修飾肽的製造方法

2023-10-26 10:12:52 2

專利名稱：修飾肽的製造方法
技術領域：
本發明涉及修飾肽或蛋白質的製造方法，以及含有一個以上適當採用上述方法修飾過的胺基酸或非胺基酸的被保護的肽片段的製造方法。
背景技術：
1999年，從大鼠胃中分離純化了內源性生長激素分泌促進因子(GHS)，它作用於作為孤獨受體之一的生長激素分泌促進因子受體(GHS-R)，被命名為促成長素(ghrelin)[Kojima等，Nature，402卷p.656-660，1999年]。已知這種肽化合物具有特徵性結構，即絲氨酸的羥基被脂肪酸醯化。進一步又從非大鼠的脊椎動物，例如人類、小鼠、豬、雞、鰻魚、牛、馬、綿羊、蛙和鮭魚，以及犬中分離到促成長素，該分子在第3位的絲氨酸或蘇氨酸殘基含有被脂肪酸修飾的結構，或者通過cDNA推定了它們的胺基酸序列(見表1)。例如人促成長素由28個胺基酸組成，其第3位的絲氨酸側鏈被脂肪酸(正辛酸)醯化。已知這種新發現的肽化合物有很強的促進生長激素分泌活性，並且第3位的絲氨酸或蘇氨酸被脂肪酸修飾是其表現活性的必要條件[Kojima等，Nature，402卷p.656-660，1999年]。同時，還闡明了由胃中分泌的促成長素作為血液中激素有調節生長激素分泌的功能，因而促成長素的生理功能和在醫藥業中的應用受到人們關注。
表1人類(Human)GSS(正辛醯基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRGSS(正辛醯基)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR大鼠(Rat) GSS(正辛醯基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRGSS(正辛醯基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR
小鼠(Mouse)GSS(正辛醯基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR豬(Porcine)GSS(正辛醯基)FLSPEHQKVQQRKESKKPPAKLKPR牛(Bovine) GSS(正辛醯基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR綿羊(Ovine)GSS(正辛醯基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR犬(Canine) GSS(正辛醯基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR鰻魚(Eel) GSS(正辛醯基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2鮭魚(Trout)GSS(正辛醯基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2GSS(正辛醯基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2雞(Chicken)GSS(正辛醯基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTARGSS(正辛醯基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARGSS(正辛醯基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH牛蛙(Bullfrog) GSS(正辛醯基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMGSS(正癸醯基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMGSS(正辛醯基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN羅非魚(Tilapia)GSS(正辛醯基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2鯰魚(Catfish) GSS(正辛醯基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2GSS(正辛醯基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG馬(Equine) GSS(正丁醯基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR除辛醯基(C8)外，還有丁醯基(C4)、己醯基(C6)、癸醯基(C10)、十二烷醯基(C12)等的修飾體。另外還有不飽和脂肪酸形成的修飾體。
也像促成長素和縮膽囊素一樣，在肽或蛋白質中的胺基酸序列裡的某個特定胺基酸殘基受到氨醯化、磺醯化、糖基化或磷酸化等化學修飾，因而表現出它的生理學功能。在生物體內，這些修飾過程是由精確的酶反應來完成的。迄今尚未報告過高效大量生產優質的經修飾的肽或蛋白質的一般方法。由於已經證明促成長素是由於其特定的胺基酸側鏈受到長鏈脂肪酸修飾而表現出促進生長激素分泌的作用，所以脂肪酸修飾是其必要的結構因素，但是現在還不清楚在生物體內是由怎樣的酶來催化，使脂肪酸在特定的胺基酸側鏈的羥基上形成酯鍵？以及脂肪酸分子是否會伸長？我們剛剛了解到促成長素是具有胺基酸側鏈的羥基被脂肪酸修飾這種結構的特別的生理活性肽，因此，這種肽化合物是可以利用的肽激素，可望作為成長障礙的治療藥物和促進分泌生長激素的藥物，而且尚未出現可用的製造方法來生產這種含有在特定羥基的胺基酸側鏈上被脂肪酸修飾的肽化合物，即現在還沒有建立適合大量工業生產的方法。
當前，胰島素、生長激素、降鈣素、心房性鈉利尿肽、LH-RH衍生物、副腎上腺皮質激素衍生物等多種肽或蛋白質製劑已經作為藥物使用。已知這些肽或蛋白質的製造方法有化學合成法、酶法和基因重組法等。隨不同要求而選擇不同方法，一般殘基少的選用化學合成法，殘基多的選用酶法和基因重組法。
例如化學合成法是最可靠的製造諸如具有促成長素等經修飾的生理活性肽或蛋白質的方法。製造經修飾的肽或蛋白質的方法中，化學合成法已有許多報導。以促成長素為例，有Bednarek等(J.Med.Chem.，43卷p.4370-4376，2000年)、Matsumoto等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，284卷p.655-659，2001年)的報告。同時，在國際公開專利中，編號為WO01/07475的公報中，記載了用化學合成法製造促成長素及其衍生物肽或它的鹽類的方法。然而，在化學合成方法中，為確保品質(純度)，合成的肽鏈長度將受到限制。雖然通過液相化學合成可以合成高純度的肽，但是要合成長鏈的肽，一般在溶解度、長度和反應控制等方面都缺少專門技術，因此要高效大量製造，用液相化學合成方法難以實現。另一方面，在樹脂上進行肽鏈延長的固相化學合成，工序簡單，有利於實現大量生產，但是要得到一定純度的目的產物又構建足夠的鏈長，則受到限制。此外，由於試劑過量使用，要製造特定長度肽，在經濟上也因為不合算而成為問題。
同時，用酶將肽片段通過酶法加以結合的方法，雖然有可以精確保護胺基酸側鏈的優點，但是這種方法由於通常使用逆向水解反應，所以難以從理論上設定反應條件，因而沒有採用。
另一方面，用基因重組法製造生理活性肽或蛋白質是適用於大量生產的方法。然而採用最適宜用於生產的大腸桿菌等原核生物，由於它們不具備翻譯後修飾的機制，難以用於直接製造具有修飾部位的肽化合物。採用酵母菌或各種卵細胞等真核細胞進行基因重組，可以進行糖修飾、醯化、磺化或磷酸化等修飾，但是要僅僅導入一定長度的脂肪酸是困難的。被分離的促成長素中，不僅有辛酸(C8)，還發現有丁酸(C8)、癸酸(C10)或不飽和脂肪酸，顯然要控制特定鏈長的脂肪酸向肽分子中導入是很困難的。再者，一般用真核細胞都不宜用於生產，因此將具有修飾系統的酵母菌或各種卵細胞的生產株系用來大量生產促成長素等受到修飾的肽或蛋白質，改進的餘地還很大。
如上所述，合成經修飾肽或蛋白質的化學合成方法已經有多種報導，但用於大量生產，在收率、成本等方面還有改進的餘地。而用大腸桿菌等原核細胞通過基因重組直接生產受到修飾的肽或蛋白質是困難的。同時，用酵母菌等真核細胞通過基因重組來製造，在純度和生產性能方面又存在問題，要克服這些困難，也有改良的餘地。通過酶水解反應的逆反應進行酶法合成，也難以設定各種縮合反應的條件，不能說是有利於大量生產的方法。
因此，單獨採用已知的化學合成法、酶法或基因重組法高效製造在純度和數量上滿足要求的經過糖基化、醯化、磺醯化或磷酸化修飾的肽或蛋白質，在技術上有進一步改良的餘地。
發揚上述方法之優點，彌補缺點的途徑之一是將化學合成法和基因重組法加以組合的半合成方法。本發明的要點是高效製造具有適宜縮合形態的肽化合物片段。含有被修飾胺基酸殘基的肽片段(以下簡稱修飾成分)和不含有被修飾胺基酸殘基的肽片段(以下簡稱非修飾成分)，氨基末端或羧基末端均可，修飾成分為多數也可以。將目的肽或蛋白質加以適當組合，可以設計出製造方法。現舉一例，詳細說明與存在氨基末端的修飾成分的肽片段發生縮合的另一肽片段是非修飾成分的情況。
近來受到關注的天然化學連接法(Native chemical ligation)[Dawson等，Science，266卷p.776-779，1994年]有在連接部位殘留半胱氨酸殘基的缺點，最近提出了該方法的改良方法硫酯法。例如Kawakami等報告了用硫酯法合成磷酸化肽(Tetrahedron Letter，41卷，p.2625-2628，2000年)。
以下用具體例子說明上述硫酯法。在合成p21Max蛋白質的實例中(Kawakami等，Tetrahedron Letter，39卷，p.7901-7904，1998年)，用固相化學合成法以硫酯的形態製造出含有磷酸修飾部位的肽片段(修飾部分)(13聚體)。另一方面，以大腸桿菌製造含有在非修飾成分的氨基末端附加上胺基酸殘基序列的肽片段，這種化合物在二價銅離子或鎳離子存在的條件下，用乙醛酸作用，則在氨基末端附加的胺基酸殘基變成α酮酯醯基，側鏈氨基便被Boc基保護。然後用苯二胺除去α酮酯醯基，製備成在氨基末端只游離出胺基酸殘基的氨基的肽片段(非修飾成分)。最後加入銀鹽和過量的HOOBt等活性酯化劑，將這兩種片段加以縮合。
然而，上述方法還存在以下問題。在製造肽片段(修飾成分)時，該硫酯的穩定性還有問題，報導的收率為11％。此外，在製造肽片段(非修飾成分)時，本方法所用的α酮酯醯基使氨基末端氨基游離的化學方法有很高的選擇性，但α酮酯醯基不穩定，而且是用苯二胺等誘變劑除去α酮酯醯基，在製造作為醫藥品的生理活性肽化合物方面還存在安全性的問題。另外，在兩種片段進行縮合反應時，由於使用了銀鹽和過量的HOOBt等活性酯化劑，在外消旋化、毒性和成本等方面也存在問題。
將化學合成與基因重組法相結合的半合成法，在編號為WO01/07475的國際公開專利公報中，記載了製造促成長素及其衍生物肽或它的鹽類的方法。具體來說，是將化學合成的大鼠促成長素(1-5)和以基因重組法製造的大鼠促成長素(6-28)加以縮合，製成大鼠促成長素的方法。但是這種方法還存在以下問題，要成為高效的可應用工業生產方法還有許多地方需要改良。這些問題包括為了用TFA從樹脂上脫離出肽鏈而得到大鼠促成長素(1-5)，並同時除去Boc基和t-Bu基，必須在氨基末端再度導入Boc基，同時，為了使絲氨酸側鏈變成不受保護，在與大鼠促成長素(6-28)縮合時，不能使用強活化劑，因而在提高生產實用性方面還有工作要做。同時，將保護的大鼠促成長素(1-5)和保護的大鼠促成長素(6-28)加以縮合的過程中，醯化的肽片段的羧基末端胺基酸發生外消旋化，也需要做工作以便阻止這種變化。再者，促成長素(m-n)表示從促成長素的氨基末端開始有第m到第n個胺基酸序列的肽片段。下同。
在製備保護性肽片段(非修飾成分)時，也有若干課題需要進行。在編號為WO01/07475的國際公開專利公報中，記載了保護性大鼠促成長素(6-28)的製造方法。該方法基本上採用兩步酶法處理法(國際公開號WO099/38984)，該工序使用的兩種酶是重組V8蛋白酶衍生物(rV8D5)(日本公開專利平成9年-47291號公報)和Kex2蛋白酶(日本公開專利平成10年-229884號公報)。可是，表達含有保護性大鼠促成長素(6-28)的融合蛋白的質粒(Pg97s rGR)是以高表達大腸桿菌β-半乳糖苷酶衍生物和副甲狀腺激素融合蛋白的質粒(日本公開專利平成9年-296000號公報)為基礎構建的，因此在製備保護性肽片段(非修飾成分)時便會遇到必須選擇適合其胺基酸序列的接頭序列的問題。
保護性大鼠促成長素(6-28)在水溶液中會出現保護基團脫離的現象，在純化時回收率非常低，只有10％，從大量穩定提供促成長素的角度也還存在問題。
通過組合化學合成法和基因重組法高效率製造，而且得到可以用於醫藥的安全性高的產品，為了實現該目的，從以上敘述中，提出了一個製造被修飾的生理活性肽或蛋白質的新課題。

發明內容
本發明以提供高效工業生產被修飾肽或蛋白質方法為目的。具體而言，本發明的目的是通過用化學合成法製造含有修飾部位的肽片段(修飾成分)，用基因重組的方法製造不含修飾部位的肽片段(非修飾成分)，然後將兩者加以縮合，從而提供一種優質的經過修飾的生理活性肽或蛋白質的高效生產方法。如前所述，這兩種肽片段(修飾成分和非修飾成分)，無論氨基末端或羧基末端均可，修飾成分為多數亦可。可以將所需要的肽片段或蛋白質加以適當組合來設計製造方法。同時本發明的目的是提供適合縮合反應而不影響被修飾部位結構的溫和條件下製造保護性肽片段(修飾成分)的方法，以及適合與被保護的肽片段(非修飾成分)發生縮合反應的保護性肽片段(修飾成分)的製造方法。而且本發明的目的還是，提供一種使得到的產品能夠用做醫藥品，因而是高度安全的被修飾的生理活性肽或蛋白質的製造方法。本發明尤其是以提供一種工業生產方法製備促成長素及其衍生物的簡便而高效方法為目的。
本發明人等建立了一種大幅度簡化了生產工序且高效的方法，即改良了以促成長素為原料，合成含有促成長素及其衍生物中的被醯化基團修飾的胺基酸的肽片段(修飾成分)的方法。發現在2-氯代三甲苯基樹脂等弱酸性脫離樹脂上結合肽片段(修飾成分)的主肽鏈，連續對殘基進行修飾後，用醋酸等弱酸處理，可以使受到保護性修飾的肽從固相樹脂上脫離下來。已知過去的方法是用三溴醋酸等從樹脂脫離，在Wang樹脂等類樹脂上導入修飾基團，然後從樹脂上脫離下來並同時使保護基團脫離。可是在本方法中，因為要把洗脫出來的肽片段(修飾成分)接著提供給與另一條肽片段(非修飾成分)進行縮合反應，又因為從樹脂上脫離下來的同時保護性基團也完全脫離了，必須再度導入保護性基團，因此從簡化工序和效率的角度來看並不理想。本發明人經過精心探討，發現了進行選擇性修飾的方法。即在從樹脂上脫離出肽片段(修飾成分)時採用弱酸(包括稀釋的強酸)不易使胺基酸側鏈上的保護性基團脫離；又發現採用氟化季胺鹽可以使肽不從樹脂上脫離，而使在樹脂上的特定胺基酸側鏈的保護性基團脫離。在氟化季胺鹽中，已經應用過氟化四丁胺(TBAF)作為把肽化合物從固相樹脂上脫離下來的試劑(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，p.414-415，1988年；Tetrahedron Letter，34卷，p.7599-7602，1993年)，本發明人發現在弱酸性樹脂上結合的肽經TBAF處理時並不能從樹脂上脫離下來。由於用TBAF不會使肽化合物從樹脂上脫離下來，所以可以在樹脂上使特定胺基酸側鏈的保護性基團脫離而選擇性地修飾胺基酸殘基，然後採用不易使胺基酸側鏈保護性基團脫離的弱酸(包括稀釋的強酸)把肽片段(修飾成分)從樹脂上脫離下來，這樣在隨後與重組工序肽片段(非修飾成分)進行縮合反應時，就無須在事前採取保護肽片段(修飾成分)的工序，這樣便在很大程度上簡化了生產工序，提高了效率。
本發明人進而改良了製備促成長素的保護性肽片段(非修飾成分)的製備方法，發現用二步酶處理法大量製備保護性促成長素(8-28)片段的最佳接頭序列。本發明人還建立了在很大程度上簡化了工序從而提高了效率的方法，該方法在不使保護性基團脫離的pH條件提純保護性肽片段(非修飾成分)。這是由於發現製備保護性肽時保護性基團脫離的現象與水溶液的pH及溫度有關，將水溶液的pH調節到4-8，即可阻止保護性基團脫離，從而得以高收率地製備保護性肽片段(非修飾成分)。
此外，還改良了各種肽片段的縮合方法，阻止了胺基酸活化時及縮合反應時發生的外消旋化作用，發現了獲得質優高效製備促成長素或它們的衍生物的方法。特別是採用弱酸性脫離樹脂製造促成長素的方法，優點是阻止了由副反應而來的二酮基哌嗪的形成。由於羧基末端第7個胺基酸殘基是脯氨酸，在將第3個胺基酸(Leu)縮合到二肽(-Ser-Pro-)上時，可以使二酮基哌嗪被纏裹而從樹脂上脫離下來，從而可以將其控制到最小限度。
根據這個發現，不僅是烷基，而且還可以把醯基、磷酸基或硫酸基，通過糖苷鍵、二硫鍵、醚鍵、硫醚鍵或醯胺鍵等結合到胺基酸或非胺基酸側鏈上，開發出能夠容易製造具有各種修飾結構的生理活性肽或蛋白質的技術，從而完成了本發明。
本發明如下(1)以採用弱酸性脫離樹脂為特徵，製造含有一個以上用式1-A(R)-表示的經修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段的方法。(式1中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示結合在A的側鏈上的取代基)。
(2)(a)在弱酸性脫離樹脂上，製備具有預定序列的肽片段，該片段由側鏈被保護的胺基酸或/和非胺基酸組成；(b)不使上述肽片段從弱酸性樹脂上脫離，而使受取代基修飾的胺基酸或非胺基酸A的側鏈上的保護性基團脫保護；(c)用取代基R修飾上述脫保護的側鏈；(d)以從弱酸性脫離樹脂上將肽片段脫離為特徵的上述第(1)項記載的製造方法。
(3)上述第(1)和(2)項記載的肽片段製造方法，其特徵是以甲矽烷基系化合物為胺基酸或非胺基酸A側鏈的保護基，在上述保護基團脫保護中採用氟化季胺鹽。
(4)上述第(3)項記載的肽片段製造方法，其特徵是甲矽烷基系保護基為叔丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)、叔丁基二辛基甲矽烷基(TBDPS)、三異丙基甲矽烷基(TIPS)、三異丁基甲矽烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲矽烷基(ThxDMS)或三苯基甲矽烷基(TPS)，氟化季胺鹽為氟化四丁基銨(TBAF)、氟化四己基銨(TEF)或氟化銨。
(5)上述第(1)-(4)項記載的肽片段製造方法，其特徵是A為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；R通過酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵等與A的側鏈結合(6)上述第(5)項記載的肽片段製造方法，其特徵是A為絲氨酸或蘇氨酸，R通過酯鍵與A的側鏈結合。
(7)上述第(6)項記載的肽片段製造方法，其特徵是肽片段是促成長素或它的衍生物，或是含有上述促成長素或它的衍生物中被修飾胺基酸的部分。
(8)修飾肽片段或蛋白質的製造方法，其特徵是(a)用弱酸性脫離樹脂製備被保護的肽片段，該片段含有一個以上以式1-A(R)-表示的經修飾的胺基酸或非胺基酸(式1中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示結合在A的側鏈上的取代基)；(b)製造與上述(a)中的肽片段不同的另一個的肽，即不含有被修飾胺基酸或非胺基酸保護的肽片段；將(a)及(b)所製造的肽片段加以縮合。
(9)上述第(8)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法。其特徵是按上述第(2)-(4)項記載方法製造含有一個以上被修飾胺基酸或非胺基酸的肽片段。
(10)上述第(8)和(9)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是A為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；R通過酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵等與A的側鏈結合。
(11)上述第(10)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是A為絲氨酸或蘇氨酸，R通過酯鍵與A的側鏈結合。
(12)上述第(11)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是修飾肽或蛋白質是促成長素或它的衍生物。
(13)上述第(8)-(12)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是肽片段的縮合採用縮合劑進行。
(14)上述第(13)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是縮合劑為2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷醯疊氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)。
(15)上述第(13)項記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是縮合劑為二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，使用上述縮合劑的肽片段的縮合是在1-羥基苯並三唑(HOBt)、1-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)或者3，4-二氫-3-羥基-4-氧基-苯並三嗪(HOOBt)的存在下進行。
更具體而言，本發明在通過肽片段縮合製造修飾肽或蛋白質的過程中，包括(a)被修飾的生理活性肽或蛋白質的製造方法，其特徵是製造含有修飾基團的肽片段時2-氯代三苯甲基樹脂等弱酸性樹脂進行合成；(b)被修飾的生理活性肽或蛋白質，特別是促成長素或它的衍生物的製造方法，其特徵是在合成含有醯基、硫酸基等容易被酸洗脫的肽片段時，採用2-氯代三苯甲基樹脂等弱酸性樹脂；(c)促成長素或它的衍生物的製造方法，其特徵是在將含被修飾成分的肽片段(修飾成分)和不含修飾成分的肽片段(非修飾成分)進行縮合時，在被活化的氨基末端一側肽片段的羧基末端殘基上插入脯氨酸，從而阻止了組成胺基酸的外消旋化；(d)在製造促成長素或它的衍生物時採用效果顯著的良好縮合劑。
而且，本發明還包括(1)含有一個以上被修飾胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其特徵是具有由胺基酸和/或非胺基酸組成的所需要的序列，其中至少有一個胺基酸或非胺基酸是受到按式1-A(R)-表示的經修飾的胺基酸或非胺基酸(式1中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示結合在A的側鏈上的為進行修飾而導入的取代基)，而且要從胺基酸或非胺基酸的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、二氫吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上可能在製造肽片段時引起不利副反應的反應性取代基用保護性基團給予保護，在弱酸性脫離樹脂上製備這種被保護的肽片段，然後在弱酸性條件下將上述肽片段從弱酸性樹脂上脫離下來而不會使該片段上的保護性基團脫離下來。
(2)上述第(1)項記載的肽片段製造方法，其特徵是(a)在弱酸性脫離樹脂上製備被保護的具有由胺基酸或非胺基酸組成的特定序列肽片段，這種保護是從它們的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選擇出一種以上的在製造肽片段時引起不會引起副反應的反應性取代基用保護性基團給予保護，(b)當上述肽片段在弱酸性脫離樹脂上不會脫離，受取代基R修飾的胺基酸或非胺基酸A的側鏈上的反應性功能基被導入著保護基時，將該保護性基團脫保護；(c)用取代基R修飾上述脫保護的側鏈；(d)在弱酸性條件下將上述肽片段從弱酸性樹脂上脫離下來而不會使該片段上的保護性基團脫離。
(3)含有一個以上式1-A(R)-(式中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示結合在A的側鏈上的的取代基)所表示的經修飾的胺基酸或非胺基酸保護的多肽片段的製造方法，其特徵是(a)在弱酸性脫離樹脂上製備被保護的具有由胺基酸或非胺基酸組成的特定序列肽片段，這種保護是從它們的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上反應性取代基用保護性基團給予保護，(b)在弱酸性條件下將上述肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來，而不使該肽片段中的保護性基團脫離；(c)將已脫離的肽片段上至少一個胺基酸或非胺基酸A的側鏈上的對反應性取代基的保護基脫保護；(d)用取代基R修飾上述已脫保護的側鏈。
(4)上述第(2)和(3)項記載的肽片段製造方法中，被取代基R修飾的胺基酸或非胺基酸A的側鏈上反應性取代基的保護性基團是甲矽烷基系保護基，該保護基的脫保護則採用氟化季銨鹽。
(5)上述第(4)項記載的肽片段製造方法中，甲矽烷基系保護基是叔丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲矽烷基(TBDPS)、三異丙基甲矽烷基(TIPS)、三異丁基甲矽烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲矽烷基(ThxDMS)或三苯基甲矽烷基(TPS)、氟化季銨是氟化四丁基銨(TBAF)、氟化四乙基銨(TEF)或者氟化銨。
(6)上述第(1)至(5)項記載的肽片段製造方法中，A為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；R通過酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵等與A的側鏈上反應性基團結合。
(7)上述第(6)項記載的肽片段製造方法中，A為絲氨酸或蘇氨酸，R通過酯鍵與A的側鏈上羥基結合。
(8)上述第(7)項記載的肽片段製造方法中，肽片段是促成長素或它的衍生物，或是含有上述促成長素或它的衍生物中被修飾胺基酸的肽片段。
(9)修飾性類或蛋白質的製造方法，其特徵是(a)用上述第(1)至(8)項記載的方法製造含有一個以上被修飾胺基酸或非胺基酸保護的肽片段；(b)製造與(a)所述肽片段不同的另一條肽片段，該片段不含被修飾被修飾胺基酸或非胺基酸，並從它們的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、二氫吲哚基、巰基和羧基等基團中選擇出一種以上可能引起不利副反應的反應性功能基加以保護，再將由(a)和(b)製造的肽片段加以縮合。
(10)上述第(9)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，肽片段的縮合採用縮合劑。
(11)上述第(10)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，縮合劑為2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷醯疊氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)。
(12)上述第(10)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，縮合劑為二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，使用上述縮合劑的肽片段的縮合是在1-羥基苯並三唑(HOBt)、1-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)或者3，4-二氫-3-羥基-4-氧基-苯並三嗪(HOOBt)的存在下進行。
(13)上述第(9)至(12)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，不含有被修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段藉助酶法或/和基因重組法製造。
(14)上述第(13)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，採取包括以下工序進行製造工序(1)將編碼具有上述肽片段的胺基酸序列的肽化合物(在本項中，以下稱為目的肽)的鹼基序列，或編碼依目的肽的要求通過接頭序列附加了保護性肽的融合蛋白的鹼基序列，藉助表達載體轉化細胞，培養該細胞，從該細胞的培養物中提取目的肽或上述融合蛋白；工序(2)在按工序(1)提取融合蛋白時，從得到的融合蛋白中切割分離保護性肽和所要求的接頭序列，根據需要，進一步純化目的肽；工序(3)從在工序(1)和(2)中得到的目的肽側鏈上的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上可能引起不利副反應的反應性取代基用保護性基團加以保護。
(15)上述第(14)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，工序(2)中保護性肽以及所要求的接頭序列，和目的肽的切割分離，採用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物分兩步進行。
(16)上述第(14)或(15)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法中，接頭序列是以編號27記載的序列。
(17)上述第(13)～(16)項記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其特徵是肽片段是不含有促成長素或它的衍生物中受到修飾的的胺基酸或非胺基酸的肽片段。
(18)上述第(13)～(17)項記載的修飾性肽肽或蛋白質的製造方法，其特徵是不含有受到修飾的的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段在pH4-8的溶液中純化和保存。
(19)上述第(13)～(18)項記載的修飾性肽肽或蛋白質的製造方法中，保護基是Boc。
(20)不含有受到修飾的的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其特徵是包含以下工序工序(1)將編碼具有所要求的胺基酸序列的肽化合物(在本項中，以下稱為目的肽)的鹼基序列，或編碼依目的肽的要求通過接頭序列附加了保護性肽的融合蛋白的鹼基序列，藉助表達載體轉化細胞，培養該細胞，從該細胞的培養物中提取目的肽或上述融合蛋白；工序(2)在按工序(1)提取融合蛋白時，從得到的融合蛋白中切割分離保護性肽和所要求的接頭序列，以及目的肽，進一步按要求進行純化；工序(3)從在工序(1)或(2)中得到的目的肽側鏈上的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上可能引起不利副反應的反應性取代基用保護性基團加以保護；工序(4)把從工序(3)中得到的被保護的目的肽在pH4-8的溶液中純化和保存。
(21)上述第(20)項記載的不含有受到修飾的的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法中，保護基為Boc。
(22)上述第(20)或(21)項記載的不含有受到修飾的的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法中，工序(2)中的保護性肽和所要求的接頭序列和目的肽的切割分離，採用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物分兩步進行。
(23)上述第(20)～(22)項記載的不含有受到修飾的的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法中，接頭序列是以編號27記載的序列。
(24)上述第(20)～(23)項記載的被修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是肽片段是不含促成長素及其衍生物中被修飾胺基酸或非胺基酸的肽片段。
附圖的簡單說明

圖1A表示全合成的人類促成長素[hGhrelin(8-28)]的寡聚DNA和胺基酸序列表；圖1B表示用質粒p117-8-28oRR表達的hGhrelin(8-28)融合蛋白的胺基酸序列。
圖2表示純化的[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)的HPLC分析結果。ア箭頭所指為[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)的洗脫峰。
圖3表示肽片段的縮合反應。A峰為[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)峰；B峰為[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；C峰為[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)，Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin峰；D峰為hGhrelin峰。
圖4表示純化的人類促成長素的HPLC測定結果圖5表示Kex2蛋白酶不同切斷識別部位的融合蛋白的胺基酸序列圖6表示用HPLC測定第5圖中用Kex2蛋白酶切斷融合蛋白效率的結果。圖6A表示PR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用後的HPLC分析結果；圖6B表示RR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用後的HPLC分析結果；圖6C表示KR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用後的HPLC分析結果。峰ア)是含有接頭序列的[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；峰イ)是[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；峰ウ)是[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(16-28)峰。
圖7表示為確定培養物中最適融合蛋白而製備的各種hGhrelin(8-28)融合蛋白的胺基酸序列。
圖8A表示不同融合蛋白引起的培養物的差異；圖8B表示產生各種融合蛋白的培養物中菌體破碎前後濁度(由於融合蛋白不同引起的差異)。
圖9表示[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)穩定性的評價結果。
圖10表示[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)穩定性的評價結果。
實施發明的最佳方式說明本發明時，以下所用名詞作下述定義。
是指同一分子內含有氨基和羧基的化合物，例如L-胺基酸、D-胺基酸、α-胺基酸、β-胺基酸、γ-胺基酸、天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸等全部胺基酸。
是指由基因編碼的20種胺基酸。
指α-胺基酸的α碳原子被不存在於天然胺基酸或與其相對應的D-胺基酸中的任何取代基修飾的化合物。α-胺基酸可用以下結構式表示 作為以R』和R」表示的取代基，具有不存在於天然胺基酸或與其相對應的D-胺基酸中的任何取代基或氫原子(R』和R」都代表氫原子的情況除外)。
指由C、H、O、N和S五種元素中1種以上的任何元素原子組成的胺基酸結構類似物，是不包括在天然或非天然胺基酸中的化合物。其分子鏈的長度多半與肽或二肽相當。例如NH2-CH(CH2OH)-CH3、CH3-CH(R11)-COOH、CH3-CH(R11)-CH3(分子鏈的長度與肽相當)，再如NH2-(CH2)3-CH(CH2OH)-COOH、NH2-(CH2)4-COOH、NH2-C(CH3)2-CH(CH2)3-COOH、NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH、NH2-CH(CH2)3-CH(CH2OH)-CH3、NH2-(CH2)3-CH(R11)-CH3(分子鏈的長度與二肽相當)等都是本發明所指非胺基酸。其中R11表示天然胺基酸的側鏈。肽中的所謂[非胺基酸殘基]，例如-NH-CH(CH2OH)-CH2-、-CH2-CH(R11)-CO-、-CH2-CH(R11)-CH2-(分子鏈的長度與肽相當)，以及-NH-(CH2)3-CH(CH2OH)-CO-、-NH-(CH2)4-CO-、-NH-C(CH3)2-CH(CH2)3-CO-、-NH-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-CO-、-NH-(CH2)3-CH(CH2OH)-CH2-、-NH-(CH2)3-CH(R11)-CH3-(分子鏈的長度與二肽相當)，它們與相鄰胺基酸的鍵都不是肽鍵。
和[肽片段]指多個胺基酸通過肽鍵相連組成的化合物。當含有非胺基酸時，有時該非胺基酸與相鄰的胺基酸相連接的鍵不是肽鍵，也稱為肽和肽片段。
指肽片段的胺基酸或非胺基酸的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上在製備肽片段時不能引起不利副反應的反應性取代基用保護性基團加以保護的肽片段。本發明中以下簡稱[保護性肽片段]。
用式1-A(R)-表示。(式1中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示為修飾該化合物而導入並結合在A的側鏈上的取代基)。
上述取代基R可以和從胺基酸或非胺基酸側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團除去氫原子而形成的基團相結合，也可以直接和胺基酸或非胺基酸的α-碳原子結合。取代基R也可以是胺基酸或非胺基酸的修飾的側鏈。
上述取代基並無特別限定。例如可以用以下幾個式來表示R基團式2-(CH2)n-P-Q(式中n表示整數1-10；P表示-CO-、-SO2-、-CO-O-、-O-CO-、-O-、-CO-S-、-S-C-O-、-CS-S-、-S-CS-、-S-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-CS-NH-CS-、-S-S-、-CS-NH-或-NH-CS-；Q表示氫原子或C1-35，最好是C1-20烷基、C6-20芳基和C7-16芳烷基)式3-P-Q(式中P和Q表示的意義與式2相同)式4-Q(式中Q表示的意義與式2相同)。
此外，上述R與胺基酸或非胺基酸的α-碳原子直接結合時，也可以通過或不通過含1個以上碳原子的烷基以酯基、醚基、二硫基、硫酯基、醯胺基或脲基中的任何一種形式結合著C1-35，最好是C1-20烷基、C6-20芳基和C7-16芳烷基結合的基團。取代基R與胺基酸或非胺基酸的α-碳原子直接結合時，取代基不包括天然胺基酸中與α-碳原子結合的取代基。當取代基R與胺基酸或非胺基酸的側鏈中的反應性基團相結合時，該取代基R可以是用式4-Q(本式中Q表示的意義與前述相同)表示的基團。
上述[烷基]，表示環狀、直鏈或支鏈的烷基。例如甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、環丁基、戊基、異戊基、叔戊基、新戊基、環戊基、己基、異己基、環己基、3，3-二甲丁基、庚基、1-丙丁基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、和十五烷基等，其中也可以部分包含不飽和碳原子鍵，碳原子數目為1至35，其中以1至20較好，而1至10更好。
上述[芳基]可以舉出苯基、1-或2-萘基、聯二苯基、1-，2-或9-蒽基、1-，2-，3-，4-或9-菲基、苊基、蒽基、莫基等。碳原子數為6至20，以6至15為最佳。
上述[芳烷基]可以舉出苄基、p-甲氧苄基、3，4-二甲氧苄基、o-硝基苄基、p-硝基苄基、二苯甲基、三苯甲基等。碳原子以7至16為最佳。
這些烷基、芳基和芳烷基還可以在本專業領域內具有常用的取代基，只要是從化學原理上可能允許的位置和數目。
可以指絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；取代基R可以用式5-(CH2)n-P1-Q1(式中n與上述意義相同，P1代表酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵，Q1代表的意義與上述Q相同)表示。
具體而言，胺基酸A是絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和羥脯氨酸時，胺基酸的側鏈上有羥基，因此[受到修飾的胺基酸]可以舉側鏈羥基被醚化或酯化的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和羥脯氨酸為例；如果胺基酸A是半胱氨酸，則其側鏈有巰基，[受到修飾的胺基酸]就是被硫醚化或硫酯化或二硫化的半胱氨酸；如果胺基酸A是賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸等，因為其側鏈有氨基，[受到修飾的胺基酸]就是側鏈氨基被醯胺化、硫代醯胺化、脲基化、硫脲基化或烷基化的賴氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸等；如果胺基酸A是組氨酸、色氨酸、脯氨酸或羥脯氨酸，因為其側鏈有氨基，[受到修飾的胺基酸]是指側鏈氨基被醯胺化、硫代醯胺化、亞氨醚化、亞氨硫醚化和烷基化的組氨酸、色氨酸、脯氨酸或羥脯氨酸。
另外，[受到修飾的的胺基酸或非胺基酸]還包括側鏈羥基被酯化的絲氨酸和蘇氨酸。
再者，上述取代基R中，當胺基酸或非胺基酸A側鏈有-OH-、-SH、-NH-或-NH2時，將這些基團醯化形成的基團也符合要求。這樣發生的醯基，可以舉出從有機羧酸、有機磺酸和有機磷酸化合物除去羥基形成的基團為例。具體而言，上述有機羧酸可以脂肪酸為例，這些脂肪酸的碳原子數可以是2-35個，較合適的是6-18個，最合適的是8-16個。這樣的脂肪酸可以列舉辛酸、正癸酸、十二烷酸、丁酸、己酸、十一烷酸、十六烷酸、癸酸、十九烷酸、二十二烷酸、二十九烷酸和三十二酸等飽和脂肪酸；例如丙烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和硬脂炔酸等不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸中，可以是單烯酸，也可以是多烯酸。其中八碳酸(辛酸最佳)、十碳酸(正癸酸最佳)、十二烷酸(月桂酸最佳)是最有代表性的例子。上述有機磺酸或有機磷酸化合物，其碳原子數目也是2-35個。
指在肽或蛋白質中含有一個以上上述經修飾的胺基酸或非胺基酸的肽或蛋白質。
是一種內源性激素分泌促進因子(GHS)，有增加細胞內鈣離子濃度的活性和誘導分泌生長激素的活性。其中包括來自人類、大鼠、小鼠、豬、雞、鰻魚、牛、馬、綿羊、蛙、鮭魚或犬的促成長素。更具體而言，所謂[促成長素]是有編號為1或2的胺基酸序列，其第3位的絲氨酸或蘇氨酸的側鏈羥基的氫原子被n-辛醯基、丁醯基、己醯基、癸醯基或十二醯基中之一置換的蛋白質；或者是編號為1或2的胺基酸序列，除氨基末端起第一到第四個胺基酸之外的部分，發生1-10個，優選的是一個到幾個胺基酸置換、添加或缺失而產生的胺基酸序列，其第3位的絲氨酸或蘇氨酸的側鏈羥基的氫原子被n-辛醯基、丁醯基、己醯基、癸醯基或十二醯基中之一置換，並且具有增加細胞內鈣離子濃度活性的蛋白質。
是指有增加細胞內鈣離子濃度活性，以含有一個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸為特徵的肽，或被容許作醫藥的它們的鹽類。其中編號為1的肽胺基酸序列中，該肽至少有從氨基末端起到第4個胺基酸為止的序列、也可以是有從氨基末端起到第5個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第6個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第7個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第8個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第9個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第10個胺基酸為止的序列的肽，或被容許作醫藥的鹽類。而且，編號為1～21的胺基酸序列中，從氨基末端起到第4個胺基酸為止的序列、也可以是從氨基末端起到第5個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第6個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第7個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第8個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第9個胺基酸為止的序列、從氨基末端起到第10個胺基酸為止的序列等以外的部分，至少含有一個胺基酸，也可以是1-10個胺基酸，優選的是1-幾個胺基酸發生了缺失、置換和/或添加而產生的胺基酸序列的肽，以及被容許作醫藥的鹽。在上述全部形態的肽和容許作醫藥的該肽的鹽類中，從氨基末端起到第2個或第3個胺基酸，更確切是從氨基末端起到第3個胺基酸是受到修飾的胺基酸或非胺基酸尤為合適。
同時，編號1-21記載的胺基酸序列，或該序列至少有一個胺基酸，也可以是1-10個胺基酸，更確切說是1-幾個胺基酸發生了缺失、置換和/或添加而產生的胺基酸序列中，從氨基末端起至第4個胺基酸為止的胺基酸序列可以用式6；A-B-C-D表示(式中A代表胺基酸、非胺基酸或沒有；B代表胺基酸、非胺基酸或沒有，但是A+B的分子鏈長與肽相當；C和D可以相同也可以不同，表示(a)被修飾胺基酸；(b)有疏水性側鏈的胺基酸；(c)有鹼性側鏈的胺基酸)，用該式表示胺基酸序列的肽片斷被置換的肽，以及被容許作醫藥的鹽類，也是合適的形態。
上述[有疏水性側鏈的胺基酸]指亮氨酸、纈氨酸、正亮氨酸、同型亮氨酸、同型異亮氨酸、萘基丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、環己丙氨酸，或這些化合物的N-甲基胺基酸或D-型異構體。上述[有鹼性側鏈的胺基酸]指賴氨酸、精氨酸或組氨酸，或這些胺基酸的D-型異構體。再者，上述式6中的C尤指受到上述修飾的胺基酸，D尤指有疏水性側鏈的胺基酸。
還可以使用用式7A1-B1-C1-D1表示的肽片段代替式6A-B-C-D表示的肽片段(式中A1代表胺基酸或非胺基酸，尤指天然胺基酸和它的D型異構體；B1和C1二者至少一個，只有一種是被修飾的胺基酸或非胺基酸時，另一種是沒有被修飾的胺基酸或非胺基酸，尤指天然胺基酸和它的D型異構體。同時A1+B1的分子鏈長與二肽相當。D1代表有疏水性側鏈的胺基酸)。
同時，還可以使用式8B2-C2-D2表示的肽片段代替式6A-B-C-D表示的肽片段(式中B2代表有相當肽分子長度的非胺基酸，C2代表被修飾的胺基酸或非胺基酸，D2代表有疏水性側鏈或有鹽基性側鏈的胺基酸)。
還可以指上述形態的肽或被容許作醫藥的該肽的鹽類的氨基末端或羧基末端進行了修飾的化合物。具體而言，可以是上述形態的肽或被容許作醫藥的該肽的鹽類的羧基末端再結合了鹼性胺基酸的化合物。也可以是上述形態的肽或被容許作醫藥的該肽的鹽類的氨基末端被一個碳原子以上的飽和或不飽和烷基，或醯基修飾，和/或羧基末端的羧基之OH基被轉換成OZ或NR2R3(Z表示醫藥行業運行使用的陽離子或低級支鏈或非支鏈的烷基；R2和R3表示氫原子和低級(C1-6)支鏈或非支鏈的烷基中選出的相同或不同的基團)的化合物。還可以是將以上幾種修飾加以組合形成的化合物。
本發明所涉及的修飾肽或蛋白質的製造方法以以下3項工序為特徵(a)用弱酸性脫離樹脂製造含有一個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段；(b)與(a)製造保護性肽片段相區別地另行製造不含受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段；再將(a)及(b)兩工序製造地保護性肽片段加以縮合。
下面具體敘述製造修飾肽或蛋白質的各工序。
由於藉助本發明的製造方法得到的修飾肽或蛋白質或它們的片段是具有肽性質的化合物，所以可以用本身是公知的肽合成方法合成。這裡所謂修飾肽或蛋白質，或它們的片段包含有用保護性基團保護了它們的反應性功能基團的化合物。肽合成的方法，例如固相合成法、液相合成法都可以使用。即把初步修飾的肽或蛋白質或構成它們的片段的部分肽或胺基酸與剩餘部分相縮合，當產物含有保護性基團時則要使保護基脫離，由此製造目的肽的方法。公知的縮合方法和使保護性基團脫離的方法可以舉以下文獻1～3記載的方法1.泉屋信夫他《肽合成的基礎和實驗》丸善株式會社發行(1985年)2.矢島治明與神原俊平《生物化學實驗講座I、蛋白質的化學IV》日本生化學會編，東京化學同人發行3.矢島治明監修《續醫藥品之開發、第14卷、肽合成》廣川書店發行含有一個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段的製造工序，其特徵是採用再弱酸性脫離樹脂上使肽鏈延長的固相化學合成法。更具體而言，是採用弱酸性脫離樹脂，在α-氨基和側鏈上將在製造肽片段時可能引起不利副反應的反應性功能基加以適當保護的胺基酸或非胺基酸，依照目的肽片段的序列，按照本身為公知的各種縮合方法在弱酸性脫離樹脂上加以縮合，再把製成的保護的肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來而不使保護性基團脫離，從而可以獲得所需要的保護性多肽片段。
上述弱酸性脫離樹脂，是指被用於合成肽的樹脂，可以在該樹脂上製備肽片段並在弱酸性條件下將該肽片段脫離下來。作為弱酸性樹脂，在含有一種以上下述化合物的溶液中，即可將在樹脂上製備的肽片段從樹脂上脫離下來。這些化合物包括乙酸、三氟乙酸、或甲酸等羧酸，以及三氟乙醇或六氟異丙醇等氟化醇類。弱酸性樹脂具體有諸如2-氯代三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂、4-甲氧基三苯甲基樹脂、Rink Amide Barlos樹脂等三苯甲基系列樹脂，以及Sieber Amide樹脂等。
α-氨基和側鏈上反應性功能基(以下簡稱側鏈功能基)的保護基並沒有特別限定。α-氨基的保護基可以舉出叔丁氧基羰基(BOC)、三氯乙基氧羰基、叔戊基氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺醯基乙氧羰基、三氯乙氧羰基、2-(三甲基甲矽烷基)乙氧羰基或者吡啶-4-甲氧基羰基等的可有取代基的烷氧羰基；環庚氧羰基或者環己氧羰基等的可有取代基的環烷基氧羰基；苄氧羰基(Z)、對甲氧基苄基氧羰基(PMZ)、P-氯苄氧羰基(C1-Z)、對溴苄氧羰基(Br-Z)、對硝基苄基氧羰基、金剛烷氧碳基、2-苯基異丙基氧羰基、對甲基苯基異丙基氧羰基、對朕苯基異丙基氧羰基、3，5-二甲氧基-α，α-二甲基苄基氧羰基等的可有取代基的芳烷氧羰基苄基(BZ1)、二苯甲基、三苯甲基等的可有取代基的芳烷基；三氟乙醯基、鄰苯二甲醯基、甲醯基、苯磺醯基、對甲苯磺醯基(TS)、鄰硝基苯基亞磺醯基、2，4-二硝基苯基亞磺醯基、3-硝基-2-吡啶基亞磺醯基等的可有取代基的醯基；二硫琥珀醯基、2-硝基苯基硫、二苯基五磺醯基、二苯基磷醯硫基、二甲基磷醯硫基等。
絲氨酸等的羥基可以用乙醯基等低級(C1-6)鏈烷醯基，苯甲醯基等芳醯基、苄氧羰基、乙氧基羧基等由碳酸衍生而來的基團來保護。
精氨酸的胍基可以用硝基、Z基、Ts基、P-甲氧苯磺醯基(Mbs)、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺醯基(Mbs)、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺醯基(Mtr)、均三甲苯基-2-磺醯基(Mts)、2，3，4，5，6-五甲基苯磺醯基(Pme)、2，4，6-三甲氧苯磺醯基(Mtb)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺醯基(Pmc)、2，2，4，6，7-五甲基-二氫苯並呋喃-5-磺醯基(Pbf)等來保護。
半胱氨酸的巰基可以用諸如三苯甲基、乙醯氨基甲基(Acm)、叔丁基、苄基、p-甲基苄基、p-甲氧基苄基、3-硝基-2-吡啶亞磺醯基和丁基硫基等來保護。
作為組氨酸的咪唑基可以使用例如Boc基、三苯甲基(Trt)、Ts基、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺醯基、2，4-二硝基苯酚(DNP)基、苄基氧甲基(Bom)基、叔丁氧甲基(Bum)基、Fmoc基等。
色氨酸的吲哚基可以用例如，甲醯基、Z基、2，4-二氯苄氧羰基、三氯乙基氧羰基、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺醯基、2，4，6-三甲氧苯磺醯基等保護。
用固相合成法進行縮合反應可以用上述弱酸性脫離樹脂將胺基酸逐個順次延長進行縮合的逐次延長法，可以用將二個以上胺基酸組成的肽片段進行縮合的片段縮合法，也可以將這兩種方法組合起來進行縮合。而上述二個以上胺基酸組成的肽片段可以採用常用的液相法、固相法等由胺基酸製造。
首先，要將上述適當保護了α-氨基和側鏈功能基的胺基酸或非胺基酸(以下除特別註明，均簡稱為保護性胺基酸)活化，在弱酸性脫離樹脂上縮合活化了的保護性胺基酸。此時須從已知可以用於肽縮合反應的溶劑中適當選擇用於活化保護性胺基酸和用於與樹脂縮合的溶劑。例如可以用N，N-二甲基甲醯胺、N，N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯烷酮等的醯胺類；二氯甲烷、三氯甲烷等滷代烴類；三氟乙醇、苯酚等的醇類；二甲基亞碸等的亞碸類；吡啶、二噁烷、四氫呋喃等的醚類；乙腈、丙腈等的腈類；醋酸甲酯、醋酸乙酯等的酯類或它們的適當混合物。反應溫度可以和形成肽鍵反應的溫度相同，通常在-20-50℃之間作適當選擇。活化的保護性胺基酸一般1-4倍過量使用，可以用茚三酮反應測試，當縮合反應不充分時可以在不使保護基團脫離的條件下反覆進行縮合反應，以便進行完全。在反覆進行縮合仍然不能充分完成時，可以用無水乙酸或乙醯咪唑將未反應的保護性胺基酸乙醯化，這樣不會影響後續的反應。
然後，將縮合在弱酸性脫離樹脂上的保護性胺基酸按所需要的序列將保護性胺基酸縮合。各保護性胺基酸的縮合反應，可以採用常用的諸如羧基末端活化法、偶合劑偶合法等。羧基末端保護法包括活性酯化法和對稱酸酐法等。上述活性酯化法中採用的活性酯可以有諸如氰基甲基酯等的烷基酯；硫代苯基酯、對硝基硫代苯基酯、對甲磺醯苯基酯、對硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯、2，4，6-三氯苯基酯、五氯苯基酯等的苯基酯；1-羥基丁二醯亞胺(HOSu)、N-羥基鄰苯二醯亞胺酯、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酸亞醯胺(HONB)等的二羧酸亞胺酯；8-氫喹啉酯、N-羥基派啶酯、2-羥基吡啶酯等的羥基胺衍生物。
上述偶合劑偶合法，可舉以下諸方法為例例如，使用二環己基碳化二亞胺(DCC)、水溶性碳化二亞胺(WSC)等碳化二亞胺法；DCC-活性化法；羰基二咪唑法(CDI)；烏德互特(woodward)反應劑(N-乙基-5-苯基異噁唑基-3′-磺酸鹽)或者N-乙基-2′-羥基苯並異噁唑三氟硼酸鹽等的異噁唑鹽、1-乙氧基羰基-2-乙氧-1，2-二氫喹啉(EEDQ)、1-乙氧羰基-2-異丁氧-1，2-二羥基喹啉(IIDQ)、苯並三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸酯(BOP)、O-苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷醯疊氮(DPPA)等的方法。
上述碳化二亞胺法中使用的水溶性碳化二亞胺(WSC)中包括EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞銨、N-環己基-N′-嗎啉基乙基碳化二亞胺、N-環己基-N′-(N，N′-二乙基氨基)環己基碳化二亞胺等。水溶性碳化二亞胺也可以是鹽酸鹽等鹽類。
上述DCC-添加法包括DCC-HOSu法、DCC-HOBt(1-羥基苯丙三唑)法、DCC-HONB法、DCC-2-羥基亞氨基-2-氰基醋酸乙酯法、WSC-HOSu法、WSC-HOBt法等。
宜採用的縮合反應包括碳化二亞胺法、活性酯法、DCC-添加法等。更好的縮合反應包括阻止外消旋化的方法、例如活性酯法、DCC-添加法(如DCC-HOBt法、DCC-HOSu法、WSC-HOSu法、WSC-HOBt法)等。
所需的保護性肽片段含有至少一個被修飾的胺基酸或非胺基酸。將被修飾的胺基酸或非胺基酸接入肽鏈的方法可以有以下兩種。
第一種方法是預先對所選定的胺基酸或非胺基酸的側鏈進行修飾，再在肽鏈伸長階段將這些胺基酸或非胺基酸(以下稱為「經殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸)導入。更具體而言，即經殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸(包括在這些α-氨基上附加了保護性基團的化合物)可以用本身公知的合成方法合成。例如酯化反應、醯胺化反應、醚化反應、醯化反應和烷基化反應等，這些反應可以採用同行界慣用的公開方法來進行。而且，用上述任何一種縮合反應，都可以將它們導入肽鏈。此時把保護性肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來要適當選擇下述條件，該條件應該是不會使所需的經殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸側鏈的取代基R脫離的條件。
第二種方法是按上述方法製備由胺基酸和/或非胺基酸組成的有特定序列的肽片段，然後特異地修飾所需胺基酸或非胺基酸的側鏈(以下簡稱為殘基特異性修飾)。可以用公知方法進行殘基特異性修飾，不特別限定某種方法。例如酯化反應、醯胺化反應、醚化反應、醯化反應和烷基化反應等，這些反應可以採用同行界慣用的公開方法來進行。此外，還有磷酸化修飾法，可見Tetrahedron Letter 41卷p.4457-4461，2000年；Biopolymers 60卷，p.3-31，2001年等文獻，以及糖基修飾法，可見Int.J.Peptide Protein Res.，42卷，p.165-170，1993年；Science，291卷，p.2344-2350，2001年；Science，291卷，p.2357-2364，2001年等文獻。
有關方法可以分成以下兩類。即在用保護性基團保護要進行殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸之側鏈功能基時，一種情況是在脫去保護性基團的同時將被保護的肽片段從樹脂上完全脫離下來；另一種情況是在脫去保護性基團的同時不把被保護的肽片段從樹脂上脫離下來。在前一情況下，羧基末端的羧基被保護性基團保護後，可以用自身公知的合成方法進行殘基保護性修飾，然後適當選擇後述方法將羧基末端的羧基脫保護即可得到所需之多肽片段；在後一種情況下，可以在樹脂上以自身公知的合成方法進行殘基保護性修飾，然後即可適當選擇後述方法將所需肽片段從樹脂上脫離下來。
在本發明種，用上述方法製備由胺基酸和/或非胺基酸組成的有特定序列的肽片段，然後用保護性基團保護要進行殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸的側鏈上的反應性功能基。此時最好採用將保護性基團脫保護，用自身公知的合成方法在樹脂上施行殘基特異性修飾，然後將保護性肽片段從下述弱酸性脫離樹脂上脫離下來，並根據要求進行各種保護性基團的脫保護。
在上述方法中，施行殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性基團，雖然並不特別限制要在將有關保護性基團脫保護時不使保護性肽片段從樹脂上脫離下來，但最好用叔丁基二甲基甲矽烷基、叔丁基二苯基甲矽烷基等甲矽烷類基團。在脫去這些保護性基團時，可以採用特異性脫保護試劑。這些試劑可以特異地將施行殘基特異性修飾的胺基酸或非胺基酸的側鏈功能基的保護性基團脫去，而不把保護性肽片段從樹脂上脫離下來。這類試劑可以根據弱酸性圖例樹脂和保護性基團的種類不同而作適當選擇，當上述保護性基團是甲矽烷基時，可以用氟代季銨鹽，用四丁基氟化銨(TBAF)則更好。
如果按上述方法選擇保護基，在為了使肽鏈延長進行縮合反應而將氨基末端的氨基脫保護時，被保護的肽片段不從各保護性胺基酸側鏈功能基的保護性基團和弱酸性脫離樹脂上脫離下來，而且在從所得到的肽-樹脂結合體上把弱酸性樹脂脫離開時，各胺基酸殘基側鏈功能基的保護性基團則不脫離。之所以要這樣，是因為這樣可以阻止副產物的形成。因此，可以以較好的收率簡便地獲得高純度的側鏈功能基被保護性基團保護了的肽片段。這種肽片段由於側鏈功能基被保護了，不須導入新的保護性基團，在下一工序用它作為原料，在藉助液相法製備所需修飾肽或蛋白質時用起來更合適。
最後，是把製備的被保護的多肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來。此時應在弱酸性條件下進行，這種條件可使被保護的肽片段中的保護性基團，即胺基酸或非胺基酸側鏈功能基的保護性基團不會發生脫保護。所謂弱酸性條件，是將弱酸性脫離樹脂懸浮在含有以下化合物的溶液中，這些化合物有乙酸、三氟乙酸或甲酸等羧酸類，以及/或者三氟乙醇、六氟異丙醇等氟代醇類。具體而言，可以採取把製備的被保護的肽片段放在上述溶液中攪拌一定時間(5分鐘-4小時，更優選是10分鐘-2小時)，使該肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來。更具體的方法可以採用Barlos的方法(Tetrahedron Lett，30卷p.3947，1989年)等公知方法。例如可以將肽片段懸浮在0.5％三氟乙酸/二氯甲烷或乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷＝1/2/7的溶液中，或懸浮在乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷＝2/2/6的溶液中。
在本發明中，還可以不插入被修飾的胺基酸或非胺基酸到肽鏈中而使被保護的肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來，然後對特定胺基酸殘基進行殘基特異性修飾，這樣來製備含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段。殘基特異性修飾方法與上述相同。
上述製造方法並無特別限制地適用於含一個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段。對於製備含有一個以上受到以下列式9表示的修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段或它們的鹽類，採用上述方法是適宜的。
式9(R1)n-Gly-Ser(X1)-A(R)-Phe-Leu-Ser(X2)-Pro-OR2其中-A(R)-代表上述受到修飾的胺基酸或非胺基酸化合物。其中A可以是絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；R通過酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵等與A的側鏈上的反應性取代基結合。R1表示可以舉出叔丁氧基羰基(BOC)、三氯乙基氧羰基、叔戊基氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺醯基乙氧羰基、三氯乙氧羰基、2-(三甲基甲矽烷基)乙氧羰基或者吡啶-4-甲氧基羰基等的可有取代基的烷氧羰基；環庚氧羰基或者環己氧羰基等的可有取代基的環烷基氧羰基；苄氧羰基(Z)、對甲氧基苄基氧羰基(PMZ)、P-氯苄氧羰基(C1-Z)、對溴苄氧羰基(Br-Z)、對硝基苄基氧羰基、金剛烷氧羰基、2-苯基異丙基氧羰基、對甲基苯基異丙基氧羰基、對聯苯基異丙基氧羰基、3，5-二甲氧基-α，α-二甲基苄基氧羰基等的可有取代基的芳烷氧羰基；苄基(BZ1)、二苯甲基、三苯甲基等的可有取代基的芳烷基；三氟乙醯基、鄰苯二甲醯基、甲醯基、苯磺醯基、對甲苯磺醯基(TS)、鄰硝基苯基亞磺醯基、2，4-二硝基苯基亞磺醯基、3-硝基-2-吡啶基亞磺醯基等的可有取代基的醯基；二硫琥珀醯基、2-硝基苯基硫、二苯基亞磺醯基、二苯基磷醯硫基、二甲基磷醯硫基等，n為1或2X1和X2表示絲氨酸側鏈羥基的保護性基團，既表示乙醯基等低級(C1-6)烷醯基、苯甲醯基等芳醯基、苄氧羰基等或者乙氧羰基等碳酸衍生的基團，又表示適合醚化，即通過醚鍵把上述取代基結合到側鏈上的基團。例如丁基、苄基、四氫吡喃基、三苯甲基和叔丁基二甲基甲矽烷基等甲矽烷基R2表示有或沒有保護性基團。如有保護性基團，則是烷基酯基團(例如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、叔丁酯、環戊酯、環己酯、環庚酯、環辛酯、2-金剛酯等直鏈、支鏈或環狀的烷基酯基團)、芳烷基酯基(如苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯基)、苯甲醯甲基酯基、苄基氧羰肼基、叔丁氧基羰肼基、三苯甲基肼基)式9中，R1可以是Boc基、Z基、pMZ基或Pmoc基，以X1和X2表示的保護性基團可以是叔丁基或3，4苄基，更合適的是是叔丁基。R2可以是氫原子或硫酯。
再者，上述製造方法可以適用於製備促成長素，可以是人類、大鼠、小鼠、豬、雞、鰻魚、牛、馬、綿羊、蛙和鮭魚，以及犬的促成長素或它們的衍生物。此外，也可以用於製備上述促成長素或它們的衍生物中含有的被修飾的胺基酸或非胺基酸部分。上述各種生物的促成長素的結構見表1所示。
更具體而言(a)在記載為編號1-21的任何一種胺基酸序列中，至少有從氨基末端第1個到第4個胺基酸序列，但可以由該胺基酸序列從氨基末端第一個到第5個胺基酸序列組成，或者由該胺基酸序列從氨基末端第一個到第7個胺基酸序列組成；(b)從氨基末端起第3個胺基酸絲氨酸或蘇氨酸的側鏈的羥基發生醯基化，優選是被飽和或不飽和的碳原子數為2-35個的烷基，最好是碳原子數為6-18個的烷基醯化；(c)胺基酸的側鏈上羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上可能在製造肽片段時引起不利副反應的反應性功能基，最好是羥基和氨基用保護性基團給予保護了的肽片段的製備，也可以採用上述方法。
本發明中，用不同於製造上述含有受到修飾的胺基酸和非胺基酸的保護性肽片段的方法製造不含有受到修飾的胺基酸和非胺基酸的保護性肽片段。
在本發明中，肽和蛋白質不含有受到醯化、糖基化、磷酸化等修飾的胺基酸和非胺基酸的肽片段，可以用自身公知的基因重組和酶法製造。例如具有上述肽片段胺基酸序列的肽(以下稱為目的肽)可以通過以下工序來製造即培養被轉化的具有編碼該肽鹼基序列的表達載體的細胞，然後由該細胞培養物提取目的肽的方法；以及用保護性基團保護藉助上述工序獲得的目的肽側鏈功能基中有可能引起不利副反應的功能基的工序。表達載體的製備可以採用該領域常規方法進行。在製備表達載體時，可以從現有的方法中適當選用高表達目的肽所必要的其它條件，例如啟動子、終止子、剪接部位等。用上述表達載體轉化的宿主細胞並無特別限定，可以在已知的方法中從原核細胞或真核細胞，例如大腸桿菌等微生物細胞、酵母菌或動物細胞等適當選擇能夠順利表達編碼目的肽的序列的載體。目的肽側鏈功能基的保護可以採用與上述相同的方法。
不含有受到修飾的胺基酸和非胺基酸的肽片段，也可以通過以下工序製造工序(1)根據目的肽的要求，通過合適的接頭序列附加上保護性肽而成為融合蛋白，將具有編碼此融合蛋白的鹼基序列的表達載體轉化細胞，培養該轉化細胞，從該細胞培養物中提取融合蛋白；工序(2)從由工序(1)得到的融合蛋白中，把保護性肽和合適的接頭序列，以及目的肽切斷分離，再根據需要進行純化；工序(3)在由工序(2)得到的目的肽的側鏈功能基中，將那些可能引起不利副反應的功能基用保護性基團加以保護。
保護性肽是用於阻止目的肽在宿主細胞內被酶分解，只要達到該目的，並無特別限制，可以採用來自大腸菌β-半乳糖苷酶的胺基酸序列的片段。類似該種酶的胺基酸序列在本專業是公知的，來自β-半乳糖苷酶的肽片段在本專業中廣泛用作為融合蛋白的保護性肽。
接頭的序列是在工序(2)中沒有適合用來切斷分離保護性肽和目的肽的酶類時，或不能順利切斷分離保護性肽和目的肽時，被插入到保護性肽和目的肽之間的序列。因此，當工序(2)中不能順利切斷分離接頭序列和目的肽時，應該適當選擇該序列。
把保護性肽和合適的接頭序列，以及目的肽切斷分離，可以採用酶法或/和化學法來進行。
酶法或化學法切斷的方法可以使用記載在Methods in Enzymology，185卷，Gene Expression Technology(David V.Goeddel)等編輯，AcademicPress Inc.出版)等書籍中的方法。
化學法切斷的方法，有用溴氰基(Bromcyan)切斷蛋氨酸羧基末端的方法(D.V.Goeddel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.76，p.106-110，1979)、用甲酸切斷序列-Asp-Pro-之間的鍵的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.40，p.1173，1970)、用羥胺切斷序列-Asn-Gly-之間的鍵的方法和用BNPS-三甲基吲哚或N-琥珀醯亞胺切斷胰蛋白酶羧基末端等方法。例如在涉及目的肽的胺基酸序列中不含蛋氨酸時，可以在鄰接目的肽的切斷部位範圍內的末端導入蛋氨酸，再以化學方法用溴氰基處理在切斷部位進行切斷。
作為酶法切斷的方法，由於用於處理的酶能夠特異地識別底物，設定切斷部位即可。例如精氨酸-精氨酸、賴氨酸-賴氨酸、精氨酸-賴氨酸、以及賴氨酸-精氨酸等鹼性胺基酸對中間的肽鍵、或者精氨酸-蛋氨酸、精氨酸-丙氨酸、或精氨酸-纈氨酸等胺基酸對的中間的肽鏈，可以用大腸桿菌OmpT蛋白酶(Sugimura，K.和Nishihara，T.J.Bacteriol，1705625-5632，1988)切斷；X-Gly或Pro-X-Gly-Pro序列中的-X-Gly-序列可以用膠原酶切斷(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，p.4692-4696，1984)，-Asp-Asp-Asp-Lys-序列(序列編號22)的賴氨酸羧基末端可以用腸激酶，-Ile-Glu-Gly-Arg-序列(序列編號23)的精氨酸羧基末端可以用血液凝固因子Xa(日本公開專利昭和61年-135591號公報)，-Gly--Pro-Arg-序列的精氨酸羧基末端可以用凝血酶(日本公開專利昭和62年-135500號公報)，-Arg-的羧基末端可以用胰蛋白酶或梭菌蛋白酶，Arg或Lys的羧基末端可以用內切蛋白酶ArgC(Nature，Vol.285，p456-461，1980)，Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg序列的羧基末端可以用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Kex2蛋白酶及其衍生物(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.144，p.807-814，1987；日本公開專利平成1年-199578號公報；日本公開專利平成10年-229884號公報)，Lys的羧基末端可以用lys1內切蛋白酶或lysC內切蛋白酶lysC(日本公開專利昭和61年-275222號公報)，Asp或Glu羧基末端可以用金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)的V8蛋白酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，p.3506-3509，1972)，-Phe-Arg-序列羧基末端用激肽釋放酶(日本公開專利昭和62年-248489號公報)，-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-序列(序列編號24)的-Leu-Leu-之間的鍵可以用凝乳酶(日本公開專利昭和60年-262595號公報)，Glu-Gly-Arg-序列羧基末端用尿激酶(日本公開專利平成2年-100685號公報)，-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列(序列編號25)羧基末端用腸肽酶(Biotechnology，Vol.6，p.1204-1210，1988)，poly-Gly羧基末端用溶葡球菌酶(日本公開專利平成1年-160496號公報)，-Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg等的羧基末端用乳酸克魯維酵母(Kluverromyces lactis)(日本公開專利平成1年-124390號公報)等。
本方法中的表達載體、宿主細胞和目的肽的側鏈功能基的保護等與上述方法相同。
再者，不含有受到基因重組法或酶法修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段的製造，可以採用記載在編號為WO 99/38984的國際公開專利中的方法。
對於促成長素及其衍生物的不含受到修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段，該不含受到修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段，用基因重組法或酶法製造的方法記載在編號為WO01/07475的國際公開專利中。
記載在編號為WO 00/52193的國際公開專利中在生產類胰高血糖素肽-1時採用的保護性蛋白質和接頭序列也可以適用於採用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物用兩步酶法製造促成長素片段(非修飾成分)。由於在這個方法中有可能應用宿主大腸桿菌的內源OmpT蛋白酶，沒有必要另行製備酶。上述OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶及其衍生物如果有與OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶相同的活性則不須特別規定。OmpT蛋白酶衍生物有大腸桿菌的OmpT蛋白酶、以沙門氏菌的pgtE蛋白酶為代表的屬於Omptin家族的酶和含有OmpT蛋白酶活性部位的肽等；Kex2蛋白酶衍生物有記載在日本公開專利平成10年-229884號公報中的衍生物和以Furin、PC1/3為代表的屬於Kex2家族的酶。
如實施例13所示，在本方法中，沒有採用記載在編號為WO00/52193的國際公開專利中的接頭序列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(序列編號26)，而是採用第35個胺基酸以精氨酸置換了原來的脯氨酸的序列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR(序列編號27)作為接頭序列，通過使用OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶的二步酶處理法，能夠有效獲得促成長素片段(非修飾成分)，包括促成長素(8-28)，特別是促成長素(8-28)。新發現的記載為編號27的接頭序列內，儘管還有除OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶切斷識別部位外的另外的切斷識別部位，但只在所需要切斷的部位發生正常的切斷(參見實施例3)。
再者，當純化和保存保護性肽片段(非修飾成分)時，可以通過調整用於純化和保存的溶液的pH為4-8來防止保護性基團脫離。因此，通過阻止保護性基團脫離可以高純度高收率製備修飾肽或蛋白質。上述用於純化和保存的溶液可以是水溶液。具體而言是水，尤其是超濾水和乙酸鈉溶液等。如實施例15所示，測定水溶液中保護性人類促成長素(8-28)片段的穩定性的結果表明，用Boc基保護的肽片段隨水溶液的狀態不同穩定性而不同，特別是在pH2以下的水溶液中可發現該保護基脫離，因此在採用Boc基時，應該特別設定純化和保存時的溶液pH為4-8之間。
其次，本發明中要將按上述方法得到的(a)含有1個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護性肽片段和(b)不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護性肽片段加以縮合，再按需要使胺基酸或非胺基酸的側鏈功能基的保護性基團脫保護。
上述縮合反應最好用液相法進行。同時，將上述(a)和(b)兩種肽片段用液相法縮合時，這兩種肽片段的各胺基酸或非胺基酸側鏈的功能基一般是被保護性基團保護著的。上述保護性基團可以是前述各種功能基的保護性基團。較適宜的保護性基團是那些在相同脫離條件下可以使上述(a)和(b)兩種保護性肽片段的保護性基團脫離下來的保護性基團。再者，在這種情況下，由於弱酸性脫離樹脂已經脫離，所以不必考慮弱酸性脫離樹脂的脫離條件，在這種情況下，側鏈功能基的保護性基團最好用那些使氨基末端氨基脫離的條件來脫離。
用液相法進行上述(a)和(b)兩種保護性肽片段縮合反應時，應適當選擇前面記載的用於縮合反應的試劑和條件。最好用那些較難使肽或蛋白質副產消旋化異構體等雜質的方法。用於縮合反應較好的試劑有2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷醯疊氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)。其中縮合劑有，更好的在用上述縮合劑縮合肽片段時，在有二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，使用上述縮合劑的肽片段的縮合是在1-羥基苯並三唑(HOBt)、1-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)或者3，4-二氫-3-羥基-4-氧基-苯並三嗪(HOOBt)的存在下進行時則更好。
在縮合反應的產物中，胺基酸或非胺基酸側鏈的保護性基團可以適當脫保護。此時應適當選擇脫保護的試劑和條件，所用方法應是較難使肽或蛋白質副產外消旋化異構體等雜質的方法。
各種保護性基團的脫離方法可以採用諸如《肽合成的基礎和實驗》等書籍中記載的方法。保護性基團的脫離方法，有採用強酸、弱酸、鹼基、還原劑(接觸還原、金屬、硫醇等)、氧化劑、求核試劑、親電子試劑、離子、電子、光、溶劑、酶等形形色色的方法，在選擇上述保護性基團時，要考慮這些脫離方法的脫離條件。
脫保護還可以採用以下方法，包括用三氟乙酸、乙酸、無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸或它們的混合液等(最好是三氟乙酸、乙酸等)處理，用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等鹼基處理，在有Pd-碳等催化劑存在下在氫氣流中接觸還原，在乙酸中用鋅粉(Zn/AcOH)處理，以及氟化四丁基銨(TBAF)處理等。上述脫保護反應一般在40℃以下進行，在25℃以下較好，這樣可以有效阻止肽或蛋白質副產外消旋化異構體等雜質。上述脫保護反應的反應時間通常為0.5-約5小時。
在進行上述酸處理時，可以添加陽離子捕獲劑，例如水、三異丙基矽烷(TIPS)、苯酚、苯甲醚、硫代苯甲醚、間甲酚、對甲酚、甲硫醚、1，4-丁烷二硫醇、1，2-乙烷二硫醇等(優選是苯酚)。此外，用作組氨酸的咪唑基的保護性基團的2，4-二硝基苯基可以用硫苯酚除去，色氨酸的吲哚基的保護性基團的甲醯基可以在有上述1，2-乙烷二硫醇、1，4-丁烷二硫醇等存在下通過酸處理而脫保護，用稀氫氧化鈉溶液、稀氨水等進行鹼處理也可以除去保護性基團。
由本發明所得到的反應產物，可以用諸如凝膠過濾、離子交換色譜、分配色譜、高效液相色譜、反向高效液相色譜、電泳等常用的分離純化手段進行純化。此外，用上述分離純化手段適當純化的產物，顯然不限於所需要的最終產物，即修飾了的肽或蛋白質，還可以是含有一個以上受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段、不含受到修飾的胺基酸或非胺基酸的保護性肽片段、以及整個製造工序內得到的中間體。
按上述方法可以製造修飾肽和蛋白質。本發明涉及的上述製造方法可以無特別限制地適用於修飾肽和蛋白質，可以用於製造促成長素，尤其適用於製造人類、大鼠、小鼠、豬、雞、鰻魚、牛、馬、綿羊、蛙和鮭魚和犬的促成長素，以及促成長素的衍生物。上述各種生物的促成長素的結構記載在表1中。用本發明獲得的促成長素或它們的衍生物比起用以往技術得到的促成長素或它們的衍生物，雜質(特別是成長素或它們的衍生物的外消旋化異構體)大幅度減少，是品質極高的成長素或它們的衍生物。結果得到了一種有更簡便純化方法進行有效的充分純化，工序時間縮短，收率提高的促成長素及其衍生物的製造方法。
上述所謂[高品質的促成長素及其衍生物]，具體而言，是純化的促成長素及其衍生物或它們的鹽類中，有關類緣物質的總量在1％以下(通常約為0.9％以下，較好時約為0.8％以下，最好時約為0.7％以下)，所謂類緣物質，是可以用高效液相色譜檢出的全部雜質的總和。雜質有促成長素或促成長素衍生物的外消旋化異構體、高極性的類緣物質和其它不純物質等。
用本發明製造修飾肽或蛋白質的最佳狀態包括如下所述工序。
工序1(a)在記載為編號1-21的任何一種胺基酸序列中，至少有從氨基末端第1個到第4個胺基酸序列，可以由該胺基酸序列從氨基末端第一個到第5個胺基酸序列組成，或者由該胺基酸序列從氨基末端第一個到第7個胺基酸序列組成；(b)從氨基末端起第3個胺基酸絲氨酸或蘇氨酸的側鏈的羥基發生醯基化，優選是被飽和或不飽和的碳原子數為2-35個的烷基，最好是碳原子數為6-18個的烷基醯化；(c)胺基酸的側鏈上羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上可能在製備肽片段和以下述工序(4)進行肽片段縮合反應時引起不利副反應的反應性功能基，尤其是羥基和氨基用保護性基團給予保護了的肽片段在弱酸性脫離樹脂上製備的工序。
工序(2)在弱酸性條件下把上述肽片段從弱酸性脫離樹脂上脫離下來，而不使肽片段上的保護性基團脫離的工序。
工序(3)以下肽片段的製造方法，即記載為編號1-21的任何一種胺基酸序列中，除由工序(1)和(2)製備的肽片段所具有的胺基酸序列外，還有由其它序列組成的肽片段，這些序列可以是從該胺基酸序列氨基末端第6個到28個的胺基酸序列組成，可以是該胺基酸序列氨基末端第8個到28個的胺基酸序列組成，而且胺基酸或非胺基酸側鏈上羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中任何一種以上、有可能在按下述工序(4)進行肽片段縮合反應時引起不利副反應的反應性取代基被保護性基團給予保護了的肽片段。
工序(4)把由上述工序(2)製備的肽片段和由工序(3)製備的肽片段進行縮合，然後根據需要將反應性功能基的保護性基團脫保護。
用本發明所涉及的方法得到的修飾肽或蛋白質，能夠因反應條件不同而得到游離的肽或它們的鹽類，游離肽及其鹽可用常規方法相互轉換。當把游離肽製成符合藥理要求的鹽類時，可以用下述無機酸或有機酸等進行反應。上述肽或蛋白質的鹽類應該是符合藥理要求的鹽類。當該肽或蛋白質有氨基等鹼性基團時，可以是無機酸(亦稱有機游離酸，例如碳酸、重碳酸、鹽酸、硫酸、硝酸、硼酸等)、有機酸(亦稱無機游離酸，例如琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)的鹽；當該肽或蛋白質有羧基等酸性基團時，可以是無機鹽基(亦稱無機游離鹼基，例如鈉、鉀等鹼金屬，鈣、鎂等鹼土金屬)，或有機鹼基(亦稱有機游離鹽基，例如三乙胺等有機胺類、精氨酸等鹼性胺基酸類等)的鹽類。該肽或蛋白質還可以形成金屬配合物(如銅配合物、鋅配合物等)。
用本發明所涉及的方法得到的修飾肽或蛋白質，能夠在各種用途中利用。例如上述純化的促成長素或促成長素衍生物毒性低，可以作為哺乳動物(例如人類、猴類、犬類、大鼠、小鼠)的攝食障礙治療藥、生長激素分泌促進藥、心臟病治療藥、胃功能性疾病治療藥、腸道黏膜保護劑和靜脈輸液時小腸黏膜障礙預防藥、骨質疏鬆治療藥、慢性病虛弱減少劑、肺功能不全治療劑等醫藥品。同時，上述純化的促成長素或促成長素的衍生物可以根據需要製成糖衣丸劑、膠囊、酏劑或緩釋劑等口服劑型，也可以與水或藥理學許可的其它溶液配成無菌溶液、懸濁液或緩釋製劑等針劑，製成溶液、懸濁液等滴鼻劑、噴霧劑或吸入劑等非口服劑型。上述純化的促成長素或促成長素衍生物可以和已被生理學接受的公知載體、香味劑、賦形劑、載色劑、防腐劑、穩定劑、粘合劑等，以通常製備製劑要求的單位用量一起混合來製造上述製劑。
實施例下面用實施例來進一步詳細說明本發明，但本發明並不只限於這些內容。除特別註明者外，本實施例中所使用的試驗方法和儀器註明如下。
(本發明中使用的主要省略符號)HBTU 2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯DCC二環己基碳化二亞胺HOBt 1-羥基苯丙三唑HOOBt 3-羥基-3，4-二氫-4-氧-1，2，3苯並三嗪TFA三氟乙酸TIPS 三異丙基矽烷DIPHA 二異丙基乙胺TBAF 氟化四丁銨TFE三氟乙醇Fmoc 芴甲氧基羰基Boc叔丁氧基羰基tBu叔丁基TBDMS 叔丁基二甲矽烷基Trt三苯甲基Pac苯甲醯甲基(phenacyl)
DMFN，N-二甲基甲醯胺DCM二氯甲烷NMPN-甲基吡咯烷酮Et2O 乙醚DMAP 4-二甲氨基吡啶EDC1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺『用於合成的保護性胺基酸和樹脂』Boc-Gly，Fmoc-Ser(TBDMS)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser，Fmoc-Pro等由渡邊化學工業公司和APPLIED BIOSYSTEM公司製造，脯氨醯-2-氯代三苯甲基樹脂由NOVOBIOCHEM公司製造。
『使用的儀器』(a)肽自動合成儀APPLIED BIOSYSTEM公司製造433A機(b)分析用HPLC系統儀器島津LC-10A系統柱YMC-Pack PROTEIN-RP或YMC-Pack ODS AP-302或YMC-Pack PROTEIN-C8(規格皆為4.6mmΦ×150mm)柱溫40℃洗脫液0.1％三氟乙酸中乙腈濃度按直線改變，直至100％為止。
流速1mL/分鐘檢測UV(波長210nm和214nm)進樣量10～50μL(c)分析用色譜系統儀器1AKTA explorer 10S(AMASIUM PARMACIA公司制色譜系統)柱SP-Sepharose big beads(XK26/30)(AMASIUM PARMACIA公司制樹脂)內徑26mm×長300mmYMC-ODS 120 s50(HR26/15)(YMC公司制樹脂)
內徑26mm×長15mmVydac C4(HR10/30)(Vydac公司)內徑10mm×長300mmSource 30RPC(HR10/30)23ml(AMASIUM PARMACIA公司制樹脂)內徑10mm×長30mm流速、洗脫液等條件在實施例中另行說明。
儀器2Applied Biosystem BioCAD perfusion Chromatographyworkstation柱SP-Toyopearl 550-c(內徑16mm×長280mm TOSOH公司製造)YMC-ODS AM(粒徑20μm，內徑21.5mm×長300 YMC公司製造)反向色譜ODS-80Ts(內徑21.5mm×長300柱(108ml)，粒徑20μm，TOSOH公司製造)流速、洗脫液等條件在實施例中另行說明。
(d)製備用色譜系統儀器1Waters 600 Multisolvent Delivery System柱YMC-Pack ODS-A(5μm，20mm×250mm)或YMC-PackPROTEIN-RP(5μm，C4，20mm×250mm)洗脫液0.1％三氟乙酸中乙腈濃度按直線改變，直至100％為止。
流速10mL/分鐘檢測波長210nm和260nm進樣量10～2000μL、2000μL以上，用泵注入(e)質譜儀儀器1FINICAN MAT TSQ700離子源BS1檢測離子模式Positive噴霧電壓4.5kV毛細管溫度250℃
移動相0.2％乙酸·甲醇混合液(1∶1)流速0.2mL/分鐘掃描範圍m/z300～1500儀器2API 3000(寶酒造)離子源BS1檢測離子模式Positive mode掃描類型Q1scan流速0.3mL/分鐘在5分鐘chase過程中1count/0.1msec分子量範圍500～3000Mass(f)胺基酸序列分析儀器1PE公司製造APPLIED BIOSYSTEM 477A型序列分析儀(g)胺基酸組成分析儀器日立公司製造，L-8500型胺基酸分析儀樣品用含0.1％苯酚的6M鹽酸在密封管中，於110℃水解24小時。
來源於人類的促成長素(8-28)[Lys16，19，20，24(Boc)]製造規模概述以下所述是實施例1到實施例8以獲得最後純化製品達到0.6g水平的[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)(表示來源於人類的促成長素，下同)為目的的培養和純化結果。如實施例1所述，用表達載體轉化大腸桿菌，表達具有同實施例所示之胺基酸序列的融合蛋白。在2L發酵罐中進行高密度培養，回收包含體。用一半回收的包含體開始純化。OmpT反應
、陽離子交換SP-sepharose big beads[160ml規模]、Boc化反應
、反向柱YMC ODS-120 s50[80ml規模]和Kex2反應
各進行一次，最後在純化反向柱Vydac C4[25ml規模]上處理兩次。只在最終純化工序中用直線梯度濃度程序洗脫並分部收集。用蒸發器除去溶劑，用玻璃纖維濾紙(WHATMAN公司製造)進行減壓過濾。
實施例1 hGhrelin(8-28)衍生物表達載體p117 8-28oRR的構建根據hGhrelin的cDNA基因序列(Kojima等Nature，402卷，p.656-660，1999年)，用全合成的寡聚DNA(PHAMACIA BIOTECH公司)以退火法得到hGhrelin(8-28)的DNA片段。用於退火法的全合成寡聚DNA及其胺基酸序列如圖1A所示。
將此DNA片段插入質粒pGP117ompPR中，該質粒中已經導入了編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶衍生物和人類胰高血糖素樣多肽1的融合蛋白的基因。為此，用限制性內切酶SalI和SacII處理質粒pGP117ompPR，用瓊脂膠電泳製備缺失了編碼人類胰高血糖素樣多肽1基因的DNA片段。在用鹼性磷酸酯酶處理後，先用SacII，再用T4DNA連接酶使它和經T4DNA激酶處理過的hGhrelin(8-28)衍生物基因片段相連接。用連接而成的該質粒轉化大腸桿菌DH5α菌株，得到質粒p1178-28oPR。該質粒表達融合蛋白，該由接頭連接著的融合蛋白含有hGhrelin(8-28)的胺基酸序列和β-半乳糖苷酶的部分片段117個胺基酸殘基，接頭序列為EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(序列編號26)。
再以該質粒p117 8-28oPR為模板，用KOD plus聚合酶(東洋紡織)，用以下兩種引物ORI-RRGGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC(序列編號28)SAL*RATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG(序列編號29)進行PCR，從電泳過的凝膠上切出增幅片段。然後用限制性內切酶Sal I和BamH 1處理該增幅片段。和質粒p117 8-28oPR一樣，用T4DNA連接酶將此片段與上述經過Sal I和BamH 1處理並純化的樣品相連接，用連接好的質粒轉化大腸桿菌DH5α菌株，得到質粒p1178-28oRR。該質粒表達融合蛋白，該由接頭連接著的融合蛋白含有hGhrelin(8-28)的胺基酸序列和β-半乳糖苷酶的部分片段117個胺基酸殘基，接頭序列為EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR(序列編號27)。表達的融合蛋白如圖1B所示。
實施例2大腸桿菌之重組的表達和包含體的回收用3L發酵罐裝培養2L上述轉化後的大腸桿菌，該大腸桿菌為用實施例1製備的質粒p117 8-28oRR轉化大腸桿菌W3110菌株而來。該表達質粒由pBR322而來，可以用lac啟動子誘導表達。同時，該質粒保有抗藥基因四環素抗性基因。前培養用LB肉湯在32℃振蕩培養14小時。主培養採用以下培養基4g/L酵母膏、4g/L K2HPO4、4g/LKH2PO4、2.7g/L Na2HPO4、0.2g/L NH4Cl、1.2g/L (NH4)2SO4、2g/LMgSO4·7H2O、40mg/L CaCl2、40mg/L FeSO47H2O、10mg/L MnSO4·nH2O、10mg/L AlCl3·6H2O、4mg/L CoCl2·6H2O、2mg/L ZnSO4·7H2O、2mg/LNa2MoO4·2H2O、1mg/LcuCl2·2H2O、0.5mg/L H3BO4。在開始的培養基中加入1％葡萄糖作為碳源，37℃培養。待葡萄糖消耗殆盡再補加。培養結束，將培養液用加壓菌體破碎機(マントンゴ-リン)破碎菌體，再通過離心回收得約80g包含體。再將包含體懸浮在2L無離子水中，洗淨離心回收的包含體。最終得到OD660值為530的包含體旋濁液200mL。
以下實施例中將此包含體懸濁液平分為100ml使用之。
實施例3利用hGhrelin(8-28)融合蛋白之內在性OmpT蛋白酶進行的加工將由實施2所得之包含體懸濁液調節為OD660值為100，按下述反應條件用無離子水稀釋的添加物並按下述反應條件進行OmpT的反應。
反應條件4M尿素，20mM Tris-HCl pH7.4，50mM NaCl；反應體積800mL，反應溫度32℃；反應時間40分鐘。
用8M尿素溶液400mL將包含體溶解稀釋為1000 D660/mL，加入Tris-HCl和NaCl使之達到上述濃度，用無離子水調成800mL漿狀。再調節pH為7.4開始反應。在反應開始後0分鐘、20分鐘和40分鐘取樣用HPLC分析，當反應40分鐘切斷率超過80％停止反應。反應停止後用5N NaON使pH上升為為11。反應停止後，低速離心除去殘渣，得到上清液。
hGhrelin(8-28)的濃度2.23mg/mL溶液量800mL肽含量1.7gHPLC測定結果和質譜分析結果表明發生著正常的加工過程，游離出[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)。用FINICAN MAT公司的質譜儀(TSQ-700)進行RSI-MS，其測定值為4078(理論值為4077)。
實例4[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的純化(用陽離子交換法純化)將實例3所得之OmpT蛋白酶反應液的上清液用陽離子交換色譜進行純化。
方法使用的色譜柱SP-sepharose big beads(XK26/30)(160mL)(AMASIUM PARMACIA公司制樹脂)平衡、洗滌液1.5M尿素，50mM NaHCO3，pH11洗脫液1.5M尿素，0.5M NaCl，50mM NaHCO3，pH11活化、再生液0.4M NaOH流速10mL/分(2.5cm/min)操作活化、平衡化0.4M NaOH柱容積 無離子水2倍柱容積平衡液100％3倍柱容積裝樣裝樣，平衡，用洗滌液反覆洗滌到UV值下降為止(約4倍柱容積)洗脫用洗脫液100％的分段洗脫結果在洗脫液中得到的肽的純度為90％，本工序的回收率為91.6％。
hGhrelin(8-28)的濃度4.75mg/mL溶液量300mL肽含量1.43g實例5[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的Boc化進行在純化的[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)上附加Boc基團的反應，含於氨基末端的α氨基和序列中的Lys殘基的側鏈的氨基用Boc基保護。
方法將陽離子色譜洗脫液300mL全部裝在玻璃燒杯中，加入等量(300mL)的乙腈，達到50％乙腈。再邊攪拌邊加入1M的(Boc)2O8.8mL(終濃度為20mM，25當量)，即相當於存在於[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)中的α氨基和賴氨酸殘基側鏈的ε氨基數目(約5處)的5倍摩爾量。再用5N NaOH調節pH不低於9，再在攪拌機攪拌下於室溫中反應60分鐘。用HPLC分析和分子量測定監控反應效率。反應結束後立即蒸發除去溶劑，然後用乙酸調節pH到5.5，析出的沉澱用玻璃纖維濾紙(Whatman公司制)減壓過濾。通過此工序得到的含有產品[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)1740mg的溶液580mL。
工序回收率116％(工序回收率大於100％可認為是由於附加了Boc基而使HPLC測定吸光度數值增大，因而增加了表觀回收率)質譜分析採用FINICAN MAT公司的質譜儀(TSQ-700)進行RSI-MS，其測定值為4578(理論值為4577)。
主要看到，比起Boc之前(測定分子量＝4077，理論分子量＝4077)來，反應後分子量增加了500(測定分子量＝4578，理論分子量＝4577)。據推測，這個峰是hGhrelin(8-28)序列內的賴氨酸殘基側鏈存在4個ε氨基，以及氨基末端的α氨基被Boc基保護了而生成的[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)。
實施例6用反相柱純化[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)實施例5得到的[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)採用反向柱純化。
方法所用的色譜柱是YMC-ODS 120 s50(HR26/15)80mL(YMC公司制樹脂)內徑26mm×長15mm平衡、洗滌液10％的乙腈，30mM乙酸鈉，pH到5.5洗脫液50％的乙腈，30mM乙酸鈉，pH到5.5樹脂再生液80％的乙腈流速流速7mL/分(2cm/min)用3倍柱容積的平衡用液平衡後，裝樣品到柱中，用3倍柱容積的平衡液洗滌柱子，(洗滌到UV值下降為止)。用100％的乙腈分段洗脫，洗脫後再用再生液洗滌乾淨。
得到含有得到的含有產品[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)1770mg的溶液150mL。在此溶液中加入75mL超濾水稀釋1.5倍，在蒸發器中將含在溶液中的乙腈蒸發乾淨。
工序回收率98％
實施例7用Kex2蛋白酶製造[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)由實施例6得到的肽溶液在下述條件下製備Kex2反應液。即，將ODS洗脫液用超濾水稀釋成8mg/mL後，加入1M Tris-HCl pH8.3使其濃度為50mM。再加入CaCl2使其濃度為5Mm，30℃保溫10分鐘，加入Kex2蛋白酶(日本公開專利平成10年-229884號公報)溶液(1×107Unit/mL)使其濃度為2.5×104Unit/mL用攪拌器不斷攪拌，在30℃恆溫葙中反應120分鐘。反應結束後，用乙酸調節pH到5.5，停止反應。根據HPLC、質譜分析和胺基酸分析結果，得知作為酶解前後原料的[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)消失了，而[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)增加了，因此該工序進行正常。
實施例8[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)的純化實施例7所得到的含有[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)的反應後溶液，用反向色譜柱在下述條件下純化。
方法所用的反向色譜柱是Yydac C4(HR10/30)23mL柱(Yydac公司制)內徑10mm×長300mm條件平衡、洗滌液10％的乙腈，0.1％TFA，pH 3洗脫液50％的乙腈，0.1％TFA，pH 3流速流速2mL/分(線性流速3cm/min)用3倍柱容積的平衡液平衡後，分兩次將完成Kex2反應的樣品液裝到柱中(20mg/mL)，用2倍柱容積的10％洗脫液洗乾淨柱子，以最後共8倍柱容積的洗脫液以10％-80％的梯度程序洗脫，隨後用100％、2倍柱容積的洗淨柱子，分部收集洗脫液，每部分6mL。分部收集的洗脫液進行HPLC分析，取出不含接頭-[Nα-Boc]-[RHHGSGSPSRHRR]和未切斷的[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的部分。
結果回收率84.4％，純度97.5％[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)濃度5.62mg/mL溶液量120mL肽含量600mg洗脫液用蒸發器除去溶劑，冷凍乾燥。從用OmpT蛋白酶衍生物加工得到的1700mg前體(實施例3)獲得600mg[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)(圖2)實施例9[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)純化的回收率和純度表。
表2是實施例3到實施例8製備[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)的收率一覽表。

Pre-8-28*表示[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)Boc-Pre8-28**表示[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)Boc-8-28***表示[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)實施例10(10-1)氨基末端側片段[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)的合成(方法1)
將脯氨醯-2-氯代三苯甲基樹脂(NOVOBIOCUM公司制，1.39g，1.0mmol)加入帶玻璃漏鬥的反應容器中，按次序反覆進行用HBTU導入Fmoc-胺基酸和用哌啶脫Fmoc，向氨基末端導入Boc-Gly，構建成Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯代三苯甲基樹脂。得到的連接了保護性肽樹脂用0.1M TBAF/DMF溶液(50mL)處理30分鐘。濾出肽接樹脂，用DMF溶液(30mL)洗滌數次。用異丙醇、接著用DCM(30ml)洗滌，然後用NMP(5mL)膨潤得到的脫去TBDMS肽樹脂，在有DMAP(374mg，3.1mmol)存在的條件下，加入辛酸(588mg，4.1mmol)、EDC HCl(848mg，4.4mmol)令其反應16小時。濾出樹脂，依次用NMP、異丙醇、DCM洗滌，減壓乾燥，得到連有第三位絲氨酸側鏈被辛醯化的保護性肽樹脂。向其中加入0.5％TFA/DCM溶液30mL，在室溫下攪拌30分鐘，使保護性肽從樹脂上脫離。濾除樹脂，將濾液濃縮後，向殘渣中加水得到沉澱。濾出沉澱後，在正己烷中攪拌洗滌乾淨，再過濾。將其減壓乾燥過夜，得到目的產物742mg(收率72％)。用HPLC檢測其純度為94％。
(10-2)氨基末端側片段[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)的合成(方法2)將脯氨醯-2-氯代三苯甲基樹脂(NOVOBIOCUM公司制，1.95g，1.0mmol)加入帶玻璃漏鬥的反應容器中，按次序反覆進行用HBTU導入Fmoc-胺基酸和用哌啶脫Fmoc，向氨基末端導入Boc-Gly，構建成Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯代三苯甲基樹脂。然後用HOOBt/DCC導入Fmoc-Ser-OH，再脫去Fmoc和HOOBt/DCC的縮合，反覆進行此步驟。在N末端殘基導入Boc-Gly，構建Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯三苯甲基樹脂。將得到的連接了保護性肽樹脂用NMP(5mL)膨潤，再在有DMAP(374mg，3.1mmol)存在的條件下，加入辛酸(588mg，4.1mmol)、EDC HCl(848mg，4.4mmol)令其反應16小時。濾出樹脂，依次用NMP、異丙醇、DCM洗滌，減壓乾燥，得到連有第三位絲氨酸側鏈被辛醯化的保護性肽樹脂。向其中加入0.5％TFA/DCM溶液30mL，在室溫下攪拌30分鐘，使保護性肽從樹脂上脫離。濾除樹脂，將濾液濃縮後，向殘渣中加水得到沉澱。濾出沉澱後，在正己烷中攪拌洗滌乾淨，再過濾。將其減壓乾燥過夜，得到目的產物715mg(收率69％)。用HPLC檢測其純度為74％。
實施例11片段的縮合和脫保護分別由實施例10-1和實施例8得到的[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)和[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)在用胺基酸分析儀定量後供作縮合反應用。將[Nα-Boc，Ser2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)、HBTU和DIPEA各0.19mmol分別溶化在1mL DMF中，在室溫攪拌30分鐘。然後將[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)和DIPEA分別溶化在1.5mL DMF中，使其濃度分別為0.16mmol和0.48mmol，邊攪拌，邊滴加上述有活性化氨基末端的片段溶液。1小時後，減壓除去溶劑，加入Et2O到殘渣析出，洗滌乾淨後再乾燥。在得到的粉末中加入6mL TFA，在室溫下緩慢攪拌30分鐘。減壓蒸發掉TFA，加Et2O析出殘渣，洗滌乾淨，乾燥，得0.70g白色粉末狀的肽粗製品。用分析型HPLC對其進行分析的結果表明，分析圖譜上目的物純度為80％，其保留時間與全化學合成品一致。而且用半合成品和全化學合成品混合注射進樣，出峰一致。縮合前後的HPLC圖譜如圖3所示。
實施例12hGhrelin的純化將實施例11所得之0.70g白色粉末狀的肽粗製品用5％乙酸溶解成7mg/mL，按下述條件進行純化。
方法、條件使用得色譜柱Source 30 RPC(HR10/30)23mL(AMASIUM PARMACIA公司制樹脂)內徑(內徑10mm×長30mm，平衡、洗滌液10％的乙腈，50mM乙酸鈉洗脫液60％的乙腈，50mM乙酸鈉樹脂再生液80％的乙腈流速流速2.5mL/分鐘(2cm/min)
用3倍柱容積的平衡用液平衡後，將hGhrelin溶液分成兩份，將半份半份的樣品加入柱中，用3倍柱容積的平衡液洗滌柱子(UV下降前)。以6倍容積的按0％-100％的梯度洗脫的程序洗脫。洗脫液按5mL一份分部收集，按時用HPLC分析，收集含有hGhrelin的部分。將收集液用蒸發器蒸去溶劑後，冷凍乾燥。結果得到純度為98％的hGhrelin512mg。純化hGhrelin的HPLC分析結果見圖4所示，以下從實施例13到實施例15是關於上述實施例1到實施例12所述條件的優化試驗。當然本發明並不只限於下述條件。
實施例13Kex2的切斷率因不同的融合蛋白胺基酸序列而不同Kex2的切斷率因底物的識別序列不同而有很大差異。有報告指出，在體內試驗時，其切斷率依以下切割序列排列KR(10)》RR(5)》TR(1.2)＞PR(1.0)(括號內PR為1時的切斷率)(Proc.Natl.Acad.Sci 95，p.10384-10389，1998)。
圖5表示用實施例1製備的p117s 8-28oPR、p117 8-28oRR，以及p117 8-28oPR為模板，通過PCR構建的質粒p117 8-28oKR所表達的蛋白質。
分別培養保有表達上述3種蛋白的質粒的大腸桿菌W3110菌株，用實施例2到實施例6所述方法，以大約十分之一的規模進行純化，製備出[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHPR]hGhrelin(8-28)[以下簡稱PR-hGhrelin(8-28)]、[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)[以下簡稱RR-hGhrelin(8-28)]和[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHKR]hGhrelin(8-28)[以下簡稱KR-hGhrelin(8-28)]3種肽、[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHKR]hGhrelin(8-28)3種肽。
製備的肽用實施例7所述方法，以Kex2蛋白酶處理。反應開始60分鐘後HPLC分析圖譜如圖6所示。
由圖6可見，其切斷率按以下順序遞減RR-hGhrelin(8-28)＞PR-hGhrelin(8-28)＞KR-hGhrelin(8-28)，以對RR-hGhrelin(8-28)的切斷率最高。同時KR-hGhrelin(8-28)中KR的賴氨酸殘基被Boc保護著，使賴氨酸的電荷消失，因而完全不被切斷。而PR-hGhrelin(8-28)的切斷率較低，在hGhrelin(8-28)分子內部被切斷。這種在hGhrelin(8-28)分子內部被切斷髮生在hGhrelin的第15位精氨酸和第16位賴氨酸之間。
實施例14適用於大腸桿菌培養物的融合蛋白的構建為了獲得適用於大腸桿菌培養物的融合蛋白，除以圖5表示的實施例13所述融合蛋白外，還構建了圖7所示之表達融合蛋白的質粒。以編碼圖7所示之各種融合蛋白的p117 8-28oPR為模板，用PCR由各種不同的聚合物構建了表達質粒。以p117 8-28oRR為出發質粒，構建了使表達的蛋白質的等電點降低的變異體。
將構建的表達融合蛋白質的質粒分別轉化大腸桿菌W3110菌株，被轉化的大腸桿菌用3L發酵罐裝2L液體進行培養。前培養用LB肉湯在32℃振蕩培養14小時。培養基的組成與實施例2所述相同。在培養基中加入1％葡萄糖作為碳源，在32℃下開始培養。待葡萄糖消耗殆盡再補加甘油繼續培養。而且當葡萄糖消耗殆盡後，將培養溫度提高到37℃。培養結束，將培養液用加壓菌體破碎機(マントンゴ-リン)破碎菌體。培養效果根據培養結束時的濁度和菌體破碎後的濁度來判斷。菌體最終濁度和菌體破碎前後濁度之比高，則表示產生包含體多。結果見圖8之坐標圖A和B所示。
由坐標圖A和B所示之最終濁度和菌體破碎前後濁度比率可見，在所構建的融合蛋白中，p117 8-28oRR融合蛋白的生產性能最高。根據實施例13、14的結果，可認為實施例2所述表達相應蛋白質的質粒p117 8-28oRR適合用於大腸桿菌培養。
實施例15[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)的穩定性在實施例6、7、8中發現有1～10％的Boc基團從[Nα-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)和[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)上脫離下來。[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)上所附加的Boc基團只要從一個部位脫落下來，後續的縮合效率就會大幅度降低，因此以防止Boc基團脫落為目的，探討了[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)的穩定性。
保存pH和保存溫度被認為是影響分解的參數，通過HPLC分析評價了下述條件下的穩定性。
方法將新製備的[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)溶解在30mM乙酸鈉溶液中，用TFA調節pH為2、3、4，用5N NaOH調節pH為6、7、8，放在4℃、20℃、37℃、42℃恆溫葙中一周。從開始放置起，在0小時、2小時、6小時、9小時、24小時、48小時、96小時和168小時取樣，用HPLC進行分析。以HPLC分析時[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)的峰面積在總峰面積中所佔比例作為跟蹤評價穩定性的標準。
結果在圖9和圖10中總結了各保存溫度下的4種坐標圖。得知pH越低(pH3以下)，溫度越高，分解產物越多。如果pH在4以上，即使在42℃下也是穩定的。因此控制pH是阻止產生分解產物的重要手段。
實施例16 hGhrelin(8-28)的製備(方法2)(1)hGhrelin(8-28)衍生物表達載體p117-8-28ok的構建用與實施例1相同的方法得到質粒p117-8-28ok。實施例1中所構建的質粒p117-8-28oPR與質粒p117-8-28ok的差別，在於前者的接頭序列是EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(序列編號26)，而後者是RRHHGSGSPSRHPR(序列編號35)。
(2)用大腸桿菌表達重組hGhrelin(8-28)融合蛋白用表達hGhrelin(8-28)融合蛋白的質粒p117-8-28ok轉化大腸桿菌W3110菌株得到轉化子菌株。將此菌株在20L發酵罐中，以葡萄糖和甘油為碳源進行培養，得到OD660值為54的培養液。
(3)用內源性OmpT蛋白酶加工hGhrelin(8-28)融合蛋白用20L TE緩衝液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8)懸濁從上述第(2)項中的培養液中得到的菌體，用高壓勻漿器對菌體進行兩次破碎處理。離心回收包含體，將包含體再懸浮到無離子水中離心洗滌包含體。然後將離心所得的沉澱物(溼重約170g)懸浮在少量無離子水中，得到OD660值為826的包含體濃縮液550mL。由此550mL包含體濃縮液中取出50mL，用無離子水稀釋至OD660值為50.0，加入Tris-HCl(pH8.2)、EDTA(pH8.0)，使其終濃度分別為50mM和1mM，用尿素(終濃度4.0M)使包含體溶解。通過用尿素溶解包含體，內源性OmpT蛋白酶可以切斷融合蛋白接頭序列RRHHGSGSPSRHPR(序列編號35)的Arg-Arg之間的肽鍵。即將反應液在30℃保溫5分鐘後，在30℃用OmpT蛋白酶處理。然後加入3％的乙酸停止反應。這種處理得到RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)1.3g。其ESI-MS值為4019(理論值4018)。通過高效液相色譜分析，表明用內源性OmpT蛋白酶加工hGhrelin(8-28)融合蛋白的加工方法，RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)被分離出來。
(4)RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)的純化(陽離子交換純化)將上述第(3)項中得到的OmpT蛋白酶反應液(900mL)分4次用離子交換色譜柱分離純化。該柱中裝有陽離子交換樹脂(SP-Toyopear I550-c(樹脂床體積55mL，內徑16mm ID×280mm TOSOH公司製造)，該樹脂經平衡液(1.5M尿素，20mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.3)平衡。每次裝柱後都用平衡液充分洗滌柱後，用總體積為1.5倍柱容積的由75％的平衡液和從25％到100％的梯度洗脫液(1.5M尿素，1.5MNaCl，10mM Tris-HCl，pH8.3)進行程序洗脫，分部收集洗脫液，每部分5mL，用高效液相色譜分析每部分，取出不含大腸桿菌β-半乳糖苷酶衍生物的洗脫峰的部分。4次共回收950mg純化產物。
將上述純化洗脫液(660mL)兩等分，分兩次過柱，該色譜柱為YMC-ODS AM柱(顆粒直徑20μm，YMC公司產品)，柱規格為內徑21.5mm ID×300mm，並經過2％乙腈、0.1％TFA平衡。用平衡液充分洗滌後，用洗脫液(50％乙腈、0.095％TFA)洗脫。分部收集洗脫液，選取有洗脫峰的部分，用旋轉蒸發器除去含在洗脫液中的乙腈，得到含有720mgRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)的220mL。在第(3)(4)項中使用的高效液相色譜的條件如下柱YMC-ODS AP-302；監測器日立高效液相色譜系統(D7000)；流速1mL/分鐘；洗脫100％的緩衝液A(1.0％乙腈，0.1％TFA)和100％的緩衝液B(50.0％乙腈，0.1％TFA)在20分鐘內進行直線梯度洗脫。
(5)RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)的叔丁氧基碳醯基(Boc)化將由上述第(4)項得到的樣品220mL[含有720mgRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)]轉移到玻璃三角瓶中，加入等量的乙腈(220mL)。加入1M的二碳酸二叔丁酯4.4mL，其加入量相當於存在於RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)中的α-氨基和賴氨酸ε＝氨基pH8.3數(共5個部位)五倍摩爾量(終濃度為10mM，25個當量)。再用三乙胺調節pH為9，在室溫下用攪拌機攪拌反應60分鐘。加入乙酸使其終濃度為0.5％停止反應，在pH接近中性後用旋轉蒸發器迅速除去乙腈，得到含有530mg RHHGSGSPSRHPR-[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)的溶液300mL。ESI-MS4519(理論值4518)。
根據Boc化前後RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)的洗脫曲線圖和質譜分析結果，確認生成了Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)。用下述色譜系統監測本反應柱YMC-C8；檢測器監測器日立高效液相色譜系統(D7000)；流速1Ml/分；洗脫100％的緩衝液A(1.0％乙腈，0.1％TFA)和100％的緩衝液B(60.0％乙腈，0.095％TFA)在20分鐘進行直線梯度洗脫。
(6)藉助Kex2蛋白酶製備[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)將上述第(5)項得到的Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)用反向柱進行純化。將上述Boc衍生物裝柱，該反向柱為YMC-ODS AM柱(粒徑20μm，TOSOH公司產品)，柱規格為內徑21.5mm ID×300mm，並經過2％乙腈、0.1％TFA和10mM乙酸鈉pH4.5平衡。用平衡液充分洗滌後，用洗脫液(70％乙腈、0.095％TFA、10mM乙酸鈉，pH4.5)洗脫。分部收集洗脫液，選取含有Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)(420mg)的洗脫峰部分，用蒸發器除去乙腈。向該溶液中加入250mM氯化鈣和1MTris-HCl，pH8.2使終濃度分別達到5mM和50mM。在30℃保溫5分鐘後，加入Kex2蛋白酶(日本公開專利平成10年-229884號公報)溶液(1×107Unit/mL)使其濃度為3×104Unit/mL，30℃反應45分鐘。
用高效液相色譜剖析本工序，表明將接頭序列RHHGSGSPSRHPR和[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)之間的鍵切斷了。
(7)[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)化合物的純化將上述第(6)項得到的含有[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)(320mg)的反應液(300mL)用乙酸調節pH到3.5後，裝柱，該反向柱為ODS-80Ts(21.5mm ID×300mm柱(108mL)，粒徑20μm，TOSOH公司產品)，並經過10％乙腈、0.095％TFA平衡。用2倍柱體積的平衡液充分洗滌後，用5倍柱容積的由70％的緩衝液A(10％乙腈，0.095％TFA)和30％到100％的緩衝液B(65％乙腈，0.1％TFA)進行程序梯度洗脫。洗脫出[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)。分部收集洗脫液，每部分5mL，用高效液相色譜(條件同(6))分析。收集有[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)複合體的洗脫峰部分，濃縮後冷凍乾燥，得到136mg[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)複合體。從藉助OmpT蛋白酶衍生物加工得到的1300mg前體(見上述第(3)項)得到136mg[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)化合物的最終純品。(8-1)氨基末端片段[Nα-Boc，Ser2，6(tBoc)]Ghrelin(1-7)的合成(方法1)採用自動肽合成儀，在脯氨醯-2-氯三苯甲基樹脂(NOVOBIOCUM公司制，548mg，0.25mmol)上按次序反覆進行用HBTU導入Fmoc-胺基酸和用哌啶脫Fmoc，向氨基末端導入Boc-Gly，在樹脂上構建成Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯代三苯甲基樹脂。得到的連接了保護性肽樹脂用0.1M TBAF/DMF溶液(50mL)處理30分鐘。濾出肽接樹脂。用0.1M TBAF/DMF溶液(5mL)處理得到的保護性肽樹脂(757mg)。取出肽樹脂，用DMF(10mL)洗滌數次後，用異丙醇、然後用洗滌。然後將得到的脫去TBDMS的肽接樹脂在DMF(10mL)終膨潤，在有DMAP(31mg，0.25mmol)存在的條件下，加入辛酸(144.2mg，1.0mmol)、EDC HCl(211mg，1.1mmol)令其反應16小時。濾出樹脂，依次用DMP、異丙醇、二氯甲烷洗滌，減壓乾燥，得到第三位絲氨酸側鏈被辛醯化的保護性肽樹脂。向其中加入乙酸2mL/TFE2mL/二氯甲烷6mL的混合液，在室溫下攪拌1小時，使保護性肽從樹脂上脫離。濾除樹脂，將濾液濃縮後，向殘渣中加乙醚得到沉澱。濾出沉澱後，乾燥，得到肽粗製品248mg(收率96％)。將此肽粗製品溶解在2mL由乙酸水溶液和乙腈配成的混合液中，裝到YMC-Pack ODS A(20mm×250mm)柱中，在0.1％三氟乙酸中，以40％到80％濃度的乙腈，在60分鐘內進行直線梯度濃度程序洗脫(流速10mL/分)。收集含目的物的部分，冷凍乾燥，得到210mg產物。(8-2)氨基末端片段[Nα-Boc，Ser2，6(t-Boc)]Ghrelin(1-7)的合成(方法2)採用自動肽合成儀，在脯氨醯-2-氯三苯甲基樹脂(NOVOBIOCUM公司制，466mg，0.25mmol)上按次序反覆進行用0.1％HBTU導入Fmoc-胺基酸和用哌啶脫Fmoc，向氨基末端導入Boc-Gly，在樹脂上構建成Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯代三苯甲基樹脂。將此樹脂用1％TFA和5％TIPS/二氯甲烷處理30分鐘，同時進行去除Trt基團和將肽從樹脂上切斷的過程。濾出樹脂後，減壓除去二氯甲烷，濃縮，向其中加入乙醚析出並乾燥，得到165mg Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH的白色沉澱。加入苯甲醯甲基溴(40mg，1.1當量)和三乙胺(20mg，1.1當量)，在約3mL的DMF中反應2小時。反應結束後，將反應溶液倒入5倍體積的乙酸乙酯中，用水和飽和食鹽水洗淨，加入硫酸鈉乾燥，除去硫酸鈉後濃縮，用乙醚析出並乾燥，得到白色沉澱物Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Opac。然後加入辛酸(18.2mg，1.1當量)、EDC HCl(26.4mg，1.2當量)、DMAP(1.4mg，0.1當量)，在約2mL DMF中反應過夜。將反應溶液倒入5倍體積的乙酸乙酯中，用水和飽和食鹽水洗淨，加入硫酸鈉乾燥，除去硫酸鈉後濃縮，用乙醚析出固體並乾燥，得到144mg白色沉澱物Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(辛醯基)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Opac。再加入乙酸1.5mL、鋅粉(163mg，20當量)反應1小時，過濾，加冷水析出沉澱，用乙醚洗滌乾燥。得到65mg Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(辛醯基)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH的白色沉澱。將其溶解在約2mL由乙酸水溶液和乙腈配成的混合液中，裝到YMC-Pack ODS A(20mm×250mm)柱中，在0.1％三氟乙酸中，以40％到80％濃度的乙腈，在60分鐘內進行直線梯度濃度程序洗脫(流速10mL/分)。收集含目的物的部分，冷凍乾燥，得到50mg產物。
(9)片段的縮合和脫保護先用胺基酸分析儀定量由上述(8-1)和(7)中得到的[Nα-Boc，Ser2，6(Boc)]hGhrelin(1-7)和[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)，供縮合反應之用。取[Nα-Boc，Ser2，6(Boc)]hGhrelin(1-7)19.3μmol、HBTU20.3μmol、DIPEA20.3μm溶解在500μL DMF中，在室溫攪拌1小時。然後將[Lys16，19，20，24(Boc)]-hGhrelin(8-28)18.4μmol、HBTU55.2μmol溶解在1mL DMF中，在攪拌中滴加上述活化了氨基末端的片段溶液。3小時後，減壓蒸去反應溶劑，加乙醚析出殘渣，洗淨後乾燥。在得到的粉末中加入3mL TFA，在室溫緩慢攪拌30分鐘。減壓蒸去TFA，加乙醚析出沉澱，洗滌乾燥，得到77mg白色粉末狀肽粗製品。用分析型HPLC對其進行分析的結果表明，分析圖譜上目的物純度為83％，其保留時間與化學合成品一致。而且用半合成品和全化學合成品混合注射進樣，出峰一致。
(10)hGhrelin(8-28)化合物的純化將由上述(9)得到的67mg hGhrelin(8-28)白色粉末狀粗製品用1％乙酸溶解成1mg/mL濃度為1mg/mL的溶液，裝入經0.1M乙酸平衡過的反向色譜柱[TSK-ODS-80Ts，108mL(ID21.5mm×300mm)]，用2倍柱容積的平衡液洗滌後，用5倍柱容積的100％的緩衝液A(0.1M乙酸)和100％的緩衝液B(40％乙腈，0.1M乙酸)進行濃度梯度洗脫，將hGhrelin(8-28)化合物洗脫出。收集高純度部分，冷凍乾燥，得到34.4mghGhrelin(8-28)。
ESI-MS 3371(理論值3370.86)；用6N鹽酸水解後的胺基酸組成比為Ala1.01(1)，Arg2.97(3)，Glx5.95(6)，Gly1.02(1)，His1.00(1)，Leu2(2)，Lys4.01(4)，Phe1.00(1)，Pro4.01(4)，Ser3.60(4)，Val」1.00(1)(括號內為理論值)；鈣移動(Camobilization)活性為1.3nM(參照值為1.5nM)實施例17 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH的脫TBDMS條件和辛醯化條件的最佳化依照實施例16(8-1)的方法，探討了從第3位胺基酸絲氨酸上除去TBDMS基團和辛醯化反應的最適條件。用自動肽合成儀(APPLIEDBIOSYSTEM公司製造)，在脯氨醯-2-氯三苯甲基樹脂上按次序反覆進行用HBTU導入Fmoc-胺基酸和用哌啶脫Fmoc，向氨基末端導入Boc-Gly，構建成Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-氯代三苯甲基樹脂。將此樹脂分成0.05mmol(約150mg)一份，按表3和表4所列的條件進行辛醯化。樹脂的洗滌、由樹脂上切斷肽等工序的條件與實施例16(8-1)所述相同。
結果表明，除去TBDMS基團的反應採用0.1M TBAF反應30分鐘到1小時最合適，辛醯化反應的最適條件則是用4當量的辛酸、4.4當量的EDC和1當量的DMAP，反應8～16小時。
表3除去TBDMS基團的反應a

aTBDMS基團去除率由辛醯化的經TBAF處理之肽接樹脂中得到的脫保護辛醯基化合物和顯示未除去TBDMS的脫辛醯基化合物之比求得。辛醯基化的條件是，用辛酸4當量、EDC4.4當量、DMAP1當量反應24小時。
b以脯氨醯-2-氯三苯甲基樹脂的置換率為標準計算而得。
c目的物得純度和比率，由分析型HPLC計算出dN.D.表示未檢出。
表4第3位胺基酸絲氨酸得辛醯化反應a

a全部樣品用0.1M TBDMS處理1小時，除去TBDMS基團。
b以脯氨醯-2-氯三苯甲基樹脂的置換率為標準計算而得。
c目的物得純度和比率，由分析型HPLC計算出dN.D.表示未檢出。
實施例18片段縮合條件之探討用[Nα-Boc，Ser2，6]hGhrelin(1-7)和[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)探討了各種縮合試劑的反應效率，結果表明HBTU效果最好，用EDC/HOBt、EDC/HOSu、DPPA等也能進行反應。
表5[Nα-Boc，Ser2，6]hGhrelin(1-7)+[Lys16，19，20，24(Boc)]hGhrelin(8-28)

工業實用性採用本發明中的製造方法，可以高收率獲得品質非常高的修飾性肽和蛋白質。
序列表110第一三得利製藥株式會社(Daiichi Suntory Pharma Co.，Ltd.)110寒川賢治(Kenji KANGAWA)120修飾肽的製造方法(A method for producing a modified peptide)130SCT042239-47150JP 2002-1097611512002-04-1116039210121128212PRT213智人(Homo sapiens)223生長激素促分泌素的人內源肽的胺基酸序列4001Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25210221127212PRT
213智人(Homo sapiens)223生長激素促分泌素的人內源肽(27個胺基酸)的胺基酸序列4002Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25210321128212PRT213褐家鼠(Rattus norvegicus)223生長激素促分泌素的大鼠內源肽的胺基酸序列4003Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25210421127212PRT213褐家鼠(Rattus norvegicus)223生長激素促分泌素的大鼠內源肽(27個胺基酸)的胺基酸序列4004Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25210521128212PRT213小家鼠(Mus musculus)223生長激素促分泌素的小鼠內源肽的胺基酸序列4005Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25210621128212PRT213Sus scrofa(豬)223生長激素促分泌素的豬內源肽的胺基酸序列4006Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg20 252107
21127212PRT213特羅斯牛(Bos taurus)223生長激素促分泌素的牛內源肽(27個胺基酸)的胺基酸序列4007Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg20 25210821127212PRT213綿羊(Ovis aries)223生長激素促分泌素的綿羊內源肽(27個胺基酸)的胺基酸序列4008Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg20 25210921128212PRT213犬科(Canis familiaris)223生長激素促分泌素的狗內源肽的胺基酸序列
4009Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 252101021121212PRT213日本鰻(Anguilla japonica)220
221醯胺化作用(AMIDATION)22221223生長激素促分泌素的鰻內源肽的胺基酸序列40010Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys1 5 10 15Lys Pro Pro Arg Val202101121123212PRT213鉤吻鮭(Oncorhynchus mykiss)220
221醯胺化作用(AMIDATION)22223223生長激素促分泌素的虹鱒魚內源肽(23個胺基酸)的胺基酸序列
40011Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly1 5 10 15Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val202101221120212PRT213鉤吻鮭(Oncorhynchus mykiss)220
221醯胺化作用(AMIDATION)22220223生長激素促分泌素的虹鱒魚內源肽(20個胺基酸)的胺基酸序列40012Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys1 5 10 15Pro Pro Arg Val202101321124212PRT213家雞(Gallus domesticus)223生長激素促分泌素的雞內源肽的胺基酸序列40013
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys1 5 10 15Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg202101421124212PRT213家雞(Gallus domesticus)223生長激素促分泌素的雞內源肽的胺基酸序列40014Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys1 5 10 15Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg202101521126212PRT213家雞(Gallus domesticus)223生長激素促分泌素的雞內源肽的胺基酸序列40015Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys1 5 10 15Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His20 25
2101621127212PRT213Rana cafesbeiana223生長激素促分泌素的青蛙內源肽的胺基酸序列40016Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met20 252101721128212PRT213Rana cafesbeiana223生長激素促分泌素的青蛙內源肽的胺基酸序列40017Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn20 252101821120212PRT213尼羅羅非魚(Tilapia nilotica)220
221醯胺化作用(AMIDATION)22220223生長激素促分泌素的羅非魚內源肽的胺基酸序列40018Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys1 5 10 15Ser Ser Arg Ile202101921122212PRT213鯰魚(Silurus asotus)220
221醯胺化作用(AMIDATION)22222223生長激素促分泌素的鯰魚內源肽的胺基酸序列40019Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp1 5 10 15Arg Lys Pro Pro Arg Val202102021123212PRT213鯰魚(Silurus asotus)
223生長激素促分泌素的鯰魚內源肽的胺基酸序列40020Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp1 5 10 15Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly202102121128212PRT213馬(Equus caballus)223生長激素促分泌素的馬內源肽的胺基酸序列40021Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg20 25210222114212PRT213人工序列220
223鄰近腸激酶切割位點的胺基酸序列40022Asp Asp Asp Lys
1210232114212PRT213人工序列220
223鄰近血凝因子Xa切割位點的胺基酸序列40023Ile Glu Gly Arg1210242117212PRT213人工序列220
223含有腎素切割位點的胺基酸序列40024Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5210252116212PRT213人工序列220
223
40025Val Asp Asp Asp Asp Lys1 52102621136212PRT213人工序列220
223融合蛋白p117 8-28oPR中的接頭序列40026Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp1 5 10 15Ala Asp Val Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser20 25 30Arg His Pro Arg352102721136212PRT213人工序列220
223融合蛋白p117 8-28oRR中的接頭序列40027Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp1 5 10 15Ala Asp Val Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser
20 25 30Arg His Arg Arg352102821136212DNA213人工序列220
223引物ORI-RR40028ggttccggat ccccttctcg acatcgccgg gaacac362102921125212DNA213人工序列220
223引物SAL*R40029ataagtcgac ttatcgtggc tgcag252103021113212PRT213人工序列220
223
40030
Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Arg Arg1 5 102103121113212PRT213人工序列220
223
40031Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg1 5 102103221113212PRT213人工序列220
223
40032Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Lys Arg1 5 10210332117212PRT213人工序列220
223
40033Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro1 5210342114212PRT213人工序列220
223
40034Phe Leu Ser Pro12103521114212PRT213人工序列——220
223接頭序列40035Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg1 5 102103621127212DNA213人工序列220
223h8-28f140036tccccgcggg aacaccagcg cgtccag 272103721133212DNA213人工序列220
223h8-28r140037acgctgctgg acgcgctggt gttcccgcgg gga332103821149212DNA213人工序列220
223GR2f40038cagcgtaagg aatccaagaa gccaccagct aaactgcagc cacgatgag492103921144212DNA213人工序列220
223GR2r40039
tcgactcatc gtggctgcag tttagctggc ttcttggatt cctt4權利要求
1.一種含有至少一個受到修飾的胺基酸或非胺基酸分子保護的肽片段的製造方法，其特徵在於有由胺基酸或/和非胺基酸組成的特定序列，其中至少有一個胺基酸或非胺基酸分子是用式1-A(R)-(式中A表示胺基酸或非胺基酸，R表示結合在A的側鏈上的為進行修飾而導入的的取代基)表示的被修飾的胺基酸或非胺基酸；同時在弱酸性脫離樹脂上製備受保護的肽片段，組成該肽片段的胺基酸或非胺基酸的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選擇出一種以上可能在製備肽片段時引起不利副反應的反應性功能基被保護性基團保護，然後在弱酸性條件下保護性基團不脫離地將上述肽片段從弱酸性樹脂上脫離。
2.權利要求1所述的肽片段的製造方法，其特徵在於(a)有由胺基酸或/和非胺基酸組成的特定序列，而且在弱酸性脫離樹脂上製備受保護的肽片段，組成該肽片段的胺基酸或非胺基酸的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選擇出一種以上可能在製備肽片段時引起不利副反應的反應性功能基被保護性基團保護；(b)用取代基向受到修飾的胺基酸或非胺基酸的側鏈上的功能基導入保護性基團的情況下，當要脫去該保護性基團時，上述肽片段不會從弱酸性樹脂上脫離；(c)用取代基R修飾上述脫去保護性基團的側鏈；(d)在弱酸性條件下不使上述肽片段中的保護性基團脫離地將上述肽片段從弱酸性脫離樹脂脫離。
3.權利要求2所述的肽片段的製造方法，其中包括被取代基R修飾的胺基酸或非胺基酸A的側鏈上的反應性功能基的保護性基團，是甲矽烷系保護性基團，該保護性基團的脫保護使用氟代季銨鹽。
4.權利要求3記載的肽片段的製造方法，其中甲矽烷系保護性基團是叔丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲矽烷基(TBDPS)、三異丙基甲矽烷基(TIPS)、三異丁基甲矽烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲矽烷基(ThxDMS)或三苯基甲矽烷基(TPS)；氟代季銨鹽是氟化四丁銨(TBAF)、氟化四乙銨(TEF)或氟化銨。
5.權利要求1至4記載的肽片段的製造方法，其中A是絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天門冬氨酸、酪氨酸或天門冬醯胺；R通過酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵、O-糖苷鍵或N-糖苷鍵等與A的側鏈的反應性取代基結合。
6.權利要求5記載的肽片段的製造方法，其中A為絲氨酸或蘇氨酸，R通過酯鍵與A的側鏈羥基結合。
7.權利要求6記載的肽片段的製造方法，其中肽片段是促成長素或它的衍生物，或是含有上述促成長素或它的衍生物中被修飾胺基酸的肽片段。
8.修飾性肽或蛋白質的製造方法，其特徵在於(a)利用權利要求1至7記載的方法製造含有一個以上經修飾的胺基酸或非胺基酸的受保護的肽片段；不同於上述(a)中的肽片段，(b)製造另外的被保護的肽片段，該片段不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸，同時胺基酸或非胺基酸的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選擇出一種以上可能在製備肽片段時引起不利副反應的反應性功能基被保護性基團保護；將上述(a)及(b)中所述的肽片段進行縮合。
9.權利要求8記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中肽片段的縮合採用縮合劑進行。
10.權利要求9記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中縮合劑是2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氫苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷醯疊氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)。
11.權利要求9記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中縮合劑是二異丙基碳化二亞胺(DIPC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，使用上述縮合劑的肽片段的縮合是在1-羥基苯並三唑(HOBt)、1-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)或者3，4-二氫-3-羥基-4-氧基-苯並三嗪(HOOBt)的存在下進行。
12.權利要求8至11記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段是藉助酶法和/或基因重組法製造的。
13.權利要求12記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中包括用下列方法製造不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段工序(1)培養由表達載體轉化的細胞，並從其培養物中提取有上述肽片段的胺基酸序列的肽(以下簡稱目的肽)或蛋白質。該表達載體含有編碼目的肽的鹼基序列，或編碼根據要求通過接頭在目的肽上附加了保護性肽的融合蛋白的鹼基序列。工序(2)當工序(1)中提取出融合蛋白時，從得到的融合蛋白中切斷分離出保護性肽和根據需要特定的接頭序列，以及目的肽，根據需要進一步純化目的肽。工序(3)在由工序(1)和工序(2)得到的目的肽的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選出一種以上可能在製備肽片段時引起不利副反應的反應性功能基用保護性基團保護。
14.權利要求13記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中工序(2)切斷分離出保護性肽和根據需要特定的接頭序列，以及目的肽，用OmpT蛋白酶或其衍生物和Kex2蛋白酶或其衍生物分兩步進行。
15.權利要求13或14記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中接頭的序列是以序列編號27記載的序列。
16.權利要求12至15記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其特徵是肽片段為不含有促成長素或其衍生物中受到修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段。
17.權利要求12至16記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其特徵是不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段在pH4～8的溶液中純化和保存。
18.權利要求12至17記載的修飾性肽或蛋白質的製造方法，其中保護性基團是Boc基。
19.不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其特徵是包含以下方法的製造方法工序(1)培養由表達載體轉化的細胞，並從其培養物中提取有特定胺基酸序列的肽(以下簡稱目的肽)或下述融合蛋白，該表達載體含有編碼目的肽的鹼基序列，或編碼根據要求通過接頭在目的肽上附加了保護性肽的融合蛋白的鹼基序列；工序(2)當工序(1)中提取融合蛋白時，從得到的融合蛋白中切斷分離出保護性肽和根據需要特定的接頭序列，以及目的肽，根據需要進一步純化目的肽；工序(3)在由工序(1)和工序(2)得到的目的肽的側鏈上的羥基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巰基和羧基等基團中選出一種以上可能在製備肽片段時引起不利副反應的反應性功能基用保護性基團保護；工序(4)在pH4～8的溶液中純化和保存由工序(3)得到的被保護的目的肽。
20.權利要求19記載的受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其中保護基是Boc基。
21.權利要求19或20記載的不含有受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其中工序(2)切斷分離出保護性肽和根據需要特定的接頭序列，以及目的肽，用OmpT蛋白酶或其衍生物和Kex2蛋白酶或其衍生物分兩步進行。
22.權利要求19至21記載的受到修飾的胺基酸或非胺基酸保護的肽片段的製造方法，其中接頭序列是序列號27記載的序列。
23.權利要求19至22記載的修飾肽或蛋白質的製造方法，其特徵是肽片段是不含有促成長素或其衍生物中的受到修飾的胺基酸或非胺基酸的肽片段。
全文摘要
本發明是製造含有側鏈被修飾的胺基酸殘基的肽和蛋白質的方法，其特徵是以化學方法用弱酸性脫離樹脂製造含有側鏈被修飾的胺基酸殘基的肽片段，以基因重組方法和酶學方法製造不含側鏈被修飾的胺基酸殘基的肽片段，再將上述兩種肽片段加以縮合而成。採用本發明，可以高效獲得優質的含有經過醯化、糖基化或磷酸化修飾之肽或蛋白質。
文檔編號C07K14/60GK1612891SQ0380190
公開日2005年5月4日 申請日期2003年4月10日 優先權日2002年4月11日
發明者南竹義春, 松本大, 牧野智宏 申請人:第一三得利製藥株式會社, 寒川賢治