抑制上皮性卵巢癌腫瘤生長的siRNA及其重組載體與應用的製作方法

2023-11-03 02:22:07 1

專利名稱：抑制上皮性卵巢癌腫瘤生長的siRNA及其重組載體與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種可以抑制上皮性卵巢癌特異性相關基因表達的幹擾序列及其重組載體，以及在製備治療上皮性卵巢癌藥物中的應用。
背景技術：
上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer, EOC)是最常見的卵巢癌，約佔80-90%，在婦科生殖器官惡性腫瘤中，雖然發病率位居第三，僅次於宮頸癌與子宮內膜癌，但死亡率高達70%，居首位。據統計，女性一生中發生卵巢癌的危險率約1.45%，死於卵巢癌的危險性為1%。由於卵巢解剖位置複雜，位於盆底深部，這給卵巢癌的早期診斷造成諸多困難。目前EOC的治療以手術為主,輔以放化療等。但由於轉移前常無症狀,多數EOC在確診時已屬於晚期，致使手術難度高、範圍廣，病灶往往不能全部清除，再加上放化療作用局限，導致術後復發率高，預後極差。據近20年的統計資料，EOC的發病率逐年遞增，但治療效果一直未能改善，5年生存率徘徊於30-40%。EOC已成為嚴重威脅婦女生命和健康的主要腫瘤，如何改善EOC的治療效果是婦科腫瘤學家面臨的最嚴峻挑戰之一。大量文獻報導，分子靶向藥物和化療聯合應用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。2003年,Rangel等人利用SAGE資料庫分析、基因克隆、Northern Blot、RACE技術等，在EOC組織中發現一個特異性轉錄本H0ST2(Rangel L.B., Sherman-Baust C.A., WernyjR.P., Schwartz D.R., Cho K.R.，Morin P.J..Characterization of novel human ovariancancer-specific transcripts (HOSTs) identified by serial analysis of geneexpression.0ncogene.2003，22 (46): 7225-7232.)。H0ST2 長度約 3000 個鹼基，沒有開放式可讀框，不能編碼蛋白質，屬於長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA，LncRNA)。長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA, LncRNA)是一類長度大於200個鹼基的功能性RNA分子，佔人類基因組4-9%，缺乏編碼蛋白的能力，在多種層面上調控其他基因的表達，參與細胞內諸多生物過程。目前許多研究表明，LncRNA廣泛參與機體多種生理病理過程，其特異性表達和/或表達變化與惡性腫瘤的發生發展密切相關(Lee，J.T..Epigenetic regulation by long noncoding RNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.)。目前有文獻報導，LncRNA特異性表達可作為治療腫瘤潛在靶點，如肝細胞性肝癌中
的 LncRNA-MVIHCYuanj S.X.，Yang, F.，Yangj Y.，Taoj Q.F.，Zhang, J.，Huang, G.，Wang, R.Y.，Yang, S.，Huoj X.S.，Zhang, L.，Wang F.，Sun S.H.，Zhou W.P..Long noncodingRNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinomapromotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinomapatients』poor recurrence-free survival after hepatectomy.Hepatology.2012.56(6):2231-2241.)。但目前尚無H0ST2的深入研究報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列，並構建含有抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列的重組載體，本發明的另一目的是提供該siRNA2和重組載體在製備治療上皮性卵巢癌藥物中的應用。本發明的第一方面，是尋找能抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列。本發明人通過大量前期工作發現:H0ST2與上皮性卵巢癌的增殖和遷移這兩個腫瘤生長相關的生物學功能密切相關。首先，我們以卵巢良性腫瘤(Benign Ovarian Tumor, OBT)組織為對照組(43例，採集自201(Γ2012年上海市長海醫院婦科收治的OBT患者手術標本)，以同期採集的確診為EOC患者的術中標本為實驗組(39例)，驗證了 H0ST2在EOC組織中表達的特異性，符合上述2003年文獻報導(圖1)。然後，設計、合成並篩選H0ST2特異性的高效幹擾序列SiRNAf 3，分別轉染進0VCAR-3上皮性卵巢癌細胞中，結果發現siRNA2抑制H0ST2表達的幹擾效果最明顯(圖2);本發明提供了一種抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列(siRNA2)，其序列如下:正義鏈5』 -GACUAAACAAG⑶CUUAA UUU-3』 (SEQ ID NO:4)反義鏈5』 -AUUAAGACCUUGUUUAGUCUU-3』 (SEQ ID NO:5)。本發明的第二方面，是構建含有抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列的重組載體，該重組載體採用真核表達載體pLK0.1puro ο構建方法如下:1、合成 H0ST2_sh2 片段；選擇合適的酶切位點Age I和EcoR I，根據該siRNA2的序列，設計其shRNA2序列如下，構建到真核表達載體pLK0.1puro中。正義鏈5』 CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG3』 (SEQ ID NO:8)反義鏈5' AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG —ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A3』 (SEQ ID NO:9)2、退火得到H0ST2_sh2cDNA基因片段；3、用真核表達載體pLK0.1puro構建pLK0.l-H0ST2_sh2重組表達載體(圖3和4)，經典分子生物學方法參見《分子克隆實驗指南》，美國冷泉港出版社。進一步地，本發明還將pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒轉染入0VCAR-3細胞並且利用G418加壓篩選，建立0VCAR-3/H0ST2-sh2T真核表達細胞株。具體方法為:將以上重組載體轉染入美國培養物保存中心(ATCC)建系的0VCAR-3上皮性卵巢癌細胞中，然後加G418 (氨基糖苷類抗生素)篩選兩次，每次挑取單克隆大量擴增0VCAR-3細胞，最終得到較高純度的0VCAR-3/H0ST2-sh2T。本發明的第三方面，提供了上述的siRNA2和重組載體在製備治療上皮性卵巢癌藥物中的應用。本發明將構建的重組載體轉染EOC細胞，抑制EOC細胞的生長，以達到治療EOC的目的。體外實驗:通過脂質體轉染的方式，將pLK0.1_sh2轉入0VCAR-3細胞中，利用細胞劃痕實驗、Transwe11實驗和CCK-8檢測，發現細胞的遷移和增殖能力均明顯下降(圖5_7)。
體內試驗，建立EOC裸鼠模型後，待腫瘤生長至直徑約5mm時，定期將上述質粒直接打入異種移植的瘤體內，最終發現腫瘤生長明顯受限，甚至可以逆轉縮小。裸鼠異種移植瘤模型的構建及相關實驗技術和方法，申請人已發表相關文章(Hu T.，Liu S.,Breiter
D.R.，Wang F.，Tang Y.，Sun S..0ctamer4Small Interfering RNA Results in CancerStem Cell-Like Cell Apoptosis.Cancer Res.2008.68 (16):6533-6540.)。通過體內、體外實驗結果證明:本發明的重組載體可以抑制EOC細胞中特異性高表達的H0ST2，從而抑制腫瘤生長。因此本發明提供的siRNA2和重組載體為臨床治療EOC提供了新的基因治療藥物。


圖1:E0C患者和OBT患者術中標本組織中H0ST2的相對表達量。圖2:H0ST2特異性幹擾序列siRNAl_3最佳幹擾效果篩選。圖3:pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒及插入酶切位點示意圖。圖4:小發卡shRNA示意圖。U6啟動子知道下遊小發卡shRNA的轉錄。序列包括21個siRNA2正義鏈鹼基，「Loop」為酶切位點識別序列，21個siRNA反義鏈鹼基。圖5:轉染pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒前後細胞劃痕癒合情況，其中A為空白對照組；B為轉染pLK0.l-H0ST2_sh2重組質粒的細胞。圖6:轉染pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒前後細胞遷移過膜的細胞個數統計。其中A為100倍電鏡或光鏡圖；B為遷移過膜的細胞個數統計圖。

圖7:轉染pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒前後細胞增殖曲線。圖8:0VCAR-3細胞株和0VCAR-3/H0ST2_sh2T細胞株中H0ST2的相對表達量。圖9:pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒注射與未注射組裸鼠異種瘤體大小比較。圖10:pLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒注射與未注射組裸鼠的生存期比較。
具體實施例方式現結合實施例和附圖，對本發明作進一步描述，但本發明的實施並不僅限於此。實施例1:構建pLK0.l-H0ST2-sh2真核表達載體1.1所需試劑限制性內切酶Age I和EcoR I及相應Buffer、T4連接酶及其緩衝液、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購於TaKaRa公司(大連寶生物工程有限公司)。真核表達載體選擇常規RNAi載體pLK0.1puro (Plasmid8453)，源於全球科學家質粒共享非盈利組織Addgene01.2設計、合成並篩選H0ST2的特異性siRNA。H0ST2cDNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。根據上述序列設計併合成特異性siRNAl-3 (均由上海Invitrogen公司完成):
權利要求
1.一種抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列，其RNA序列如SEQ ID N0:4或5所示。
2.一種含有如權利要求1所述的抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列的重組載體。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特徵在於，該重組載體採用真核表達載體pLK0.1puro 構建。
4.根據權利要求3所述的重組載體，其特徵在於，構建方法如下: A、合成H0ST2-sh2片段； 選擇合適的酶切位點Age I和EcoR I，根據該siRNA2的序列，設計其shRNA2序列如下: 正義鏈 5』 CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG3』 (SEQ ID NO:8) 反義鏈 5』 AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A3，(SEQ ID N0:9)； B、退火得到H0ST2-sh2cDNA基因片段； C、用真核表達載體pLK0.1puro構建pLK0.l-H0ST2_sh2重組表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於，構建pLK0.l-H0ST2-sh2重組表達載體後，將PLK0.l-H0ST2-sh2重組質粒轉染入0VCAR-3細胞並且利用G418加壓篩選，建立0VCAR-3/H0ST2-sh2T真核表達細胞株。
6.一種抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表達的幹擾序列在製備治療上皮性卵巢癌藥物中的應用。
7.—種如權利要求2至5任一所述的重組載體在製備治療上皮性卵巢癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域，上皮性卵巢癌(EOC)是最常見的卵巢癌，在婦科生殖器官惡性腫瘤中，雖然發病率位居第三，僅次於宮頸癌與子宮內膜癌，但死亡率高達70%，居首位。本發明篩選到一種抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表達的幹擾序列，其RNA序列如SEQ ID NO:4或5所示。本發明還構建了含有該幹擾序列的重組載體。本發明的重組載體通過體內、體外實驗結果證明，可以抑制EOC細胞中特異性高表達的HOST2，從而抑制腫瘤生長。本發明提供的siRNA和重組載體為臨床治療EOC提供了新的基因治療藥物。
文檔編號A61P35/00GK103146703SQ20131006475
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者劉善榮, 惠寧, 高原, 劉淑鵬, 餘喜亞, 胡晶晶 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學