一種豬繁殖與呼吸症候群病毒血清學鑑別診斷試劑盒的製作方法
2023-10-09 23:56:04 2
本發明屬於動物傳染病學領域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸症候群病毒（PRRSV）血清學鑑別診斷試劑盒。
背景技術：
豬繁殖與呼吸症候群病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）屬於網巢病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬（Arterivirus），該類病毒為單股正鏈RNA病毒。PRRSV基因組長約15kb，分別為（5』端至3』端）：非結構蛋白ORF1（ORF1a和ORF1b）、結構蛋白ORF2a（GP2a）、ORF2b（GP2b）、ORF3（GP3）、ORF4（GP4）、ORF5（GP5）、ORF6（M）和ORF7（N）。PRRSV基因組結構和其他動脈炎病毒組基因組結構相似，在病毒的5』端有帽子結構，3』端多聚腺苷酸化。其非結構蛋白ORF1佔基因組全長的75%左右，包含有PRRSV複製所需的酶類，參與病毒的增殖過程，可進一步細分為Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp9、Nsp1和Nsp11共10種非結構蛋白。結構蛋白中ORF2-ORF6編碼病毒的囊膜蛋白，其中ORF2-ORF5編碼的蛋白均為糖基化蛋白（GP2、GP3、GP4和GP5）而ORF6編碼的M蛋白為非糖基化蛋白；ORF7編碼病毒的核衣殼蛋白（N），有較強的免疫原性。
豬繁殖與呼吸症候群是由PRRSV引起的，可導致妊娠母豬發熱、厭食及繁殖障礙（如流產、早產、死胎、木乃伊胎），新生及斷奶仔豬高死亡率的仔豬呼吸道疾病，俗稱豬「藍耳病」。根據PRRSV的血清學和基因組特徵分析，PPRSV可細分為洲型（代表株為VR2332株）和歐洲型（代表株為LV株）。2006年，我國南方地區大部分豬場出現以高熱、高發病率和高死亡率為特徵的傳染病，即豬「高熱病」，給我國養豬業造成極大損失。經國內各位豬病專家聯合攻關，明確為該病病原為 「高致病性藍耳病」（即HP-PRRSV）。對HP-PRRSV基因組分析比較發現，HP-PRRSV在非結構蛋白2（Nsp2）存在連續核苷酸（約87個核苷酸，29個胺基酸）缺失。2008年，歐洲型PRRSV在我國福建和浙江豬群中首次發現報導，隨後在我國多省市均檢測到歐洲型PRRSV感染陽性。
目前，我國豬群中PPRSV感染的類型較為複雜，為了更好的預防和控制PRRSV的流行，需要對豬群PRRSV血清學抗體進行科學有效區分。從病原學來看，根據歐洲型和美洲型PRRSV的基因組差異已見有RT-PCR方法和實時螢光定量PCR方法；此外，根據HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因組差異（主要是Nsp2）已見有RT-PCR方法和實時螢光定量PCR方法，但是上述實驗方法（RT-PCR方法和實時螢光定量PCR方法）對實驗操作者操作技能和實驗儀器設備要求較高，不適宜臨床現地使用。從血清學來看，已見有歐洲型和美洲型PRRSV鑑別診斷ELISA方法報導；此外，也見有HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因組差異鑑別診斷ELISA報導。但是，當前未見可同時區分歐洲型PRRSV、美洲型PRRSV和HP-PRRSV的血清學鑑別診斷試劑盒報導。
抗原表位是指抗原分子表面具有刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞並能被其識別的免疫活性區。根據表位與受體細胞結合部位的差異，表位可分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。本發明根據相關文獻報導的不同類型PRRSV抗原表位特徵和基因獨特保守區為研究對象，建立檢測不同類型PRRSV血清學鑑別診斷ELISA試劑盒：①美洲型和歐洲型PRRSV血清學抗體均可檢測ELISA試劑盒；②僅檢測歐洲型PRRSV血清學抗體的ELISA試劑盒；③僅檢測美洲型PRRSV血清學抗體的ELISA試劑盒；④針對HP-PRRSV基因缺失區表達蛋白，該蛋白為包被抗原建立的ELISA方法，對前期檢測為美洲型PRRSV感染陽性血清進行檢測，檢測結果為陰性值代表該血清為HP-PRRSV感染陽性。上述4種ELISA方法，經過組裝形成的PRRSV血清學鑑別診斷試劑盒，可以供現地檢測的試劑情況選擇使用，有效用於對豬群中不同類型PRRSV感染情況進行鑑別診斷。本發明可填補P-RRSV血清學抗體鑑別診斷研究空白，為我國科學防控PRRSV提供新的檢測手段和方法學參考。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種豬繁殖與呼吸症候群病毒血清學鑑別診斷試劑盒。
為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一種豬繁殖與呼吸症候群病毒血清學鑑別診斷試劑盒，所述試劑盒中包含4塊ELISA板，且每塊板的包被抗原核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-4所示。
SEQ ID NO.1：GGATCCCCGGAGAAGCCGCATTTCCCGCTGGCGACTGAAGATGACGTCCGTCATCACTTTACCCCGAGTACCCGTGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO.2：GGATCC TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAATGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO.3：GGATCC GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTTGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO. 4：TCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTTTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCG；
本發明的優點在於：本發明提供一種豬繁殖與呼吸症候群病毒血清學鑑別診斷試劑盒，具體基於不同類型PRRSV抗原表位建立的血清學鑑別診斷試劑盒。目前流行的PRRSV類型有經典美洲型PRRSV、高致病性PRRSV和歐洲型PRRSV，本發明建立的PRRSV血清學鑑別診斷試劑盒主要針對上述3種類型進行血清學鑑別診斷。第1個ELISA板的包被抗原是PRRSV歐洲型和美洲型共同抗原表位串聯優化表達後的蛋白；第2個ELISA板的包被抗原是PRRSV歐洲型獨特型抗原表位串聯優化優化表達後的蛋白；第3個ELISA板的包被抗原是PRRSV美洲型獨特型抗原表位串聯優化優化表達後的蛋白；第4個ELISA板的包被抗原是高致病性PRRSV的Nsp2基因缺失區核苷酸序列表達的蛋白。經過上述4個ELISA平板檢測後，即可明確豬血清中PRRSV感染類型及抗體水平。本方法簡便快捷，可有效用於不同類型PRRSV的臨床血清學診斷。與現有技術相比，本試劑盒可同時對PRRSV的不同血清學感染類型進行同時現地檢測，方便、準確、快捷，可有效彌補病原學檢測時所需的精密儀器和操作者操作能力的局限性，可以直接現地使用。
附圖說明
圖1 表達蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白質分子量標準；1：空載體對照；2：目的蛋白。
圖2 Western Blot分析，M：蛋白質分子量標準；1：美洲型PRRSV；2：歐洲型PRRSV。
圖2-1 歐洲型PRRSV的ORF4抗原表位分析。
圖2-2 表達蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白質分子量標準；1：空載體對照；2：目的蛋白。
圖2-3 Western Blot分析，M：蛋白質分子量標準；1：歐洲型PRRSV；2：美洲型PRRSV。
圖3-1 美洲型PRRSV的GP5抗原表位分析。
圖3-2 表達蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白質分子量標準；1：空載體對照；2：目的蛋白。
圖3-3 Western Blot分析，M：蛋白質分子量標準；1：美洲型PRRSV；2：歐洲型PRRSV。
圖4-1經典型PRRSV和HP-PRRSV的非結構蛋白Nsp2差異區。
圖4-2 表達蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白質分子量標準；1：空載體對照；2：目的蛋白。
圖4-3 Western Blot分析，M：蛋白質分子量標準；1：美洲型PRRSV；2：HP PRRSV。
具體實施方式
實施例1
選取針對美洲型和歐洲型PRRSV的N蛋白的保守抗原表位（50PEKPHFPLATEDDVRHHFTPS70）和針對GP5的保守抗原表位（195TRVSAEQWGRL200），將選取的抗原表位（50PEKPHFPLATEDDVRHHFTPS70和195TRVSAEQWGRL200）核苷酸序列進行串聯，並根據原核表達條件的需要對其進行優化，優化後的序列為GGATCCCCGGAGAAGCCGCATTTCCCGCTGGCGACTGAAGATGACGTCCGTCATCACTTTACCCCGAGTACCCGTGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTGAGCGGCCGC；其中在優化後的序列末端（5』端和3』端）分別引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點（方框內序列），並在3端酶切位點前引入終止密碼子TGA。優化後的序列進行基因合成後，克隆到原核表達載體pET32a上。按照常規原核表達方法對構建的陽性重組質粒pET32a-N-GP5-e。將pET32a-N-GP5-e質粒轉化原核表達感受態細胞BL21(DE3)感受態後鑑定獲得陽性單菌落（陽性菌培養液）。取100 μL陽性菌培養液加入5mL LB液體培養基 (Amp+、 100μg/ml)，培養至OD600 nm值約為0.6。加入不同終濃度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG進行誘導，37℃誘導（誘導時間分別為2h、3h、4h、5h和6h）。經SDS-PAGE分析發現，優化後的條件為IPTG終濃度為0.5 mM，37℃誘導4h即可獲得高效表達，經分析串聯的抗原表位蛋白基本為可溶性表達，目的大小約為24.7 ku（見圖1）。將目的蛋白轉膜後進行Western Blot鑑定，可見串聯表位表達的蛋白可與PRRSV高免血清發生特異性反應。
1、抗原表位的選取、串聯表達及鑑定
一、美洲型和歐洲型PRRSV血清學抗體均可檢測ELISA試劑盒
2、ELISA方法的建立
2.1 間接方法的操作程序
（1）包被：將表達的目的蛋白用包被液稀釋成一定濃度，包被酶標板，100μL/孔，4℃過夜，次日棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃封閉2h（或4℃封閉過夜），再棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（3）加血清：血清用抗體稀釋液按一定倍數稀釋，加入酶標板中，100μL/孔，同時設陰性對照孔，陽性對照孔和空白對照孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（4）加酶標二抗：將酶標二抗用二抗稀釋液（也可用PBST）按一定倍數稀釋（商品化試劑可直接按照推薦的濃度稀釋），加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（5） TMB反應液顯色：將TMB反應液加入酶標板上，100μL/孔，室溫避光反應5-10 min。
（6）加入終止液：TMB顯色後加入終止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶標儀測定：用酶標儀測定OD450值。
為便於後續實驗室的統一，本發明中將包被時間明確為4℃包被過夜；封閉時間明確為4℃封閉過夜；一抗孵育時間明確為37℃孵育2h；二抗孵育時間明確為37℃孵育90min；顯色7 min後測定OD450值。
2.2 臨界值的判斷標準
選取30份臨床收集的PRRSV陰性血清，對30份陰性血清進行ELISA檢測。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X），標準方差（SD）。本發明統一規定，臨界值（C）=平均數（X）+3標準方差（SD）。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧臨界值（C）判為陽性，其他均判為陰性。
2.3 試劑
ELISA平板購自Costar；HRP標記的山羊抗豬酶標二抗購自Abcam；ELISA顯色液TMB購自武漢博士德生物工程有限公司。碳酸鹽包被液、抗體稀釋液和封閉液均購自碧雲天生物技術研究所。
2.4 血清
歐洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）高免血清和豬陰性血清由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所製備並保存。
2.5 ELISA檢測條件
經矩陣滴定後獲得最適條件為包被抗原（純化後的目的蛋白）5μg/mL、血清稀釋度為1：80、酶標二抗濃度1：5000。37℃孵育90min，避光顯色7min，即可獲得最大化P/N值。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X）=0.2336、標準方差（SD）=0.0372，得到本研究的臨界值（C）位0.3452。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧0.3452判為陽性，其他均判為陰性。
2.6 特異性實驗
利用優化後的條件，對豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）陽性血清進行檢測OD450nm值均在0.250以內；豬繁殖與呼吸症候群病毒（美洲型PRRSV和歐洲型）陽性血清OD450nm值為1.173和0.968；陰性血清OD450nm值為0.186；表明本研究建立的方法特異性強，與常規病原陽性血清均無交叉反應。
2.7 重複性實驗
利用優化後的條件建立的ELISA條件進行檢測，獲得的組間變異係數在1.02%～3.94%之間；獲得組間變異係數在1.38%～4.83%之間，表明建立的ELISA具有良好的重複性。
2.8 臨床樣品檢測
利用建立的ELISA方法對本團隊收集的45份豬血清進行檢測，其中陽性38份，陽性率為84.44%（38/45）；使用商品化IDEXX試劑盒測得陽性36份，陽性率為80%（36/45）。
二、歐洲型PRRSV血清學抗體檢測ELISA試劑盒
1、抗原表位的選取、串聯表達及鑑定
通過對歐洲型PRRSV 的ORF4編碼區蛋白的抗原表位進行分析研究發現，其存在一個53LRPHGVSAAQEEIPFGLSSQ 72，該表位在歐洲型PRRSV較為保守，和美洲型PRRSV差異極大（圖2-1）。
將該表位的核苷酸序列「TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAA」，優化後的序列為GGATCC TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAA TGAGCGGCCGC。其中在優化後的序列末端（5』端和3』端）分別引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點（方框內序列），並在3端酶切位點前引入終止密碼子TGA。優化後的序列進行基因合成後，克隆到原核表達載體pET32a上。按照常規原核表達方法對構建的陽性重組質粒pET32a-ORF4-e。將pET32a-ORF4-e質粒轉化原核表達感受態細胞BL21(DE3)感受態後鑑定獲得陽性單菌落（陽性菌培養液）。取100 μL陽性菌培養液加入5mL LB液體培養基 (Amp+、 100μg/ml)，培養至OD600 nm值約為0.6。加入不同終濃度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG進行誘導，37℃誘導（誘導時間分別為2h、3h、4h、5h和6h）。經SDS-PAGE分析發現，優化後的條件為IPTG終濃度為0.75 mM，37℃誘導3h即可獲得高效表達，經分析表達蛋白基本為可溶性表達，目的大小約為23.6 ku（見圖2-2）。將目的蛋白轉膜後進行Western Blot鑑定，可見串聯表位表達的蛋白可與PRRSV高免血清發生特異性反應（見圖2-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 間接方法的操作程序
（1）包被：將表達的目的蛋白用包被液稀釋成一定濃度，包被酶標板，100μL/孔，4℃過夜，次日棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃封閉2h（或4℃封閉過夜），再棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（3）加血清：血清用抗體稀釋液按一定倍數稀釋，加入酶標板中，100μL/孔，同時設陰性對照孔，陽性對照孔和空白對照孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（4）加酶標二抗：將酶標二抗用二抗稀釋液（也可用PBST）按一定倍數稀釋（商品化試劑可直接按照推薦的濃度稀釋），加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（5） TMB反應液顯色：將TMB反應液加入酶標板上，100μL/孔，室溫避光反應5-10 min。
（6）加入終止液：TMB顯色後加入終止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶標儀測定：用酶標儀測定OD450值。
為便於後續實驗室的統一，本發明中將包被時間明確為4℃包被過夜；封閉時間明確為4℃封閉過夜；一抗孵育時間明確為37℃孵育2h；二抗孵育時間明確為37℃孵育90min；顯色7 min後測定OD450值。
2.2 臨界值的判斷標準
選取30份臨床收集的PRRSV陰性血清，對30份陰性血清進行ELISA檢測。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X），標準方差（SD）。本發明統一規定，臨界值（C）=平均數（X）+3標準方差（SD）。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧臨界值（C）判為陽性，其他均判為陰性。
2.3 試劑
ELISA平板購自Costar；HRP標記的山羊抗豬酶標二抗購自Abcam；ELISA顯色液TMB購自武漢博士德生物工程有限公司。碳酸鹽包被液、抗體稀釋液和封閉液均購自碧雲天生物技術研究所。
2.4 血清
歐洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）高免血清和豬陰性血清由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所製備並保存。
2.5 ELISA檢測條件
經矩陣滴定後獲得最適條件為包被抗原（純化後的目的蛋白）7.5μg/mL、血清稀釋度為1：40、酶標二抗濃度1：5000。37℃孵育90min，避光顯色7min，即可獲得最大化P/N值。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X）=0.2409、標準方差（SD）=0.0385，得到本研究的臨界值（C）為0.3564。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧0.3564判為陽性，其他均判為陰性。
2.6 特異性實驗
利用優化後的條件，對豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）陽性血清進行檢測OD450nm值均在0.350以內；豬繁殖與呼吸症候群病毒（美洲型PRRSV和歐洲型）陽性血清OD450nm值為0.302和0.874；陰性血清OD450nm值為0.215；表明本研究建立的方法特異性強，與常規病原陽性血清均無交叉反應。
2.7 重複性實驗
利用優化後的條件建立的ELISA條件進行檢測，獲得的組間變異係數在1.17%～4.21%之間；獲得組間變異係數在1.48%～4.96%之間，表明建立的ELISA具有良好的重複性。
2.8 臨床樣品檢測
利用建立的ELISA方法對本團隊收集的45份豬血清進行檢測，其中陽性2份，陽性率為4.44%（2/45）。
三、美洲型PRRSV血清學抗體檢測ELISA試劑盒
1、抗原表位的選取、串聯表達及鑑定
通過對美洲型PRRSV 的GP5編碼區蛋白的抗原表位進行分析研究發現，其存在一個169EGHLIDLKRV178，該表位在美洲型PRRSV較為保守，和歐洲型PRRSV差異極大（圖3-1）。
將該表位的核苷酸序列「GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTT」，串聯2次後優化後的序列為GGATCCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTT GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTTGAGCGGCCGC。其中在優化後的序列末端（5』端和3』端）分別引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點（方框內序列），並在3端酶切位點前引入終止密碼子TGA。優化後的序列進行基因合成後，克隆到原核表達載體pET32a上。按照常規原核表達方法對構建的陽性重組質粒pET32a-GP5-e2。將pET32a-GP5-e2質粒轉化原核表達感受態細胞BL21(DE3)感受態後鑑定獲得陽性單菌落（陽性菌培養液）。取100 μL陽性菌培養液加入5mL LB液體培養基 (Amp+、 100μg/ml)，培養至OD600 nm值約為0.6。加入不同終濃度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG進行誘導，37℃誘導（誘導時間分別為2h、3h、4h、5h和6h）。經SDS-PAGE分析發現，優化後的條件為IPTG終濃度為0.50 mM，37℃誘導4h即可獲得高效表達，經分析表達蛋白基本為可溶性表達，目的大小約為23.5 ku（見圖3-2）。將目的蛋白轉膜後進行Western Blot鑑定，可見串聯表位表達的蛋白可與PRRSV高免血清發生特異性反應（見圖3-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 間接方法的操作程序
（1）包被：將表達的目的蛋白用包被液稀釋成一定濃度，包被酶標板，100μL/孔，4℃過夜，次日棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃封閉2h（或4℃封閉過夜），再棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（3）加血清：血清用抗體稀釋液按一定倍數稀釋，加入酶標板中，100μL/孔，同時設陰性對照孔，陽性對照孔和空白對照孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（4）加酶標二抗：將酶標二抗用二抗稀釋液（也可用PBST）按一定倍數稀釋（商品化試劑可直接按照推薦的濃度稀釋），加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（5） TMB反應液顯色：將TMB反應液加入酶標板上，100μL/孔，室溫避光反應5-10 min。
（6）加入終止液：TMB顯色後加入終止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶標儀測定：用酶標儀測定OD450值。
為便於後續實驗室的統一，本發明中將包被時間明確為4℃包被過夜；封閉時間明確為4℃封閉過夜；一抗孵育時間明確為37℃孵育2h；二抗孵育時間明確為37℃孵育90min；顯色7 min後測定OD450值。
2.2 臨界值的判斷標準
選取30份臨床收集的PRRSV陰性血清，對30份陰性血清進行ELISA檢測。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X），標準方差（SD）。本發明統一規定，臨界值（C）=平均數（X）+3標準方差（SD）。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧臨界值（C）判為陽性，其他均判為陰性。
2.3 試劑
ELISA平板購自Costar；HRP標記的山羊抗豬酶標二抗購自Abcam；ELISA顯色液TMB購自武漢博士德生物工程有限公司。碳酸鹽包被液、抗體稀釋液和封閉液均購自碧雲天生物技術研究所。
2.4 血清
歐洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）高免血清和豬陰性血清由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所製備並保存。
2.5 ELISA檢測條件
經矩陣滴定後獲得最適條件為包被抗原（純化後的目的蛋白）0.25 μg/mL、血清稀釋度為1：40、酶標二抗濃度1：5000。37℃孵育90min，避光顯色7min，即可獲得最大化P/N值。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X）=0.2256、標準方差（SD）=0.0294，得到本研究的臨界值（C）為0.3138。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧0.3138判為陽性，其他均判為陰性。
2.6 特異性實驗
利用優化後的條件，對豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）陽性血清進行檢測OD450nm值均在0.300以內；豬繁殖與呼吸症候群病毒（美洲型PRRSV和歐洲型）陽性血清OD450nm值為0.934和0.259；陰性血清OD450nm值為0.194；表明本研究建立的方法特異性強，與常規病原陽性血清均無交叉反應。
2.7 重複性實驗
利用優化後的條件建立的ELISA條件進行檢測，獲得的組間變異係數在0.92%～3.74%之間；獲得組間變異係數在1.05%～4.28%之間，表明建立的ELISA具有良好的重複性。
2.8 臨床樣品檢測
利用建立的ELISA方法對本團隊收集的45份豬血清進行檢測，其中陽性35份，陽性率為77.78%（35/45）。
四、HP PRRSV血清學抗體檢測ELISA試劑盒
1、抗原表位的選取、串聯表達及鑑定
通過對經典型PRRSV和HP-PRRSV的差異區的非結構蛋白Nsp2（Nsp2）的進行胺基酸序列比對發現，經典型PRRSV和HP-PRRSV存在非結構蛋白Nsp2 的差異「RPMTPLSEPIFLSAPRHKFQQVEEANPAT」（見圖4-1）
將該表位的核苷酸序列「TCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTTTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCG」，在序列末端（5』端和3』端）分別引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點（方框內序列），並在3端酶切位點前引入終止密碼子TGA。優化後的序列進行基因合成後，克隆到原核表達載體pET32a上。按照常規原核表達方法對構建的陽性重組質粒pET32a-Nsp2。將pET32a-Nsp2質粒轉化原核表達感受態細胞BL21(DE3)感受態後鑑定獲得陽性單菌落（陽性菌培養液）。取100 μL陽性菌培養液加入5mL LB液體培養基 (Amp+、 100μg/ml)，培養至OD600 nm值約為0.6。加入不同終濃度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG進行誘導，37℃誘導（誘導時間分別為2h、3h、4h、5h和6h）。經SDS-PAGE分析發現，優化後的條件為IPTG終濃度為0.50 mM，37℃誘導4h即可獲得高效表達，經分析表達蛋白基本為可溶性表達，目的大小約為24.7 ku（見圖4-2）。將目的蛋白轉膜後進行Western Blot鑑定，可見串聯表位表達的蛋白可與PRRSV高免血清發生特異性反應（見圖4-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 間接方法的操作程序
（1）包被：將表達的目的蛋白用包被液稀釋成一定濃度，包被酶標板，100μL/孔，4℃過夜，次日棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃封閉2h（或4℃封閉過夜），再棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（3）加血清：血清用抗體稀釋液按一定倍數稀釋，加入酶標板中，100μL/孔，同時設陰性對照孔，陽性對照孔和空白對照孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（4）加酶標二抗：將酶標二抗用二抗稀釋液（也可用PBST）按一定倍數稀釋（商品化試劑可直接按照推薦的濃度稀釋），加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育2h，棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5min，250μL/孔，最後一次拍幹。
（5） TMB反應液顯色：將TMB反應液加入酶標板上，100μL/孔，室溫避光反應5-10 min。
（6）加入終止液：TMB顯色後加入終止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶標儀測定：用酶標儀測定OD450值。
為便於後續實驗室的統一，本發明中將包被時間明確為4℃包被過夜；封閉時間明確為4℃封閉過夜；一抗孵育時間明確為37℃孵育2h；二抗孵育時間明確為37℃孵育90min；顯色7 min後測定OD450值。
2.2 臨界值的判斷標準
選取30份臨床收集的PRRSV陰性血清，對30份陰性血清進行ELISA檢測。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X），標準方差（SD）。本發明統一規定，臨界值（C）=平均數（X）+3標準方差（SD）。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧臨界值（C）判為陽性，其他均判為陰性。
2.3 試劑
ELISA平板購自Costar；HRP標記的山羊抗豬酶標二抗購自Abcam；ELISA顯色液TMB購自武漢博士德生物工程有限公司。碳酸鹽包被液、抗體稀釋液和封閉液均購自碧雲天生物技術研究所。
2.4 血清
歐洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）高免血清和豬陰性血清由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所製備並保存。
2.5 ELISA檢測條件
經矩陣滴定後獲得最適條件為包被抗原（純化後的目的蛋白）0.75 μg/mL、血清稀釋度為1：80、酶標二抗濃度1：5000。37℃孵育90min，避光顯色7min，即可獲得最大化P/N值。對30份進行檢測後計算得到OD450nm值的平均數（X）=0.2607、標準方差（SD）=0.0413，得到本研究的臨界值（C）為0.3843。即本實驗建立的ELISA對臨床樣品進行檢測OD450nm值≧0.3843判為陽性，其他均判為陰性。
2.6 特異性實驗
利用優化後的條件，對豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性乙型腦炎病毒（JEV）陽性血清進行檢測OD450nm值均在0.380以內；豬繁殖與呼吸症候群病毒（美洲型PRRSV和HP PRRSV）陽性血清OD450nm值為1.207和0.284；陰性血清OD450nm值為0.238；表明本研究建立的方法特異性強，與常規病原陽性血清均無交叉反應。
2.7 重複性實驗
利用優化後的條件建立的ELISA條件進行檢測，獲得的組間變異係數在1.22%～4.84%之間；獲得組間變異係數在1.31%～5.16%之間，表明建立的ELISA具有良好的重複性。
2.8 臨床樣品檢測
利用建立的ELISA方法對本團隊收集的45份豬血清進行檢測，其中陽性6份，陽性率為13.33%（6/45）。
五、不同類型PRRSV的試劑盒組裝
利用建立的4個間接ELISA方法，對45份血清進行PRRSV血清學檢測，其中歐洲型PRRSV有2份；美洲型PRRSV（含經典型PRRSV和HP PRRSV）有35份；HP PRRSV有29份（35-6=29）。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
SEQUENCE LISTING
福建省農科院畜牧獸醫研究所
一種豬繁殖與呼吸症候群病毒血清學鑑別診斷試劑盒
9
9
PatentIn version 3.3
1
113
DNA
人工序列
1
ggatccccgg agaagccgca tttcccgctg gcgactgaag atgacgtccg tcatcacttt 60
accccgagta cccgtgtttc agcggaacaa tggggtcgtc tctgagcggc cgc 113
2
77
DNA
人工序列
2
ggatccttcc gacctcacgg ggtctcagca gcgcaagaga aaatttcctt cggaaagtcg 60
tcccaatgag cggccgc 77
3
77
DNA
人工序列
3
ggatccgaag gtcacctgat cgacctcaag agagttgaag gtcacctgat cgacctcaag 60
agagtttgag cggccgc 77
4
87
DNA
人工序列
4
tcccgaccga tgacgccctt gagtgagcca atttttttgt ctgcaccgcg acacaaattt 60
cagcaggtgg aagaagcgaa tccggcg 87
5
21
PRT
人工序列
5
Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His
1 5 10 15
His Phe Thr Pro Ser
20
6
11
PRT
人工序列
6
Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu
1 5 10
7
20
PRT
人工序列
7
Leu Arg Pro His Gly Val Ser Ala Ala Gln Glu Glu Ile Pro Phe Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln
20
8
10
PRT
人工序列
8
Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val
1 5 10
9
29
PRT
人工序列
9
Arg Pro Met Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ile Phe Leu Ser Ala Pro Arg
1 5 10 15
His Lys Phe Gln Gln Val Glu Glu Ala Asn Pro Ala Thr
20 25