一種鑑別防風與水防風的檢測方法與流程
2024-04-14 21:38:05
1.本發明涉及防風鑑別技術領域，特別是涉及一種鑑別防風與水防風的檢測方法。
背景技術：
2.防風為傘形科植物防風的乾燥根，性味辛、甘，微溫，具有祛風解表，勝溼止痛，止痙的功效。主要用於感冒頭痛，風溼痺痛，風疹瘙癢，破傷風的治療。防風藥用歷史悠久，《神農本草經》將其列為上品，《古代經典名方目錄(第一批)》中，漢方「桂枝芍藥知母湯」、唐方「小續命湯」和宋方「辛夷散」等10首名方均有使用防風。研究發現，防風的藥理活性成分主要分為香豆素、色原酮、多糖和揮髮油四類。
3.防風為大宗藥材，流通量大，產地繁多。野生品主要分為關防風、口防風和西北防風，以內蒙古、黑龍江、甘肅等省份為主產區。栽培品因河北地區栽培早且量大，又被稱為冀防風，以河北、山西、陝西等省份為主產區。隨著市場需求逐年增大，野生防風資源日漸匾乏，交易價格居高不下。調研發現，市場中存在水防風、川防風和雲防風等混淆品冒充防風的現象，其中又以水防風較多。水防風為寬萼巖風的乾燥根，解表功效略遜於防風，但毒性較防風強，臨床應慎用。
4.目前，防風法定檢驗標準為2020年版《中國藥典》，對樣品的6方面理化指標做出限度值規定，包括性狀、顯微、薄層鑑別、水分、總灰酸灰、升麻素苷和5-o-甲基維斯阿米醇苷的含量。水防風檢驗標準為1991年版《河南中藥材標準》，僅檢測性狀和顯微，質量品質難以控制。按防風的標準進行水防風的檢驗，結果水防風的外觀性狀、顯微特徵、含量控制指標均符合標準要求，兩者之間的差異性極不明顯，現行標準難以用於區分防風的真偽，容易出錯。
5.查閱國內外文獻，發現至今僅有《基於hplc指紋圖譜的防風與其偽品水防風的鑑別研究》和《基於高效液相指紋圖譜和化學計量法的防風藥材及其偽品的鑑別》2篇文獻，以液相色譜法對防風所含化合物進行了簡單分析，且都存在兩方面缺陷：一方面，液相色譜是基於特定紫外波長採集化合物的信息，改變紫外波長會出現完全不同的指紋圖譜；另一方面，文獻均未明確特定化合物成分，用於快速篩選區分真偽防風，指紋圖譜的分析存在耗費時間長，標準指紋圖譜建立、獲取困難等問題，難以作為法定質量標準應用。
技術實現要素：
6.本發明的目的在於克服上述現有技術的不足，提供一種鑑別防風與水防風的檢測方法，從化學成分角度建立防風與水防風辨識的新方法，該方法靈敏、準確、可靠，可用於防風的質量控制。
7.為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
8.一種鑑別防風與水防風的檢測方法，包括以下步驟：
9.(1)供試品溶液的製備：分別取等量的多批確切來源的防風和水防風樣品粉末，各樣品粉末中分別加入甲醇，稱定重量，超聲處理後放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減
poroshell120ec-c
18
的色譜柱，流動相：乙腈-0.1％甲酸溶液，柱溫30℃，流速0.5ml
·
min-1
；
22.質譜條件為電噴霧離子化源，採集模式為正離子模式，乾燥氣溫度為300℃，乾燥氣流速為5l/min，霧化器壓力為35psi，鞘氣溫度為350℃，鞘氣流速為11l/min，毛細管電壓為3500v，噴嘴電壓為500v，質量掃描範圍為50～1000m/z，碎裂電壓為135v。
23.pca分析的具體方法為：將質譜原始數據導入mpp數據處理軟體，使用峰匹配、峰對齊、噪聲過濾的篩選方法，提取特徵峰的數據；再以p值小於0.05的t檢驗統計學算法為基礎，對特徵峰進行主成分分析；最後，將第一、第二、第三主成分要素統計結果，依次編為x軸、y軸和z軸，建立30批供試品的3d結構模型，觀察防風與水防風之間的差異。
24.差異性標誌物分離純化的具體方法為：取其中一批水防風供試品粉末1kg，加入95v/v％甲醇3l並浸泡，超聲處理，濾過，減壓濃縮提取液至幹，得到棕褐色油狀浸膏，使用矽膠柱層析法對其進行分離，得到高純度差異性標誌物。
25.所述矽膠柱層析法具體為：首先以三氯甲烷/甲醇溶劑系統按95∶5
→
50∶50的梯度洗脫，收集75％三氯甲烷/甲醇洗脫的餾分fr.a；再以正己烷/乙酸乙酯溶劑系統按75∶25
→
30∶70的梯度洗脫餾分fr.a，收集55％正己烷/乙酸乙酯洗脫的餾分fr.b；最後使用製備液相對餾分fr.b進行純化，流動相為體積比為40:60的乙腈-水，流速為3.0ml
·
min-1，得到高純度差異性標誌物。
26.差異性標誌物質譜鑑定的具體步驟為：取步驟(5)製得的高純度差異性標誌物，加入甲醇製成標誌物溶液，採用高效液相色譜串聯四級杆飛行時間質譜儀採集二級質譜碎片圖；質譜、色譜條件與步驟(2)相同。
27.採用液相色譜儀檢測的待測樣品溶液的具體製備方法為：取待測樣品粉末1g，加入70v/v％甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min後放冷至室溫，再稱定重量，用70v/v％甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得；
28.採用高效液相色譜-質譜聯用儀檢測的待測樣品溶液的具體製備方法為：取待測樣品粉末0.2g，加入70v/v％甲醇100ml，稱定重量，超聲處理30min後放冷至室溫，再稱定重量，用70v/v％甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
29.採用液相色譜儀檢測待測樣品溶液的方法為：分別吸取對照品溶液與待測樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀進行測定，得到液相色譜圖；
30.色譜條件為：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以體積比為70：30的乙腈-0.1％磷酸水溶液為流動相；採用二極體陣列檢測器，檢測波長為222nm。
31.採用高效液相色譜-質譜聯用儀檢測待測樣品的方法為：分別吸取對照品溶液與待測樣品溶液各1μl，注入高效液相色譜-質譜聯用儀進行測定；
32.色譜條件為：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，色譜柱內徑2.1mm；以乙腈為流動相a，以0.1％甲酸溶液為流動相b，流速為每分鐘0.3ml；
33.質譜條件為：採用電噴霧正離子模式，多反應監測，選擇m/z 427.2
→
245.1和m/z427.2
→
327.1作為檢測離子對。
34.本發明的有益效果是：一方面，使用hplc-q-tof-ms技術對防風與水防風進行統計學分析，建立了兩者的差異性pca模型，並對不同產地的樣品進行了聚類分析，統計結果不僅有效鑑別了防風與水防風，還明確了野生和栽培防風的內在差異。另一方面，對水防風中
的特有成分差異性標誌物進行了分離純化，並通過質譜和核磁的手段鑑定其化學結構，確定其為xanthalin，使其可以作為標準對照物質，解決防風中摻雜水防風的問題，本發明兩方面研究的有效結合，能夠快速而全面的控制防風的質量，為防風的補充檢驗標準起草提供了依據。
附圖說明
35.圖1為防風(s10)與水防風(s1)的總離子流圖(a防風、b水防風)；
36.圖2為防風與水防風的pca得分圖；
37.圖3為防風與水防風的聚類樹狀圖；
38.圖4為防風與水防風的差異化合物圖；
39.圖5為防風與水防風的提取離子流圖(c防風、d水防風)；
40.圖6為高純度差異性標誌物的液相色譜圖；
41.圖7為標誌性差異物的二級質譜圖；
42.圖8為標誌性差異物的裂解途徑；
43.圖9為xanthalin的核磁
13
c碳譜圖；
44.圖10為xanthalin的核磁1h氫譜圖；
45.圖11為xanthalin的立體化學結構式；
46.圖12為實施例1的差異性標誌物xanthalin與待測樣品的液相色譜對照圖；
47.圖13為實施例2的差異性標誌物xanthalin與待測樣品的液相色譜對照圖；
48.圖14為實施例2的差異性標誌物xanthalin與待測樣品的光譜對照圖；
49.圖15為實施例3的差異性標誌物xanthalin的總離子流與提取離子流圖；
50.圖16為實施例3的待測樣品的總離子流與提取離子流圖；
51.圖17為實施例4的差異性標誌物xanthalin的總離子流與提取離子流圖；
52.圖18為實施例4的待測樣品的總離子流與提取離子流圖。
具體實施方式
53.下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步描述：
54.實施例1
55.儀器：
56.1260高效液相色譜儀(美國agilent公司)，6530四極杆-飛行時間串聯質譜儀(美國agilent公司)，lc-20ap製備液相色譜儀(日本shimadzu公司)，jnm-ecz400s核磁共振儀(日本jeol公司)，xpe26百萬分之一電子天平(瑞士mettlertoledo公司)，zm-200超離心碾磨儀(德國retsch公司)，r-300旋轉蒸發儀(瑞士buchi公司)，fesco17微量離心機(美國thermofisher公司)，ua22mfd數控型超聲波儀(德國wiggens公司)，advantagea10超純水器(美國millipore公司)。
57.試藥：
58.乙腈、甲酸(均為質譜級，購於cnw)；甲醇(色譜級，購於tedia)；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯(均為分析級，購於國藥集團化學試劑有限公司)；氘代氯仿(氘代度99.8+％，核磁共振用，購於merck)；柱層層析矽膠(購於macklin)；超純水。
59.鑑別防風與水防風的檢測方法，具體包括以下步驟：
60.(1)供試品溶液的製備：分別取防風和水防風樣品粉末各1g，精密稱定，分別加入70v/v％甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min，放冷至室溫，再稱定重量，用70v/v％甲醇補足減失的重量，搖勻，超高速離心，各取上清液，即得各供試品溶液。
61.樣品防風採自內蒙古、黑龍江、河北等地，分為野生品和栽培品，樣品水防風採自河南和山西，均為野生品。防風按2020年版《中國藥典》一部，水防風按1991年版《河南中藥材標準》鑑定。具體信息詳見表1，其中對照藥材：防風(批號：120947-201810)、水防風(批號：121349-202002)均購於中國食品藥品檢定研究院(表中簡稱中檢院)；野生品在名稱後添加「*」標識。
62.表1防風與水防風的信息
[0063][0064][0065]
本步驟中，液質提取溶劑的選擇使用甲醇、70％甲醇、30％甲醇分別提取供試品，結果70％甲醇提取液的特徵峰數量、峰形和峰面積最優，獲得的化合物信息更全面，故選70％甲醇作為提取溶劑。比較了超聲時間10、30、60min對結果的影響，超聲10分鐘時，各組
分含量偏低，超聲時間超過30min後，各組分含量基本不變，故選30min作為提取時間。
[0066]
(2)樣品分析：分別取步驟(1)製備的供試品溶液各1μl，採用高效液相色譜串聯四級杆飛行時間質譜儀分別採集供試品溶液的總離子流圖。防風與水防風對照藥材測得的總離子流圖詳見圖1。
[0067]
液相條件為：色譜柱：agilentporoshell120ec-c
18
柱(4.6mm
×
50mm，2.7μm)，流動相：乙腈-0.1％甲酸溶液(梯度洗脫，詳見表2)，柱溫30℃，流速0.5ml
·
min-1
。
[0068]
表2梯度洗脫方法
[0069][0070]
質譜條件為：電噴霧離子化源(esi)，採集模式為正離子模式，乾燥氣溫度：300℃，乾燥氣流速：5l/min，霧化器壓力：35psi，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流速：11l/min，毛細管電壓：3500v，噴嘴電壓：500v，質量掃描範圍m/z：50～1000，碎裂電壓：135v。
[0071]
本發明比較了甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙睛-水、乙睛-0.1％甲酸水溶液4種流動相的分析效果，結果用乙睛-0.1％甲酸水溶液梯度洗脫時，各共有峰峰形最好，分離度較高，故選乙睛-0.1％甲酸水溶液作為流動相。
[0072]
(3)pca分析和聚類分析：將步驟(2)所得的質譜原始數據導入mpp數據處理軟體，提取特徵峰數據，對特徵峰進行主成分分析和聚類分析；
[0073]
主成分分析(pca)：將質譜原始數據導入mass profiler professional(mpp)數據處理軟體，使用峰匹配、峰對齊、噪聲過濾的篩選方法，提取特徵峰的數據。再以t檢驗(p值小於0.05)的統計學算法為基礎，對特徵峰進行主成分分析。最後，將第一、第二、第三主成分要素統計結果，依次編為x軸、y軸和z軸，建立30批供試品的3d結構模型，觀察防風與水防風之間的差異，結果詳見圖2。總體來看，21批防風聚集在x軸的上方，9批水防風聚集在x軸的下方，兩者得到了顯著性區分。
[0074]
聚類分析：使用mpp軟體對特徵峰進行聚類分析，通過觀察不同供試品的分類情況，分析品種和產地對化合物組成的影響。結果在聚類樹狀圖(圖3)中，防風與水防風的差異性十分明顯，30個樣本分為2類，s1～s9歸類為水防風，s10～s30歸類為防風，與pca分析結果保持一致。其中，21批防風又按野生品和栽培品的不同分為2類，s10～s12和s16～s18歸為一類，為野生品，其餘15批歸為一類，為家種的栽培品。聚類樹狀圖的結果與外觀性狀和產地信息基本一致，可以作為鑑別防風真偽和產地的有效方法。
[0075]
(4)差異性標誌物的篩選：使用mpp軟體的查找特徵化合物功能，將防風和水防風分為兩組，根據化合物響應值篩選組間的差異化合物，結果獲得防風差異性標誌物2個，水防風差異性標誌物6個，共有化合物18個，結果詳見圖4。分別解析8個差異性標誌物的提取
gracilis[j].nat prod res dev(天然產物研究與開發),2003,15(3):196-198.)，最終確定該化合物的分子式為c
24h26
o7，結構式為
[0084]
表3 xanthalin的1h氫譜和
13
c碳譜核磁數據
[0085][0086]
(6)對照品溶液的製備：對照品溶液的製備：取差異性標誌物xanthalin適量，精密稱定，加70v/v％甲醇製成每1ml含20μg差異性標誌物的溶液，即得。
[0087]
(7)待測樣品溶液的製備：取1號待測樣品粉末(過四號篩)1g，加入70v/v％甲醇
50ml，稱定重量，超聲處理30min後放冷至室溫，再稱定重量，用70v/v％甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為1號測樣品溶液。
[0088]
(8)檢測與判定：分別吸取對照品溶液與1號待測樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀進行測定，得到液相色譜圖；
[0089]
若待測樣品溶液的液相色譜圖中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上未出現相同的色譜峰，判定待測樣品為防風；色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(70：30)為流動相；採用二極體陣列檢測器，檢測波長為222nm。理論板數按xanthalin峰計算應不低於3000。
[0090]
若待測樣品溶液的液相色譜圖中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上出現相同的色譜峰，則採用二極體陣列檢測器比較相應色譜峰在190～400nm波長範圍內的紫外-可見吸收光譜，若紫外-可見吸收光譜不相同，則判定待測樣品為防風，若紫外-可見吸收光譜相同，則判定待測樣品摻雜水防風。
[0091]
由圖12可知，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上未出現相同的色譜峰，判定待測樣品為防風。
[0092]
實施例2
[0093]
按實施例1中方法鑑別防風與水防風，不同之處在於：對2號待測樣品粉末進行檢測與判定。
[0094]
由圖13中可知，圖13中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上出現相同的色譜峰，由圖14可知，相應色譜峰在190～400nm波長範圍內紫外-可見吸收光譜相同，判定待測樣品摻偽了水防風。
[0095]
實施例3
[0096]
按實施例1中方法鑑別防風與水防風，不同之處在於：步驟(7)、(8)改為：
[0097]
(7)待測樣品溶液的製備：取3號待測樣品粉末(過四號篩)0.2g，加入70v/v％甲醇100ml，稱定重量，超聲處理30min後放冷至室溫，再稱定重量，用70v/v％甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
[0098]
採用高效液相色譜-質譜聯用儀檢測待測樣品的方法為：分別吸取對照品溶液與待測樣品溶液各1μl，注入高效液相色譜-質譜聯用儀進行測定；
[0099]
色譜條件為：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，色譜柱內徑2.1mm；以乙腈為流動相a，以0.1％甲酸溶液為流動相b，流速為每分鐘0.3ml；
[0100]
(8)檢測與判定：分別吸取對照品溶液與待測樣品溶液各1μl，注入高效液相色譜-質譜聯用儀進行測定，得到提取離子流色譜；
[0101]
若待測樣品溶液的提取離子流色譜中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上未出現相同的色譜峰，則判定待測樣品為防風，反之則判定待測樣品摻雜水防風。
[0102]
色譜、質譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(色譜柱內徑2.1mm)；以乙腈為流動相a，以0.1％甲酸溶液為流動相b，按表5中的規定進行梯度洗脫，流速為每分鐘0.3ml；採用三重四級杆質譜檢測器，電噴霧正離子模式(esi
+
)，多反應監測(mrm)，選擇m/z 427.2
→
245.1和m/z 427.2
→
327.1作為檢測離子對。理論板數按xanthalin峰計算應不低於3000。
[0103]
表5梯度洗脫程序
[0104][0105]
對比圖15、16可知，待測樣品溶液的提取離子流色譜中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上未出現相同的色譜峰，判定待測樣品為防風。
[0106]
實施例4
[0107]
按實施例3中方法鑑別防風與水防風，不同之處在於：對4號待測樣品粉末進行檢測與判定。
[0108]
對比圖17、18可知，待測樣品溶液的提取離子流色譜中，在與對照品溶液色譜峰保留時間相應的位置上出現了相同的色譜峰，判定待測樣品摻偽了水防風。
[0109]
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。