針對胃泌素釋放肽前體的抗體及其應用的製作方法

2023-10-20 18:21:47

專利名稱：針對胃泌素釋放肽前體的抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種針對胃泌素釋放肽前體的抗體及其應用，所述抗體廣泛用於包括 小細胞肺癌在內的各種疾病的早期發現和治療監測、復發監測等。
背景技術：
在日本，死因的第1位是惡性腫瘤，其中肺癌死亡率呈逐年上升趨勢，在男性中超 過胃癌成為死因的第1位，在女性中也佔第3位。肺癌在病理組織學上主要分為以下4種 組織類型，即發生於肺門部的肺鱗狀上皮細胞癌(squamous-cell carcinoma)和小細胞 肺癌(small-cell lungcarcinoma :SCLC)、發生於肺野部的肺腺癌(adenocarcinoma)和大 細胞月市癌(Large-cell lung carcinoma)。尤其是小細胞肺癌，由於增殖快速，早期即發生遠處轉移，因此初診時發現大多已 是全身性轉移的進行性癌。關於該類型癌的治癒率，對於病變局限於一側肺野的小細胞肺 癌的局限型(Limited disease :LD)患者，其治癒率為約20%；對於已經轉移至兩肺和其他 臟器的擴散型(extensive disease :ED)患者，可以說事實上難以治癒。此外，由於小細胞肺癌對抗癌劑的敏感性高，因此，化學療法是首選的治療方法， 相反，對於非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma :non_SCLC)，由於化學療法的 療效差，因此外科療法是首選的治療方法。因此，小細胞肺癌是肺癌中特別需要早期發現、早期治療的癌症，所以，將小細胞 肺癌和非小細胞肺癌進行鑑別診斷，對於確定治療方案極其重要。發現肺癌的方法之一是痰液檢查。然而，痰液檢查主要適於肺鱗狀上皮細胞癌的 檢查，對小細胞肺癌而言，存在陽性率低的問題。此外，X射線攝影法也是廣泛使用的發現 肺癌的方法，但是對於發生於肺門部的肺鱗狀上皮細胞癌和小細胞肺癌，肺門部由於受到 心臟的影響，存在癌組織的陰影非常難以拍到的問題。此外，關於小細胞肺癌，對肺野呈現 異常陰影的患者，即使使用痰液細胞學診斷、胸部X射線普通攝影、CT掃描、支氣管內窺鏡 等，也難以早期發現該類肺癌。此外，用於診斷癌症的一些檢查方法，例如放射線照射、活組織檢查或支氣管內窺 鏡等，會對患者造成痛苦，且需要昂貴的儀器和熟練的技術等。因此，正在進行腫瘤標誌物的研究，以便通過更簡便的血液檢查，在能夠治癒的時 期可高效診斷出癌症。目前，在癌症的發現、診斷、病情監測指標、復發診斷等中使用了 30 種以上的腫瘤標誌物。由於肺癌組織類型多樣，所以還沒有報導過對所有類型肺癌的發現或診斷均有效 的腫瘤標誌物。因此，目前根據肺癌的組織類型來選擇和使用有效的標誌物。例如，對於肺腺癌，主要選擇使用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen :CEA)或 唾液酸化Lex-i抗原；對於肺鱗狀上皮細胞癌，主要選擇使用鱗狀上皮細胞癌相關抗原 (squamous-cell carcinoma relatedantigen :SCC)；對於小細胞肺癌,主要選擇使用神經 元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase :NSE)等。
然而，NSE存在如下缺點(1)針對可治癒的早期癌的陽性率低；( 治療引起測定 值出現暫時性上升；C3)採血時的溶血引起測定值上升；(4)小細胞肺癌患者與正常健康者 的測定差值小等。因此，對於小細胞肺癌來說，NSE未必是有效的腫瘤標誌物。胃泌素釋放肽(Gastrin-Releasing Peptide :GRP)是 McDonald 等在 1978 年 從豬的胃組織中分離出的一種具有促進胃泌素分泌作用的、由27個胺基酸組成的腦腸肽 (brain-gut peptide) 0已證實人類也存在GRP，並於1984年克隆出編碼人類GRP的基因。日本國立癌中心的山口等，在認為是來自神經內分泌細胞的小細胞肺癌的生物學 特性的研究過程中，測定了包括促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone =ACTH) 和降鈣素等15種以上的腦腸激素，發現在培養的小細胞肺癌株中，GRP以最高頻率且高濃 度地得到積極分泌(非專利文獻1)。並且，建立了組合有血中GRP濃縮法的放射免疫測 定法(RIA)，發現小細胞肺癌患者與健康人相比，呈現出高的血中GRP濃度。然而，由於GRP 在血中會快速降解，因此血中濃度低，此外，由於上述測定需要複雜的濃縮操作，因此臨床 應用困難。根據此後的研究可知，在各種細胞中，通過選擇性RNA剪接(alternative RNA splicing)，產生3種GRP前體(ProGRP)(非專利文獻2)。這3種ProGRP，其第1-98位氨 基酸序列是相同的，而第99位以後，通過選擇性RNA剪接，變成互不相同的胺基酸序列。該 相同的第1-98位胺基酸序列在序列編號1中示出。下文只要沒有特別說明，本發明中的 ftx)GRP、其部分序列、降解物等胺基酸殘基的編號均用序列編號1的胺基酸序列的編號表
7J\ ο3種ftx)GRP的第1-27位胺基酸序列，與具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的該部 分胺基酸序列相同。這3種前體均通過激素前體切斷酶，降解為由第1-27位胺基酸序列構 成的成熟型GRP;以及由第31位以後的胺基酸序列構成的、不具有促胃泌素分泌活性的、作 為ftOGRP降解物的C末端片段(ftOGRP-Cfrag)。Holst等(非專利文獻3)報導通過對由ftx)GRP的第42_53位胺基酸序列構成 的肽(以下稱為ft~oGRPG2-53))使用抗血清進行放射免疫測定(RIA)，發現小細胞肺癌患 者血漿中的ftx)GRP或ftOGRP-Cfrag水平高。然而，該方法需要沉澱萃取操作，靈敏度也不 足。三宅等著眼於ftx)GRP與GRP相比在血中的穩定性高、以及作為3種ftx)GRP共同 部分的第31-98位胺基酸序列對其他蛋白質的胺基酸序列沒有顯示出相同性，使用由該氨 基酸序列構成的重組肽(以下稱為ft~oGRP(31-98))作為抗原得到的高效價抗血清，建立了 無需沉澱萃取操作的高靈敏度RIA法(非專利文獻1)。通過該方法，使ftx)GRP成為與GRP 同樣優異的腫瘤標誌物。該方法在無需萃取操作方面是有利的，但是測定需要4天時間，且靈敏度不足，為 IOpM(77. 3pg抗原/mL)，因此不能測定健康人血清中的ftx)GRP值，尚未得到臨床應用。此外，上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法，因此，雖然只要ftx)GRP片段的一 部分具有抗原性就能進行測定，但是其靈敏度比夾心(sandwich)法低，因此難以實現需要 高靈敏度的ftx)GRP測定法的臨床應用。即為了在臨床上進行ftx)GRP檢測，必須提高檢測 靈敏度，尤其需要能在夾心法中使用的抗體。山口、青柳等以ftx)GRP的小細胞肺癌用腫瘤標誌物的臨床應用為目的，開發了以酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay =ELISA)為原理、使用夾心法的簡 便且高靈敏度的ftx)GRP測定試劑(專利文獻1)。該方法在約2小時內獲得結果，並且具有 高靈敏度Opg/mL)，因此目前在臨床上得到廣泛應用，發現與NSE相比，該方法對於小細胞 肺癌的靈敏度高並具有特異性。此外，發現使用該測定法，除了小細胞肺癌以外，在神經內分泌腫瘤(甲狀腺髓樣 癌等)、顯示神經內分泌腫瘤特徵的癌(小細胞食道癌、小細胞胰腺癌、小細胞前列腺癌等) 中，血清ftx)GRP值也上升，認為今後也可以應用於這些腫瘤的早期發現和治療監測等中。然而，雖然ftx)GRP比GRP在血中的穩定性高，但是與其他通常的腫瘤標誌物相比， 卻發現測定值分散。因此，以ftx)GRP為檢測對象的方法，存在下述制約，即測定用樣品必須 在採血後迅速冷凍保存直至測定時為止(非專利文獻4)。青柳開發了使用識別作為ftx)GRP(31-98)內部區域的ftx)GRP的第40_75位的氨 基酸殘基或ftx)GRP的第40-79位的胺基酸殘基的2種以上的抗體的夾心測定法(專利文 獻3)。該方法在測定於4°C保存的樣品時獲得比較穩定的結果，並且顯示與專利文獻2記 載的方法大致相同的檢測靈敏度。然而，該方法如專利文獻3的實施例4所示的那樣，需要 100 μ L樣品量，該量比通常的免疫測定法多。專利文獻1 專利第3210994號公報專利文獻2 特開平6-98794號專利文獻3 國際專利公開W02006/117994號小冊子非專利文獻1 =Cancer Research, 1994 年，第 M 卷，第 2136-2140 頁非專利文獻2 =Spindel 等，Mol. Endocrinol.，1987 年，第 1 卷，第 224-232 頁非專利文獻3 =Holst 等，J. Clin. Oncol.，1989 年，第 7 卷，第 1831-1838 頁非專利文獻4:臨床檢查(日文原文臨床検查)，1995年，第39卷，第981-986頁

發明內容
在專利文獻3記載的方法中，如果在維持檢測靈敏度的同時，能夠進一步減少所 需要的樣品量，則在臨床上能夠削減測定所需的成本，減輕患者的負擔。此外，由樣品保存 引起的測定靈敏度下降更小的測定方法，能夠更加簡便地進行樣品的處理。本發明提供一 種新的ftx)GRP的測定方法，該測定方法中，由樣品保存引起的檢測靈敏度下降小，能夠用 更少量的樣品量進行測定。本發明發現，使用針對ftx)GRP的特定區域的抗體的免疫測定法能夠解決上述課 題，從而完成了以下各發明。(1) 一種測定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述方法使用2種以上的 不同抗體，所述的抗體識別序列編號1所示的胺基酸序列的第47-68位的胺基酸序列所呈 示的抗原表位。(2)如⑴所述的方法，其中，該方法為夾心免疫測定法。(3) 一種識別序列編號1所示的胺基酸序列的第47-68位的胺基酸序列所呈示的 抗原表位的單克隆抗體。(4)如(3)所述的單克隆抗體，其中，該抗體由按照保藏編號FERMP-21308保藏的 雜交瘤(hybridoma)GCY9 產生。
(5)如(3)所述的單克隆抗體，其中，該抗體由按照保藏編號FERMP-21309保藏的 雜交瘤GCY17產生。(6)按照保藏編號FERM P-21308保藏的雜交瘤GCY9。(7)按照保藏編號FERM P-21309保藏的雜交瘤GCY17。(8)如⑴所述的方法，其中，所述的2種以上的不同抗體的至少一種是⑷或 (5)中任一項所述的抗體。(9) 一種用於測定胃泌素釋放肽前體或其降解物的試劑盒，所述試劑盒含有 (3) (5)中任一項所述的抗體。(10)如(9)所述的試劑盒，所述試劑盒是用於癌診斷或用於治療效果監測的試劑
品.ο本發明的方法以在樣品中也能穩定保存的ftx)GRP的降解物為測定對象，除了能 獲得與現有的測定方法相同的檢測靈敏度，還具有採取後的樣品的處理方法不易受到影 響、能夠獲得再現性高的測定值等效果。據此，為了診斷小細胞肺癌等疾病，在採血樣品的 臨床現場，採血後的樣品的處理變得更加容易，ProGRP的測定值沒有因樣品的處理而分散， 能夠獲得更穩定的結果，測定值的可靠性提高。此外，根據臨床表現，在要求追加試驗或需 要再檢查等時，可以使用冷藏保存的樣品而不是冷凍保存的樣品進行測定，從而可削減測 定所需的成本。而且，本發明的方法在維持高檢測靈敏度的同時，能夠減少測定樣品量及縮 短測定時間，在臨床上能夠削減成本，減輕患者的負擔。


圖1是表示單克隆抗體PGCY9對由用多中心肽合成法(multipinp印tide)合成的 8個連續胺基酸序列構成的各多肽的結合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號1中的氨 基酸殘基的編號，縱軸表示吸光度。圖2是表示單克隆抗體PGCY17對由用多中心肽合成法合成的8個連續胺基酸序 列構成的各多肽的結合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號1中的胺基酸殘基的編號， 縱軸表示吸光度。圖3是表示單克隆抗體PGCYM對由用多中心肽合成法合成的8個連續胺基酸序 列構成的各多肽的結合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號1中的胺基酸殘基的編號， 縱軸表示吸光度。圖4是表示單克隆抗體PGCY12對由用多中心肽合成法合成的8個連續胺基酸序 列構成的各多肽的結合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號1中的胺基酸殘基的編號， 縱軸表示吸光度。圖5是表示單克隆抗體PGCY5對由用多中心肽合成法合成的8個連續胺基酸序列 構成的各多肽的結合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號1中的胺基酸殘基的編號，縱 軸表示吸光度。圖6是表示ftx)GRP (31-98)與各種單克隆抗體所識別的抗原表位的位置關係的模 式圖。圖7是表示使用與胺基酸編號第47-68位的部分肽結合的抗體PGCY9與PGCY17 的測定法的標準曲線圖。橫軸表示ftx)GRP的濃度，縱軸表示吸光度。
圖8是表示針對在微量板(microplate)的固相上通過抗小鼠IgG(Fc)抗體結合 的ftx)GRP的各單克隆抗體與生物素化ftx)GRP的反應性的圖。橫軸表示各單克隆抗體，縱 軸表示吸光度。
具體實施例方式本發明是一種使用能夠識別ftx)GRP的第47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表 位的2種以上的不同抗體，通過夾心免疫測定法檢測ftx)GRP或ftx)GRP的降解物的方法，所 述ftx)GRP的降解物具有ftx)GRP的第47-68位的胺基酸殘基。該免疫測定法具有如下特徵 即使在將採取的樣品進行冷藏保存的情況下，其檢測靈敏度也不下降。由此推測這意味著 具有ftx)GRP的第47-68位的胺基酸殘基的ftx)GRP的降解物對樣品中含有的蛋白酶或其他 原因引起的樣品保存中的進一步降解反應比較穩定。本發明的方法中可以使用的抗體為能夠識別ftx)GRP的第47-68位的胺基酸序列 所呈示的抗原表位的抗體，據此能夠與具有ftx)GRP的第47-68位的胺基酸殘基的ftx)GRP 的降解物結合。這種抗體優選為單克隆抗體。本發明的方法中可以使用的抗體，優選為能夠識別ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列中的N末端部分所呈示的抗原表位和C末端部分所呈示的抗原表位的2種以 上的不同單克隆抗體。特別優選使用單克隆抗體PGCY9和PGCY17，所述的單克隆抗體分 別由雜交瘤GCY9和雜交瘤GCY17產生，所述雜交瘤GCY9和雜交瘤GCY17分別以保藏編 號FERM P-21308和FERM P-21309保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保 藏中心。這2種雜交瘤細胞是以利用大腸桿菌生產的重組ftx)GRP的第31-98位的氨基 酸序列構成的多肽(以下表示為ftx)GRP(31-98))作為抗原，由免疫小鼠的抗體產生細胞 (antibody-producingcell)按通常的方法製備的雜交瘤細胞。這2種雜交瘤細胞是通過使 用ftx)GRP (31-98)內部的肽的篩選而進行挑選的、產生識別ftx)GRP的第47-68位的胺基酸 所呈示的抗原表位的抗體的細胞。這樣，本發明中可以使用的抗體可以通過下述方法得到以ft~oGRP(31-98)作為 抗原，由將小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、山羊、綿羊、牛等實驗動物免疫後回收的抗體產生細 胞，按通常的方法製備產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，使用ftx)GRP的第47-68位的胺基酸 殘基構成的多肽(以下表示為ftx)GRPG7-68))可以篩選產生所需抗體的雜交瘤細胞。此 外，也可以將ftx)GRPG7-68)作為抗原使用。另外，上述多肽也可以與甲狀腺球蛋白或匙孔 血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體結合後使用。以小鼠為例來說明對動物進行免疫的方法。將ft~oGRP(31-98)等多肽與弗氏完全 佐劑、TiterMax Gold(CytRx公司)等佐劑以1 1混合，使用互相流通的接頭連接的兩個 注射器，使其反覆通過接頭，或通過超聲波處理等方法製備乳劑。在皮下、皮內、肌肉內、腹 腔內的任一部位或多個部位注入製備的含有抗原的乳劑。第一次免疫結束後，間隔1 4 周，以同樣的方式進行第二次免疫。然後，同樣繼續免疫，直至抗體對血中的ftx)GRP的抗體 效價上升。抗體效價的測定可以按照以下方式進行。以IP g/mL的濃度在PBS中溶解 ProGRP (31-98)，以每孔50 μ L的容量添加到96孔微量滴定板(micro-titer plate)的 各孔中，於4°C下吸附過夜。用含0.05%吐溫20的PBS(PBS-T)將各孔洗滌後，用於測
7定。測定前，也可以用含BSA的PBS等進行封閉。從眼窩靜脈叢、尾靜脈或尾動脈等 處採血，用PBS-T稀釋到30倍後進行離心。將所得上清液用PBS-T進行系列稀釋，塗覆 ProGRP (31-98)，在微量滴定板的各孔中分別添加50 μ L。在室溫下反應30分鐘後，用PBS-T 洗滌，在各孔中分別添加50 μ L辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠IgG溶液，該溶液使 用PBS-T等進行過適當稀釋。再在室溫下反應30分鐘後，添加過氧化氫、鄰苯二胺底物溶 液進行反應30分鐘，添加50 μ L 2Ν H2SO4,使反應停止，測定各孔的吸光度。在免疫過的小鼠中，證實對所給予的抗原的抗體效價充分上升後，取出脾臟，分離 脾臟細胞。使用另外培養的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Agl4等)和聚乙二醇等進行融合。將 融合成功的細胞用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培養基進行選擇培養。7 14天左 右，每隔幾天半量交換培養基並繼續培養後，測定培養上清液的抗體效價。通過有限稀釋法 克隆陽性孔的細胞，得到產生目標抗體的雜交瘤。通過分析上述方法所得抗體的抗原表位，可以獲得識別ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列所呈示的抗原表位的抗體。抗原表位分析可以通過研究抗體對使用多中心肽合成 法合成的ftx)GRP (31-98)的連續8-12個胺基酸序列構成的多肽或ftx)GRP 07-68)的反應 來進行。例如，可以通過在微量滴定板上塗覆用重組體表達的ftx)GRP (47-68)、或用Fmoc法 或Boc法進行化學合成的ftx)GRP (47-68)，使用上述免疫測定法研究抗體對各肽的反應性 來確定。根據使用多中心肽合成法合成的ftx)GRP(31-98)的連續8_12個胺基酸序列構成 的多肽的抗原表位的分析結果，證實本發明特別優選的抗體之一 PGCY9為識別ftx)GRP的第 47-68位的胺基酸所呈示的抗原表位中第55-66位的胺基酸序列所呈示的抗原表位的單克 隆抗體。此外，證實本發明特別優選的另一抗體PGCY17為至少識別第45-57位的胺基酸序 列所呈示的抗原表位的單克隆抗體。本發明中使用的抗體還可以在載體或微量板(microplate)上固相化、或用生物 素等適當的標記試劑進行標記。可以根據各實驗方法的說明書中記載的方法進行固相化或 標記的各種操作，本發明中使用的抗體並不特別需要特殊的操作。本發明的方法為使用上述抗體的夾心免疫測定法，具體地說，是夾心ELISA法。夾 心ELISA法的基本操作可以根據《超高靈敏度免疫測定法》(日文原文超高感度免疫測定 法)(石川栄治，1993年，學會出版力 >々一)或其它各種實驗方法的說明書中記載的方法 進行，本發明的實施中並不特別需要特殊的操作，可以按下述工序進行。S卩，ProGRP和/或其降解物可以通過包括如下工序的測定法檢測(1)使識別 ProGRP的第47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表位的第一抗體與樣品中的ProGRP和/ 或其降解物反應的工序；(2)由該抗體捕捉的ftx)GRP和/或其降解物與不同於⑴的抗體 的、識別ftx)GRP的第47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表位的第二抗體反應的工序；以 及C3)檢測由( 產生的免疫複合物的工序。本發明方法的操作法的例子可以表示如下。將以1 10μ g/mL的濃度溶解於緩 衝液(例如，0. IM碳酸緩衝液(pH 9.6))中的第一抗體的溶液等量添加到微量滴定板的各 孔中，於4°C下培養過夜。用PBS等洗滌用緩衝液將各孔洗滌後，將沒有結合第一抗體的各 孔的內壁用含有酪蛋白酸鈉等適當的蛋白質的緩衝溶液培養數小時後進行封閉。除去封閉 液後，在各孔中添加含有吐溫20等表面活性劑的反應液和樣品。樣品的添加量根據其測定法的靈敏度進行適當變更。在37°C左右的溫度下反應約1小時後，用含有表面活性劑的緩 衝液(例如，含吐溫20的PBS-T)將各孔洗滌，在各孔中添加使用適當的標記試劑標記的第 二抗體，反應幾十分鐘後，將各孔洗滌，使用與標記試劑相適應的方法檢測第二抗體。另外， 上述操作法只不過是個例子，各步驟的具體操作，例如緩衝液、標記試劑、添加量等可以適 當調節。本發明使用單克隆抗體PGCY9和PGCY17這2種單克隆抗體的方法的檢測靈敏度 為2. 5pg/mL，樣品量可以使用25μ L左右。該檢測靈敏度幾乎能夠測定所有健康人血中的 ftx)GRP，這在臨床上有助於削減檢查成本，減輕患者的負擔。本發明除了上述方法以外，還提供用於測定樣品中的ftx)GRP或其降解物的試劑 盒，尤其是通過測定ftx)GRP和/或其降解物進行小細胞肺癌診斷或化學療法監測的診斷藥 試劑盒。該試劑盒含有至少2種識別上述ftx)GRP的第47-68位的胺基酸所呈示的抗原表 位的抗體，其他還可以任意地含有反應緩衝液、二抗稀釋液、ProGRP標準物質、說明書及其 他組成物。作為試劑盒中含有的抗體的優選例，為識別ftx)GRP的第47-68位的胺基酸所呈 示的抗原表位的2種以上的不同抗體，代表例為單克隆抗體PGCY9和單克隆抗體PGCY17。與ftx)GRP和/或其降解物結合的抗體，雖然優選使用只選擇識別ftx)GRP的第 47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表位的抗體，但是，在可以得到再現性高的測定值的範 圍內，測定體系內也可以含有這些抗體以外的抗體。實施例以下列舉實施例對本發明作進一步的說明。實施例1根據專利第3210994號的實施例1記載的方法製備重組體，提純由大腸桿菌表 達的序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽。專利第3210994號的實施例1中，該重 組體記載為GRP (31-98)，正確的是GRP前體(ftx)GRP)的(31-98)部分，因此本文記載為 ProGRP(31-98)。將ft~oGRP(31-98)豬甲狀腺球蛋白(TG)以重量比為1 3結合的抗原蛋白質 (表示為ftx)GRP-TG)使用含0. 15M NaCl的IOOmM磷酸緩衝液(pH 6. 0)稀釋，與等量的 TiterMax 混合，製成 ftx)GRP-TG 懸浮液。將配製的 1^061^(31-98)濃度達 0. 05mg/0. ImL 的該懸浮液按約20天的間隔、在4 6周齡的BALB/c系小鼠的腹腔內給藥4 6次。再 於約4周後，作為加強免疫，用配製的ftx)GRP (31-98)的濃度達0. lmg/0. ImL的生理鹽水給 藥2天。最終加強免疫後第3天，從該免疫動物中無菌性摘除脾臟，用手術剪剪成切片，再 用篩孔將脾臟弄成一個個細胞，用RPMI-1640培養基洗滌3次後，用含8-氮鳥嘌呤的相同 培養基培養數天。將完全去除回復突變體的對數增殖期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0-Agl4 用RPMI-1640培養基洗滌後，將該細胞2. 4 X IO7個和上述脾臟細胞2. 0 X IO8個加入離心管 中混合。將混合的2種細胞以200Xg離心分離5分鐘，除去上清液後，採用HVJ Envelope Cell Fusion Kit (GenomONE-CF，石原產業株式會社)進行細胞融合。將融合的細胞用含有 次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷(以下將3種化合物合起來表示為HAT)、10%胎牛血清(FCS)及 小鼠白介素-6 (R&D Systems)的RPMI-1640培養基稀釋，添加到96孔培養板上培養1 2 周。在培養約1 2周後，進行使用ft~oGRP(31-98)作為抗原的ELISA法，得到雜交瘤，該 雜交瘤產生對ftx)GRP(31-98)具有反應特異性的本發明的單克隆抗體。
關於得到的雜交瘤，通過常用的有限稀釋法，使用ft~oGRP(31-98)進行目標抗體 的產生株的檢索和單一克隆化，最終得到5株雜交瘤細胞，分別命名為GCY9、GCY17、GCY12、 GCYM及GCY5。GCY9和GCY17於2007年6月22日在位於日本國茨城縣筑波市東1 丁目1 番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心保藏(GCY9的保藏 編號FERM P-21308 ；GCY17 的保藏編號FERM P-21309)。另外，GCY9 和 GCY17 於 2008 年 8 月5日分別獲得國際保藏(GCY9的國際保藏編號FERM BP-1099UGCY17的國際保藏編號 FERMBP-10992)。實施例2(1)將通過實施例1記載的方法得到的雜交瘤在含有小鼠白介素-6的無血清培養 基(Hybridoma-SFM，hvitrogen公司)中培養，將產生的單克隆抗體用結合了蛋白質A的 瓊脂糖凝膠柱(Amersham)提純回收。將由各雜交瘤GCY9、GCY17、GCY12、GCYM及GCY5產 生的單克隆抗體分別命名為PGCY9、PGCYl7、PGCYl2、PGCYM及PGCY5。對於PGCY9、PGCY17、 PGCY12、PGCYM及PGCY5的亞型(subtype)，根據使用兔抗小鼠Ig各亞型試劑盒(Zymed公 司)的實驗,表明 PGCY9、PGCY12、PGCY24 和 PGCY5 為 IgGl，PGCY17 為 IgG2a。(2)基於ftx)GRP(31-98)的胺基酸序列，用多中心肽合成法合成每個胺基酸進行 錯位製備的連續8個胺基酸構成的共61種多肽。再在各肽的N末端結合生物素。將各生 物素化多肽溶解於二甲基甲醯胺中，並用PBS稀釋成1 μ g/mL的濃度。在抗生物素蛋白 (avidin)固相化的96孔微量滴定板的各孔中分別添加100 μ L稀釋過的各生物素化多肽溶 液，於4°C培養過夜。用含0. 05%吐溫20的PBS緩衝液(PBS-T)將各孔洗滌後，在各孔中分 別添加100 μ L將各單克隆抗體稀釋成1 μ g/mL的溶液。在室溫下反應30分鐘後，用PBS-T 將各孔洗滌5次，在各孔中分別添加100 μ L辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠IgG抗體 溶液。再在室溫下反應30分鐘後，用PBS-T將各孔洗滌5次，在各孔中分別添加IOOyL底 物溶液(含ang/mL鄰苯二胺、0. 9μ L/mL 30%過氧化氫溶液的0. IM檸檬酸磷酸緩衝液、pH 5.0)，在室溫下反應30分鐘後，分別添加IOOyL 2N硫酸，立即測定492nm處的吸光度。單 克隆抗體PGCY9、PGCY17、PGCYM、PGCY12及PGCY5對ftx)GRP (31-98)內部各肽的反應如圖 1 圖5所示。如圖1所示，證實單克隆抗體PGCY9與ftx)GRP (57_64)的結合非常弱。此外，如 圖2和圖3所示，證實單克隆抗體PGCY17及PGCYM與ftx)GRP(31-98)的胺基酸序列中的 8個連續胺基酸構成的多肽不結合。由此推測，PGCY17及PGCYM不能識別8個連續氨基 酸序列，而能識別比8個長的胺基酸序列構成的多肽所呈示的抗原表位。另一方面，如圖 4所示，證實單克隆抗體PGCY12與ft~oGRP(34-41)結合強，與其前後的ftx)GRP (33-40)及 ProGRP(35-42)結合弱。因此推測，PGCY12能識別ftx)GRP的第34-41位的胺基酸序列所呈 示的抗原表位。此外，證實單克隆抗體PGCY5與ft~oGRP(69-76)和ftx)GRP (70-77)結合強， 與ft~oGRP(71-78)結合，與ft~oGRP(68-75)結合非常弱。因此推測，單克隆抗體PGCT5能識 別ftx)GRP的第69-76位的胺基酸序列和第70-77位的胺基酸序列所呈示的共同的抗原表 位。(3)通過Fmoc法合成表1所示的ftx)GRP (31-98)的部分胺基酸序列構成的多肽， 進行提純。在溶解6M尿素的PBS中，以20 μ g/mL的濃度溶解BSA，在96孔微量滴定板 (NUNC、Maxisorp)的各孔中分別添加100 μ L，在室溫下培養3小時。用PBS將各孔分別洗滌5次，在各孔中分別添加100 μ L用PBS將N-(3- 二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽 酸鹽(EDC)和N-羥基丁二醯亞胺(NHS)分別以lmg/mL溶解後的溶液，在室溫下培養2小 時，將在孔中固定的BSA的羧基活化。用PBS將各孔洗滌3次，將各多肽用0. IM磷酸緩衝 液(pH 6. 0)稀釋成5 μ g/mL的濃度，在96孔微量滴定板的各孔中分別添加100 μ L，於4°C 培養過夜。據此，各多肽通過氨基與固定化的BSA結合。用PBS將各孔洗滌2次後，在各孔中分別添加350 μ L含1 % BSA、2%蔗糖的PBS，在 室溫下培養3小時，然後吸除。在各孔中分別添加100 μ L稀釋成1 μ g/mL濃度的各單克隆 抗體，在室溫下反應60分鐘後，用含0.05%吐溫20的PBS(PBS-T)洗滌5次後，在各孔中分 別添加IOOyL辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠IgG抗體溶液，在室溫下反應20分鐘。 用PBS-T洗滌5次後，在各孔中分別添加100 μ L底物溶液(含ang/mL鄰苯二胺、0. 9 μ L/ mL30%過氧化氫溶液的0. IM檸檬酸磷酸緩衝液、pH 5. 0)，在室溫下反應20分鐘後，在各孔 中分別添加IOOyL 2N硫酸，使反應停止，立即測定492nm處的吸光度。除了本發明的各單 克隆抗體外，同時還研究了專利文獻3中所示的、識別ftx)GRP的40-60位的胺基酸序列構 成的多肽、且與8個連續胺基酸序列構成的多肽不發生反應的單克隆抗體GRP-3D6-2的抗 原表位。其結果如表1所示。表 權利要求
1.一種測定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述方法使用2種以上的不同 抗體，所述的抗體識別序列編號1所示的胺基酸序列的第47-68位的胺基酸序列所呈示的 抗原表位。
2.如權利要求1所述的方法，所述方法為夾心免疫測定法。
3.一種識別序列編號1所示的胺基酸序列的第47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表 位的單克隆抗體。
4.如權利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述抗體由按照保藏編號FERMP-21308保 藏的雜交瘤GCY9產生。
5.如權利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述抗體由按照保藏編號FERMP-21309保 藏的雜交瘤GCY17產生。
6.按照保藏編號FERMP-21308保藏的雜交瘤GCY9。
7.按照保藏編號FERMP-21309保藏的雜交瘤GCY17。
8.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述的2種以上的不同抗體的至少一種是權利 要求4或5中任一項所述的抗體。
9.一種含有權利要求3 5中任一項所述的抗體、並用於測定胃泌素釋放肽前體或其 降解物的試劑盒。
10.如權利要求9所述的試劑盒，所述試劑盒是用於癌診斷或用於治療效果監測的試劑盒。
全文摘要
本發明提供一種不存在測定值分散和樣品處理等操作上的制約等問題的、高靈敏度的新的ProGRP測定方法。特別是，本發明提供一種使用2種以上的不同抗體測定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述的抗體識別序列編號1所示的胺基酸序列的第47-68位的胺基酸序列所呈示的抗原表位。本發明的方法與現有的測定方法相比，能夠以冷藏保存的樣品為對象，在短時間內從更少量的樣品試樣中以更高的檢測靈敏度檢測ProGRP或其降解物。
文檔編號G01N33/574GK102084249SQ20088011172
公開日2011年6月1日 申請日期2008年9月29日 優先權日2007年10月26日
發明者井澤雪路, 青柳克己 申請人:株式會社先端生命科學研究所