一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑及其製備方法與應用與流程

2024-04-08 16:05:05

本發明涉及一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑及其製備方法與應用，屬於生物防治領域。
背景技術：
：生薑莖基腐病是由腐黴菌侵染引起的一種土傳病害，是生薑生產主要的病害之一，嚴重影響生薑的產量及品質。近年來該病在國內部分生薑主要產區危害嚴重，並有發展蔓延的趨勢，一般發病率30％～80％，嚴重時部分地塊可絕產。該病從生薑出苗1～2個月開始發病，病菌在土壤中長期腐生，借水流、耕作等傳播，通過根莖傷口或直接從分枝裂縫及老化幼苗莖基部侵入，然後莖基部出現大小不等的水漬狀病斑，逐漸擴大，地上部莖葉仍為綠色，最後老葉變黃萎蔫，病斑環繞莖基部一周，導致莖基部組織逐漸腐爛；在發病嚴重時，基部變黑2～3天後，莖基部就完全腐爛，從老薑處齊斷，病株死亡，又稱為「爛脖子病」。生薑莖基腐病病原菌是卵菌綱，腐黴科，腐黴屬一種低等真菌，以腐生的方式在土壤中長期存活，寄生於高等植物，危害根部和莖基部，引起腐爛死亡，表現為猝倒、根腐和莖基腐。導致莖基腐病的土壤因素有：土壤粘重、偏酸性；多年重茬致田間病原菌積累易發病；肥料不足，耕作粗放致植株抗性降低易發病；地勢低洼積水、排水不良致土壤潮溼等。針對生薑莖基腐病其發病特點及發病規律，目前生產上防治措施主要是化學藥劑防治和農業防治；化學藥劑防治主要有利用化學藥劑進行土壤燻蒸、藥劑噴施灌根等，因其見效快等優點，使其在農業生產中被廣泛應用；但長期使用會引起環境汙染、抗藥性、農藥殘留多，汙染大等問題，防治生薑莖基腐病害的液體菌劑保質期短、預防率低。中國專利文獻cn101999371a(申請號：201010508770.9)公開了一種防治生薑莖基腐病的製劑，一種防治生薑莖基腐病的製劑，按重量比為：包含有25％甲霜靈54-58％、95％噁黴靈5.5-6.5％和20％琥膠肥酸銅36-40％，該製劑使用了噁黴靈，因此農藥殘留多，汙染大。生物菌劑具有環境友好性、無汙染、無殘留等優點，具有巨大的應用前景，如：中國專利文獻cn105274020a(申請號：201410819811.4)公開了一種生薑莖基腐病菌拮抗細菌及應用，該生薑莖基腐病菌拮抗細菌，命名為洋蔥伯克霍爾德菌(burkholderiacenocepacia)c3，已於2014年10月17日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.9791。生薑莖基腐病菌拮抗細菌c3對生薑莖基腐病防效達41.18％。但預防效果差，遠遠達不到實際生薑生產所需要的預防率，導致產量低。木黴菌(trichodermaspp.)屬於半知菌門，是一類在土壤中廣泛分布的寄生真菌，可用於防治植物葉部病害和根部病害，主要防病機制為產生抗生素、營養競爭、微寄生、細胞壁分解酵素、以及誘導植物產生抗性；長枝木黴(trichodermalongibrachiatum)，具有較強的適應性，其菌落生長迅速、有明顯的輪紋，周圍有白色菌絲的生長帶，最後整個菌落全部變成綠色；長枝木黴可代謝產生纖維素酶，對卵菌綱真菌菌絲具有分解作用，能夠很好的防治生薑莖基腐病。技術實現要素：針對現有技術的不足，本發明提供一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑及其製備方法與應用，該微生物菌劑具有無殘留、無汙染，環境友好、活菌量高以及保質期長等優點，對生薑莖基腐病害防治率達到80％以上，為高效生薑莖基腐病防治微生物菌劑，大大提高了生薑的產量和品質。為實現上述目的，本發明的技術方案如下：一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，包括長枝木黴菌發酵物和混料，所述混料為腐植酸、胺基酸和麥飯石；長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：(3～6):(1～2):(1～2):(4～5)，長枝木黴菌發酵物中有效活菌數大於等於2×109個/g。根據本發明優選的，長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：(3～4):1:1:5。根據本發明優選的，長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：(3.3～3.8):1:1:5。根據本發明，一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑的製備方法，包括以下步驟：(1)取長枝木黴菌接種於pda斜面培養基上，在25℃～28℃的條件下，活化培養3-5天，製得活化菌株；(2)取步驟(1)的活化菌株接種於種子培養基中，在溫度26℃～28℃、轉速150～170rpm的條件下振蕩培養30～36h，製得種子液；(3)將種子液8％～10％的質量百分比接入固體發酵培養基，培養96h～120h，低溫烘乾，製得長枝木黴發酵物；(4)將麥飯石、腐植酸、胺基酸粉碎過5-20目篩，然後與長枝木黴發酵物混合均勻，得到微生物菌劑。根據本發明優選的，所述步驟(1)中，所述的pda培養基配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000ml，製備方法為：將馬鈴薯去皮，切小塊，放入燒杯中，加水煮沸30min，過濾去除馬鈴薯殘渣，向濾液中加入葡萄糖、瓊脂，融化，定容至1000ml，最後溶液121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻備用。根據本發明優選的，所述步驟(2)中，所述的種子培養基，每升組分如下：麩皮15～20g，玉米粉8～10g，硫酸銨8～10g，水1l，ph自然，121℃高溫高壓滅菌20min～25min後備用。根據本發明優選的，所述的固體發酵培養基，包括固體物料、無機鹽、蔗糖和水，水的重量佔固體物料重量的55～65％，無機鹽的重量佔固體物料重量的1～3％；蔗糖的重量佔固體物料重量的0.3％～0.5％，所述的固體物料原料組分及其質量比如下：玉米秸稈粉、麩皮、玉米粉質量比為：2～4：1：1。進一步優選的，所述的無機鹽包括硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和硫酸亞鐵，硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和硫酸亞鐵分別佔固體物料的重量比為：硫酸銨0.3％～0.5％、磷酸二氫鉀0.4％～0.5％、硫酸鎂0.1％～0.25％、硫酸亞鐵0.001％～0.003％。根據本發明優選的，所述的固體發酵培養基是按以下方法製備得到：按質量比取玉米秸稈、麩皮、玉米粉，混合均勻，得固體物料；按配比取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po4、mgso4、feso4混合均勻用水溶解，然後與固體物料按1:(1.1～1.2)的質量比混合均勻，ph自然；將混合好的固體培養基經過121℃、25min高溫高壓蒸汽滅菌，待冷卻後即可作為固體發酵培養基。根據本發明優選的，步驟(3)接入種子液後調節固體發酵培養基含水量至60％～65％。根據本發明優選的，所述步驟(3)中，培養條件為：溫度26℃～28℃培養96h～120h；烘乾條件為：45℃～50℃低溫烘乾至水分含量8～12％；根據本發明，一種微生物菌劑的應用，用於防治生薑莖基腐病，在生薑種植前撒施姜地中，然後進行翻耕：每畝施用量5～10kg。本發明微生物菌劑的混料為腐植酸、胺基酸、麥飯石，三者合理搭配，麥飯石是一種天然的矽酸鹽礦物，麥飯石的主要化學成分是無機的矽鋁酸鹽。其中包括sio2、al2o3、fe2o3、feo、mgo、cao、k2o、na2o、tio2、p2o5、mno等，還含有植物所需的全部常量元素，如：k、na、ca、mg、cu、mo等微量元素和稀土元素，加上配伍的腐植酸和胺基酸，不僅可以改良土壤的品質，而且可活化利用土壤中的殘肥，為生薑等農作物提供了充足的養分；本發明微生物菌劑中長枝木黴具有較強的環境適應性，在15～40℃之間都能生長和產孢，能保證長枝木黴菌在土壤中保持一段時期的高種群水平，而不至於在短期內消失，符合生薑作物的生長期防病時期的生防規律，更有利於防病效果的發揮；長枝木黴能將莖基腐病病原菌的細胞壁降解，導致胞內物外滲，抑制病原菌孢子的生成和萌發，進一步使其死亡。本發明微生物菌劑中長枝木黴發酵物和混料中麥飯石具有協同配伍增效作用，混料中麥飯石對某些病毒和有害微生物及重金屬元素以及有機物質具有一定的淨化能力，長枝木黴發酵物和混料中麥飯石二者配伍，一方面改良土壤、維護有益菌，另一方面讓土壤中養分充足、齊全，對生薑等作物的莖基腐病起到協同增效作用；本發明的長枝木黴菌的固體發酵過程簡單易操作且無各類雜菌的生長，控制發酵過程中固體培養基的水分含量為60～65％，結合固體發酵的溫度，使得發酵過程中的溫溼度利於長枝木黴菌的生長，從而不利於各類雜菌的生長。按照本發明微生物菌劑製備方法所製備的長枝木黴菌農用微生物菌劑水分含量在8～12％，活菌數不低於20億/g，雜菌率＜5％，符合農用微生物菌劑gb2087-2006的指標要求。本發明的微生物菌劑製備時間短，周期為8-12天，菌種活化為3-5天，種子製備約1-2天，接種發酵約4-5天，成品摻混一天，菌劑活菌數檢測2-3天，生產時間得到有效縮短，生產效率得到提高。本發明的有益效果在於：1.本發明將長枝木黴發酵物應用於生薑莖基腐病的防治，製備出防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，得到長枝木黴有效活菌數不低於2×109個/g，微生物菌劑產品穩定性好、保質期長，可延長使用期為18-24個月；2.本發明的防治生薑莖基腐病的微生物菌劑對莖基腐黴病的防治率高，可以使生薑莖基腐病發病率大大減少80％以上，並能夠提高生薑的產量10％以上，經濟效益顯著，並提高生薑產品的品質；3.本發明的長枝木黴菌的發酵物與以麥飯石為主要成分的菌劑固相載體復配，製備農用微生物菌劑，長枝木黴發酵物和混料中麥飯石具有協同配伍增效作用，混料中麥飯石對某些病毒和有害微生物及重金屬元素以及有機物質具有一定的淨化能力，長枝木黴發酵物和混料中麥飯石二者配伍，一方面改良土壤、維護有益菌，另一方面讓土壤中養分充足、齊全，對生薑等作物的莖基腐病起到協同增效作用，充分利用了我國麥飯石資源極為豐富的優勢，也為麥飯石作為菌劑固相載體提供了新的應用前途；4.本發明的防治生薑莖基腐病的微生物菌劑產品中各成分配伍科學合理，協同增效效果好，生產時間得到有效縮短，生產效率得到提高；5.本發明的防治生薑莖基腐病的微生物菌劑產品替代了化學農藥在生薑作物上的應用，減少化學農藥的使用以及對生薑產品與種植土壤的危害，不會對害蟲天敵造成影響，不會對土壤環境造成汙染、在土壤中無殘留，很好地解決了由於長期施用化肥產品而給農業生產種植帶來的弊端和難題，彌補了化肥產品的缺陷和不足，真正實現了國家對綠色有機環保型微生物菌劑產品的社會效益的產業政策要求；附圖說明圖1為本發明實施例1長枝木黴菌株在pda培養基上25℃黑暗培養5d得到的菌落形態圖；圖2為本發明長枝木黴菌株與病原菌腐黴對峙培養效果圖；圖3為本發明實施例1製得的微生物菌劑產品外觀照片。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發明，但是不以任何方式構成對本發明的限制。實施例和對比例中所用原料和設備均為市售，其中各類培養基均按常規方法配置。接種均在無菌操作臺上完成；液體發酵在數顯恆溫震蕩培養箱上完成；滅菌處理在立式高壓滅菌鍋上完成；固體發酵在2m3的曲池內完成；菌劑復配過程採用不鏽鋼粉劑攪拌機完成。以下實施例採用的菌種均為長枝木黴trichodermalongibrachiatum，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為：cgmcc3.3002。實施例1一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，包括長枝木黴菌發酵物和混料，所述混料為腐植酸、胺基酸和麥飯石；長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：4:1:1:5，長枝木黴菌發酵物中有效活菌數不低於2×109個/g；以上微生物菌劑的製備方法，包括以下步驟：1)長枝木黴菌種活化將從冰箱保存的長枝木黴菌種接種於pda斜面培養基上，25℃培養5天，製得活化菌株；得到的菌落形態如圖1所示；pda培養基配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000ml，製備方法為：將馬鈴薯去皮，切小塊，放入燒杯中，加水煮沸30min，過濾去除馬鈴薯殘渣，向濾液中加入葡萄糖、瓊脂，融化，定容至1000ml，最後溶液121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻備用。2)種子液製備將pda斜面培養基上菌株孢子用無菌水洗脫接種於種子培養基上，置於搖床培養箱中，26℃、170rpm，振蕩培養32h後，得到種子液；種子培養基，每升組分如下：麩皮15g，玉米粉10g，硫酸銨8g，水1l，ph自然，121℃高溫高壓滅菌20min～25min後備用。3)固體發酵培養基製備按質量比取玉米秸稈、麩皮、玉米粉，混合均勻，得固體物料；按配比取蔗糖、(nh4)2so4、kh2po4、mgso4、feso4混合均勻用水溶解，然後與固體物料按1:1.1的質量比混合均勻，ph自然；將混合好的固體培養基經過121℃、25min高溫高壓蒸汽滅菌，待冷卻後即可作為固體發酵培養基。玉米秸稈粉、麩皮、玉米粉質量比為：4：1：1。蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和硫酸亞鐵分別佔固體物料的重量比為：蔗糖0.3％，硫酸銨0.3％、磷酸二氫鉀0.4％、硫酸鎂0.1％、硫酸亞鐵0.001％。4)接種發酵發酵罐溫度降至26℃，無菌條件下，從接種口加入長枝木黴種子液，接種量為發酵培養基質量的8％；接種後，控制發酵罐溫度26℃，補無菌水至最終物料含水量60％，90rpm攪拌均勻後靜置，持續通入無菌空氣，發酵120h；45℃低溫烘乾至含水量10％，得到長枝木黴發酵物；5)製得成品將麥飯石、腐植酸、胺基酸粉碎過10目篩，然後與長枝木黴發酵物混合均勻，得到微生物菌劑產品，產品外觀照片如圖3所示。實施例2一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，包括長枝木黴菌發酵物和混料，所述混料為腐植酸、胺基酸和麥飯石；長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：3.7:1:1:5，長枝木黴菌發酵物中有效活菌數不低於2×109個/g。製備方法同實施例1。實施例3一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，包括長枝木黴菌發酵物和混料，所述混料為腐植酸、胺基酸和麥飯石；長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：3.4:1:1:5，長枝木黴菌發酵物中有效活菌數不低於2×109個/g。製備方法同實施例1。實施例4一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，包括長枝木黴菌發酵物和混料，所述混料為腐植酸、胺基酸和麥飯石；長枝木黴菌發酵物：腐植酸：胺基酸：麥飯石的質量比為：3:1:1:5，長枝木黴菌發酵物中有效活菌數不低於2×109個/g。製備方法同實施例1。對比例1一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，同實施例1，不同之處在於：該微生物菌劑中不含有麥飯石。實驗例對實施例1-4製備的一種防治生薑莖基腐病的微生物菌劑進行檢測。農用微生物菌劑活菌數、雜菌率檢測方法：培養基為改良高氏一號培養基，1000ml培養基含可溶性澱粉20g、kno31g、k2hpo40.5g、mgso4·7h2o0.5g、nacl0.5g、feso4·7h2o0.01g，瓊脂20g，ph值7.2-7.5，120℃高壓滅菌30分鐘冷卻至50-55℃，每300ml培養基中加入3％重鉻酸鉀1ml，混勻，傾入無菌平皿。將製備好的農用微生物菌劑按照gb2087-2006方法進行梯度稀釋後，取10-7稀釋度塗布平板，培養3-5天後計數，結果如下表1：表1實施例1-4製備微生物菌劑產品活菌數檢測結果實施例1實施例2實施例3實施例4發酵後活菌數94億cfu/g90億cfu/g84億cfu/g80億cfu/g有效活菌數28億cfu/g27億cfu/g25億cfu/g23億cfu/g保質期24個月22個月21個月18個月由表1可以看出，本發明製備的防治生薑莖基腐病的微生物菌劑，有效活菌數不低於2×109個/g，保質期在18-24個月。實驗例2效果試驗：將實施例1～4微生物菌劑施入生薑種植地塊中，每畝施入10kg，於種植前撒施翻耕；另設空白組，不施用菌劑產品，其餘管理模式與實施例1-4處理完全一致。表2實施例1-4微生物菌劑與空白試驗結果結果顯示，本發明製備的防治生薑莖基腐病的微生物菌劑可以使生薑莖基腐病發病率大大減少，防治率達到80％以上，並能夠提高生薑的產量達到10％以上。實驗例3生薑莖基腐病平皿對峙試驗對本發明所述長枝木黴菌與生薑莖基腐病進行平板對峙試驗，以測試長枝木黴菌對生薑莖基腐病的抑菌效果。將本實施例中所述長枝木黴菌的菌株和生薑莖基腐病病原菌菌株用打孔器打成直徑5mm菌絲餅，分別接入9cm的pda培養基的兩端，以只接種莖基腐病原菌、不接種本實施例所述長枝木黴菌為對照，並測量菌落直徑計算抑菌率。實驗結果圖片見圖2，計算得出對生薑莖基腐病的抑菌率為90.02％。根據以上試驗可以證明，以本發明所述長枝木黴菌可以有效抑制生薑莖基腐病的發生，可以作為目前常用化學農藥的替代物，對環境不會造成影響。實驗例4為了更好的對本發明所述長枝木黴菌防治生薑莖基腐病和長枝木黴菌製成的微生物菌劑的效果進行比對，將實施例1～4及對比例1的微生物菌劑施入生薑種植地塊中，每畝施入9kg，於種植前撒施翻耕；實施例1-4與對比例1對生薑莖基腐病防治效果對照如表3中所示。表3本發明微生物菌劑產品與對比例1的微生物菌劑產品對生薑莖基腐病防治效果對照實驗結果分析：從表1中可以看出，對照組的病情指數較實施例1-4製備微生物菌劑產品大，防治效果差，其中本發明實施例1-4中所製備的微生物菌劑產品之間對生薑莖基腐病的防治效果無顯著差異，所以本發明實施例中所述長枝木黴菌製劑中長枝木黴發酵物與麥飯石配伍使用，可起到配伍增效作用。當前第1頁12