據權利要求35或36所述的載體，包含，在5』→3』方向的可操作的連接上，一個啟動子以啟動權利要求34的核酸片段的表達，可選用的一段編碼前導肽的，分泌或整合進入多肽片段生物膜的核酸序列，如權利要求34所述的核酸序列以及可選用的終止子。
38.根據權利要求41-44中的任何一項所述的載體，當導入宿主細胞時，或者可以整合進入宿主細胞基因組或者不能整合進入宿主細胞基因組。
39.根據權利要求37或38所述的載體，其中所述的啟動子啟動真核細胞或原核細胞內的表達。
40.一種攜帶權利要求35-39中任一項所述載體的轉化細胞，如能複製權利要求34所述的核酸片段的轉化細胞。
41.根據權利要求40所述的轉化細胞，是一種微生物體，來自於細菌，比如埃希桿菌(優選大腸桿菌)，芽胞桿菌，沙門菌或分支桿菌(優選非致病性分支桿菌細胞，如M.bovis BCG)，酵母，原生動物或者來自於多細胞有機體的細胞如真菌，昆蟲細胞如S2或SF細胞，植物細胞以及哺乳動物細胞。
42.根據權利要求40或41所述的轉化細胞，能表達權利要求34所述的核酸片段，如在其表面分泌或攜帶權利要求30所述GDF-8類似物的轉化細胞。
43.根據權利要求1-18任何一項所述的方法，其中給予攜帶編碼及表達GDF-8多肽或類似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒會影響對免疫系統的提呈。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述的病毒是一種無致病力的痘病毒，如牛痘病毒，或其中所述的微生物是細菌，如權利要求41所述的細菌。
45.根據權利要求43或44的任何一項所述的方法，其中所述非致病性微生物或病毒單次給予動物。
46.一種誘導抗GDF-8抗體產生的組合物，該組合物包含- 如權利要求34所述的核酸片段，或如權利要求35-39任一項所述的的載體，以及- 藥學及免疫學上可以接受的載體和/或工具和/或佐劑。
47.根據權利要求46所述的組合物，其中所述的核酸片段根據權利要求25或27配製的。
48.一種攜帶權利要求35-39任一項所述載體的細胞系，它表達權利要求34所述的核酸片段，在其表面選擇性分泌或攜帶如權利要求30所述的GDF-8類似物。
49.一種製備根據權利要求40-42的任何一項所述的細胞的方法，該方法包括用權利要求34所述的核酸片段或權利要求35-39中任一個所述的載體轉化宿主細胞。
50.一種鑑定修飾的GDF-8多肽的方法，該多肽可以在動物體內誘導抗非修飾GDF-8的抗體，該動物體內非修飾GDF-8多肽是自體蛋白，該方法包括- 通過多肽合成或基因工程技術製備一系列各不相同的修飾的GDF-8多肽，其中將特定胺基酸添加，插入，缺失或替代入某種動物GDF-8多肽胺基酸序列，從而增加該系列含外源性T細胞表位多的胺基酸序列，- 檢測該系列成員的誘導特定動物的抗未修飾GDF-8多肽抗體產生的能力，以及- 分離可以顯著誘導針對特定動物的抗未修飾GDF-8多肽抗體產生的該系列成員。
51.一種製備免疫源性組合物的方法，該免疫源性組合物包含至少一種修飾的GDF-8多肽，它可以誘導某種動物產生抗未修飾GDF-8的抗體，對這種動物來說未修飾GDF-8多肽是自體蛋白，該方法包括- 通過多肽合成或基因工程技術製備一系列各不相同的修飾的GDF-8多肽，其中將特定胺基酸添加，插入，缺失或替代入某種動物GDF-8多肽胺基酸序列從而增加該系列含外源性T細胞表位多的胺基酸序列，- 檢測該系列成員的誘導特定動物的抗非修飾GDF-8多肽抗產生的能力，以及- 將可以顯著誘導某種動物產生可與GDF-8起反應的抗體的該系列成員與藥學及免疫學上可以接受的載體和/或工具混合，可選用與至少一種藥學及免疫學上可以接受的佐劑結合。
52.根據權利要求50或51指出的方法，其中所述的製備該系列成員包括製備各不同突變的核酸序列，每段序列都如權利要求34所指，將該核酸序列插入適當的表達載體，用該載體轉化合適的宿主細胞並表達該核酸序列，接著分離該表達產物。
全文摘要
本發明公開了通過免疫接種抗生長分化因子8(GDF－8,氯化筒箭毒鹼)的方法增加肌肉重量的新方法。影響免疫接種的優選方法是通過使用能誘導抗同源GDF－8抗體產生的GDF－8類似物。尤其優選的免疫原是通過引入一種或多種外源、免疫顯性以及有前途的T細胞表位,同時保留同源GDF－8的三級結構的修飾的同源GDF－8。本發明還公開了抗GDF－8的核酸疫苗和使用活疫苗的疫苗,以及有利於接種的方法和手段。所述的方法和手段包括識別有用的免疫原性GDF－8類似物的方法,製備類似物和製藥學配方的方法,以及核酸片段、載體、轉化細胞、多肽和製藥學配方。
文檔編號C12N15/12GK1384757SQ00810614
公開日2002年12月11日 申請日期2000年7月20日 優先權日1999年7月20日
發明者T·哈爾基爾, S·莫裡特森, S·克雷斯納 申請人:法麥克薩有限公司