一種球孢白僵菌的培養方法與流程
2023-06-15 02:44:56
本發明涉及一種球孢白僵菌的培養方法。
背景技術：
白僵菌是一種子囊菌類的蟲生真菌，主要種類包括球孢白僵菌和布氏白僵菌等，常通過無性繁殖生成分生孢子，菌絲有橫隔有分枝。白僵菌可以侵入6個目15科200多種昆蟲、蟎類的蟲體內大量繁殖，同時產生白僵素(非核糖體多肽類毒素)、卵孢黴素(苯醌類毒素)和草酸鈣結晶，這些物質可引起昆蟲中毒，打亂新陳代謝以致死亡。其中，球孢白僵菌為子囊菌類的真菌，可工業化培養生產，人們利用其產生的分子孢子可加工成微生物殺蟲劑；也可以通過球孢白僵菌侵染家蠶得到中藥白僵蠶。
現有的球孢白僵菌培養基的成分比較單一，對促進球孢白僵菌的生長效果不佳，針對球孢白僵菌的生長過程進行的設計較少，在培養過程中易受雜菌汙染，因此，得到的球孢白僵菌分生孢子的質量不穩定，毒力較弱，繁殖周期較長。
技術實現要素：
有鑑於此，本申請提供一種球孢白僵菌的培養方法，通過每個階段中培養基組分的篩選和配比，同時配合培養的溫度和溼度條件，可以縮短培養周期，提高球孢白僵菌分生孢子的質量和產量，提高分生孢子的活性。
為解決以上技術問題，本發明提供的技術方案是一種球孢白僵菌的培養方法，所述培養方法包括以下步驟：
(1)一級斜面培養：將球孢白僵菌菌體接種於一級斜面培養基中，在24-25℃培養5-6天；
(2)二級液體培養：將步驟(1)培養後得到的菌種接種至種子罐中，在24-25℃培養24-28h，所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10-20％蛋白腖、5-10％尿素、5-20％蔗糖、10-15％麥麩、0.1-0.5％磷酸二氫鉀、0.01-0.05％硫酸鎂、0.01-0.05％維生素B、0.01-0.05％維生素C、0.01-0.02％硫酸鋅、0.01-0.02％硫酸銅、0.05-0.1％氯化鐵、0.05-0.1％氯化鈣；
(3)三級液體擴大培養：將步驟(2)培養後得到的菌種接種至發酵罐中，在25-28℃培養28-32h，所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10-20％蛋白腖、10-20％蔗糖、10-20％黃豆粉、0.1-0.5％磷酸二氫鉀、0.05-0.1％硫酸鎂、0.02-0.05％維生素B、0.01-0.02％維生素C、0.05-0.15％氯化鈣、0.2-1.0％海藻酸鈉；
(4)四級固體培養：將步驟(3)擴大培養後的菌種接種到固體培養基中，在22-25℃下培養5-6d，所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩20-30份、蠶蛹粉10-20份、黃豆粉10-20份、維生素B 1-3份、維生素C1-2份、蔗糖2-10份、米糠20-40份。
優選的，步驟(1)所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉20-30份、蛋白腖1-2份、乳糖5-10份、蔗糖1-5份、磷酸二氫鉀0.05-0.1份、硫酸鎂0.05-0.1份、瓊脂1-2份。
更為優選的，步驟(1)所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉25份、蛋白腖1份、乳糖8份、蔗糖3份、磷酸二氫鉀0.08份、硫酸鎂0.06份、瓊脂2份。
優選的，步驟(2)所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充18％蛋白腖、7％尿素、15％蔗糖、13％麥麩、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、0.04％維生素B、0.02％維生素C、0.015％硫酸鋅、0.018％硫酸銅、0.08％氯化鐵、0.07％氯化鈣。
優選的，步驟(3)所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充15％蛋白腖、18％蔗糖、17％黃豆粉、0.3％磷酸二氫鉀、0.07％硫酸鎂、0.04％維生素B、0.03％維生素C、0.10％氯化鈣、0.8％海藻酸鈉。
優選的，步驟(2)和步驟(3)中，所述維生素B為維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6中的至少一種。
更為優選的，步驟(2)和步驟(3)中，所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:(1-2):(1-2)。
更為優選的，步驟(2)和步驟(3)中，所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1.5:1.8。
優選的，步驟(1)所述斜面培養基在接種前先調節pH值至6.5-6.8，再在壓力為100-110kPa下保壓滅菌40-60min。
優選的，步驟(4)所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩25份、蠶蛹粉15份、黃豆粉15份、維生素B 2份、維生素C2份、蔗糖7份、米糠30份。
優選的，步驟(4)中四級固體培養的溼度為95-98％。
優選的，步驟(4)中固體培養基的厚度為5-6cm，液固接種的比例為1:(1.2-1.3)。
優選的，步驟(4)四級固體培養至固體培養基上長滿分生孢子後，即可進行乾燥處理。
所述的PDA培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的簡稱，即Potato Dextrose Agar Medium。其做法是：稱取200g洗淨去皮的馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20—30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八層紗布過濾，加熱，再根據實驗需要加1—10g瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完後，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻後再補足水分至1000毫升，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包紮，115℃滅菌20分鐘後取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻後即得。
在本申請技術方案中，所述的球孢白僵菌的培養包括了一級斜面培養、二級液體培養、三級液體擴大培養、四級固體培養的步驟，通過一級斜面培養，得到球孢白僵菌菌種，控制斜面培養基的組分和配比，並添加菌種生長所需元素鉀和鎂，同時控制培養的溫度在24-25℃之間，加快菌種的生長；通過二級液體培養，使菌種數量迅速提高，其液體培養基的組分包括了菌種生長所必須的碳源、氮源，還增加了磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鐵、氯化鈣，提供菌體生長所需元素，同時還增加了維生素B和維生素C，二者可以提高菌體生長速度，提高菌體數量，以上復配可以大大提高菌種的生長速度，提高菌種數量，此外，維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的復配，能夠提高保證菌種活性，並提高菌種的生長速度；經過三級液體擴大培養，菌種繼續生長，數量增加，同時菌種生成菌絲體，其液體擴大培養基的組分包括了菌種生長所必須的碳源、氮源，還增加了促進菌絲體生長磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣，同時還增加了維生素B和維生素C，二者可以提高菌體以及菌絲體生長速度，維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的復配，能夠提高保證菌絲體活性，此外，所述的液體擴大培養基中還添加了海藻酸鈉，能夠提高液體的粘度，有利於培養基組分的懸浮，提高培養基中組分的利用率，同時通過其配比的調整，使培養基粘度控制在適應範圍，避免液體晃動時，菌絲體隨之晃動產生拉扯，破壞菌絲體；通過四級固體培養，分生孢子大量生成，此時可以將其進行乾燥，得到所需的球孢白僵菌孢子粉，在固體培養基中，添加了麥麩、蠶蛹粉、黃豆粉、米糠、蔗糖，為菌絲體以及分生孢子提供碳源和氮源，同時麥麩、黃豆粉、米糠稀鬆的質地，具有較好的保溼性和透氣性，提供溼潤和透氣的環境，有利於菌絲體的快速繁殖和產孢，此外，還加入了維生素B和維生素C，能夠加快菌絲體產孢的速度，同時與蠶蛹粉的復配可以提高分生孢子的活性。
與現有技術相比，本申請技術方案所述的球孢白僵菌的培養方法，包括一級斜面培養、二級液體培養、三級液體擴大培養、四級固體培養，通過每個階段中培養基組分的篩選和配比，同時配合培養的溫度和溼度條件，可以縮短培養周期，提高球孢白僵菌分生孢子的質量和產量，提高分生孢子的活性。
具體實施方式
為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，所述培養方法包括以下步驟：
(1)一級斜面培養：將斜面培養基調節pH值至6.8，再在壓力為105kPa下保壓滅菌50min，冷卻後，將球孢白僵菌菌體接種於一級斜面培養基中，在25℃培養5天，所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉25份、蛋白腖1份、乳糖8份、蔗糖3份、磷酸二氫鉀0.08份、硫酸鎂0.06份、瓊脂2份；
(2)二級液體培養：將步驟(1)培養後得到的菌種接種至種子罐中，在25℃培養26h，所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充18％蛋白腖、7％尿素、15％蔗糖、13％麥麩、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％硫酸鎂、0.04％維生素B、0.02％維生素C、0.015％硫酸鋅、0.018％硫酸銅、0.08％氯化鐵、0.07％氯化鈣；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1.5:1.8；
(3)三級液體擴大培養：將步驟(2)培養後得到的菌種接種至發酵罐中，在28℃培養30h，所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充15％蛋白腖、18％蔗糖、17％黃豆粉、0.3％磷酸二氫鉀、0.07％硫酸鎂、0.04％維生素B、0.03％維生素C、0.10％氯化鈣、0.8％海藻酸鈉；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1.5:1.8；
(4)四級固體培養：將步驟(3)擴大培養後的菌種接種到固體培養基中，在24℃下培養5d，控制四級固體培養的溼度為96％，所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩25份、蠶蛹粉15份、黃豆粉15份、維生素B 2份、維生素C2份、蔗糖7份、米糠30份；其中，固體培養基的厚度為5.5cm，液固接種的比例為1:1.2，四級固體培養至固體培養基上長滿分生孢子後，即可進行乾燥處理，乾燥處理後，採用旋風分離集孢器進行孢子抽提，得到球孢白僵菌孢子粉。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.8×1010/g，孢子萌發率為96％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)4天，松毛蟲出現死亡高峰，7天松毛蟲死亡率達95％。
實施例2
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉20份、蛋白腖1份、乳糖5份、蔗糖1份、磷酸二氫鉀0.05份、硫酸鎂0.05份、瓊脂1份；
(2)二級液體培養：所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％蛋白腖、5％尿素、5％蔗糖、10％麥麩、0.1％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、0.01％維生素B、0.01％維生素C、0.01％硫酸鋅、0.01％硫酸銅、0.05％氯化鐵、0.05％氯化鈣；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1:1；
(3)三級液體擴大培養：所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％蛋白腖、10％蔗糖、10％黃豆粉、0.1％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、0.02％維生素B、0.01％維生素C、0.05％氯化鈣、0.2％海藻酸鈉；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1:1；
(4)四級固體培養：所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩20-30份、蠶蛹粉10份、黃豆粉10份、維生素B 1份、維生素C1份、蔗糖2份、米糠20份；其中，固體培養基的厚度為5.5cm，液固接種的比例為1:1.2。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.2×1010/g，孢子萌發率為95％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)6天，松毛蟲出現死亡高峰，8天松毛蟲死亡率達95％。
實施例3
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉30份、蛋白腖2份、乳糖10份、蔗糖5份、磷酸二氫鉀0.1份、硫酸鎂0.1份、瓊脂2份；
(2)二級液體培養：所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％蛋白腖、10％尿素、20％蔗糖、15％麥麩、0.5％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、0.05％維生素B、0.05％維生素C、0.02％硫酸鋅、0.02％硫酸銅、0.1％氯化鐵、0.1％氯化鈣；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:2:2；
(3)三級液體擴大培養：所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％蛋白腖、20％蔗糖、20％黃豆粉、0.5％磷酸二氫鉀、0.1％硫酸鎂、0.05％維生素B、0.02％維生素C、0.15％氯化鈣、1.0％海藻酸鈉；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:2:2；
(4)四級固體培養：所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩30份、蠶蛹粉20份、黃豆粉20份、維生素B3份、維生素C2份、蔗糖10份、米糠40份；其中，固體培養基的厚度為5.5cm，液固接種的比例為1:1.3。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.8×1010/g，孢子萌發率為97％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)4天，松毛蟲出現死亡高峰，8天松毛蟲死亡率達95％。
實施例4
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉20份、蛋白腖2份、乳糖5份、蔗糖5份、磷酸二氫鉀0.05份、硫酸鎂0.1份、瓊脂1份；
(2)二級液體培養：所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％蛋白腖、5％尿素、20％蔗糖、10％麥麩、0.5％磷酸二氫鉀、0.01％硫酸鎂、0.05％維生素B、0.01％維生素C、0.02％硫酸鋅、0.01％硫酸銅、0.1％氯化鐵、0.05％氯化鈣；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1:2；
(3)三級液體擴大培養：所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充20％蛋白腖、10％蔗糖、20％黃豆粉、0.1％磷酸二氫鉀、0.1％硫酸鎂、0.02％維生素B、0.02％維生素C、0.05％氯化鈣、1.0％海藻酸鈉；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:2:1；
(4)四級固體培養：所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩20份、蠶蛹粉20份、黃豆粉10份、維生素B 3份、維生素C1份、蔗糖10份、米糠20份；其中，固體培養基的厚度為5.5cm，液固接種的比例為1:1.3。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.6×1010/g，孢子萌發率為95％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)5天，松毛蟲出現死亡高峰，7天松毛蟲死亡率達95％。
實施例5
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：所述斜面培養基的組分按重量份數計包括：馬鈴薯澱粉30份、蛋白腖1份、乳糖10份、蔗糖1份、磷酸二氫鉀0.1份、硫酸鎂0.05份、瓊脂2份；
(2)二級液體培養：所述種子罐中的液體培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％蛋白腖、10％尿素、5％蔗糖、15％麥麩、0.1％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、0.01％維生素B、0.05％維生素C、0.01％硫酸鋅、0.02％硫酸銅、0.05％氯化鐵、0.1％氯化鈣；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:2:1；
(3)三級液體擴大培養：所述發酵罐中的液體擴大培養基的組分按重量百分比計包括：PDA培養基，補充10％蛋白腖、20％蔗糖、10％黃豆粉、0.5％磷酸二氫鉀、0.05％硫酸鎂、0.05％維生素B、0.01％維生素C、0.15％氯化鈣、0.2％海藻酸鈉；所述維生素B為維生素B2、維生素B3、維生素B6的組合物，所述維生素B2、維生素B3、維生素B6的重量比為1:1:2；
(4)四級固體培養：所述固體培養基的組分按重量份數計包括：麥麩30份、蠶蛹粉10份、黃豆粉20份、維生素B 1份、維生素C2份、蔗糖2份、米糠40份；其中，固體培養基的厚度為5.5cm，液固接種的比例為1:1.2。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.7×1010/g，孢子萌發率為95％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)5天，松毛蟲出現死亡高峰，6天松毛蟲死亡率達95％。
實施例6
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：將斜面培養基調節pH值至6.5，再在壓力為100kPa下保壓滅菌60min，冷卻後，將球孢白僵菌菌體接種於一級斜面培養基中，在24℃培養5天；
(2)二級液體培養：將步驟(1)培養後得到的菌種接種至種子罐中，在24℃培養24h；
(3)將步驟(2)培養後得到的菌種接種至發酵罐中，在25℃培養28h；
(4)四級固體培養：將步驟(3)擴大培養後的菌種接種到固體培養基中，在22℃下培養5d，控制四級固體培養的溼度為95％。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.6×1010/g，孢子萌發率為95％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)5天，松毛蟲出現死亡高峰，7天松毛蟲死亡率達95％。
實施例7
本實施例所述的一種球孢白僵菌的培養方法，除以下特徵外，其餘均與實施例1相同。
所述培養方法中：
(1)一級斜面培養：將斜面培養基調節pH值至6.8，再在壓力為110kPa下保壓滅菌40min，冷卻後，將球孢白僵菌菌體接種於一級斜面培養基中，在25℃培養5-6天；
(2)二級液體培養：將步驟(1)培養後得到的菌種接種至種子罐中，在25℃培養28h；
(3)將步驟(2)培養後得到的菌種接種至發酵罐中，在28℃培養32h；
(4)四級固體培養：將步驟(3)擴大培養後的菌種接種到固體培養基中，在25℃下培養6d，控制四級固體培養的溼度為98％。
本實施例中，採用上述培養方法得到的球孢白僵菌孢子粉，其含孢量為8.7×1010/g，孢子萌發率為96％，活孢率為98％；用松毛蟲3齡幼蟲進行孢子毒力的生物測定，噴菌後(孢子液0.1×108/mL濃度，溫度為20-28℃，溼度90％以上)4天，松毛蟲出現死亡高峰，6天松毛蟲死亡率達95％。
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護範圍應當以權利要求所限定的範圍為準。對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和範圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。