腸出血性大腸桿菌的志賀菌毒素家族基因的檢測試劑的製作方法
2024-03-26 07:02:05
專利名稱：腸出血性大腸桿菌的志賀菌毒素家族基因的檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及臨床檢查、公共健康檢查、食物評價和食物中毒檢查中檢測腸出血性大腸桿菌的檢測試劑。
現有技術志賀菌毒素家族(stx)是腸出血性大腸桿菌(EHEC)如病原性大腸桿菌O157產生的烈性毒素。與EHEC感染相關的主要症狀包括水樣稀便，繼之發生嚴重的腹部疼痛和血性便。此外，一些受感染的人發生導致溶血性尿毒症(HUS)和腦病的併發症，已經報導這在最壞情況下導致死亡。
儘管EHEC的血清型非常不同，有超過60種血清型，但是按照檢測頻率最常見的血清型是O157:H7。此外，基於抗原性的不同，stx還被廣義上分為1型(stx1)或2型(stx2)。
儘管O157抗原試驗和其他試驗是檢測和鑑定EHEC的公知方法，但是擴增EHEC基因中和來自所述基因的RNA中存在的特定序列後檢測所述序列的方法在靈敏性、速度和操作的容易性方法是優選的。在恆溫擴增目標核酸的方法在試驗系統的自動化方面是尤其優選的。
發明公開已經報導了檢測和鑑定EHEC的一種方法，其中在相對低的溫度(41℃)特異擴增來自stx1和stx2的RNA(日本特開2002-253257)。在該方法中，使用了一種RNA擴增方法，該方法包括步驟使用來自stx1或stx2的RNA的特定序列作為模板，以及具有與所述特定序列互補的序列的第一引物，和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物，用RNA依賴的DNA聚合酶產生cDNA，從而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物具有這樣的序列，其中RNA聚合酶的啟動子序列被加到引物之一的5』末端，通過核糖核酸酶H降解雙鏈RNA-DNA的RNA，從而產生單鏈DNA，並用DNA依賴的DNA聚合酶使用所述單鏈DNA作為模板產生具有這樣啟動子的雙鏈DNA，所述啟動子能夠轉錄為由所述RNA序列組成的RNA，或轉錄為與所述RNA序列互補的序列，其中所述雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下產生RNA轉錄產物，所述RNA轉錄產物作為隨後用RNA依賴的DNA聚合酶進行cDNA合成的模板。此外，在螢光嵌入染料標記的寡核苷酸存在下實施RNA擴增方法，其中所述寡核苷酸的序列與RNA轉錄產物的序列的至少一部分互補，並且在所述寡核苷酸與所述RNA轉錄產物存在互補結合的情況下，反應液的螢光特徵與沒有複合體形成的情況相比發生改變，從而，可以通過測量反應液的螢光強度進行檢測。
然而，上面提到的方法在靈敏性和速度方面有問題。根據日本特開2002-253257，對於stx2 RNA的最初量為102份拷貝的情況，檢測時間為約17分鐘，這比使用stx1 RNA檢測試劑的檢測時間慢(在約14分鐘檢測stx1 RNA的102份拷貝)(見實施例1)。此外，上面提到的方法的第二引物可能具有基因型中差異導致的鹼基序列錯配，並且認為攜帶具有錯配的基因型的EHEC導致更長的檢測時間或者不能被檢測到(參考
圖1)。
因此，本發明的目的是提供與基因型差異無關的具有更好的速度和特異性的stx2 RNA的檢測試劑。
作為對具有更好的速度和特異性的EHEC stx2 RNA的檢測試劑開發的深入研究的結果，本發明的發明人開發了能夠解決錯配問題(見圖1)和基於不同基因型中沒有改變的位點設計寡核苷酸在約14分鐘檢測102份拷貝的stx2 RNA的最初量的試劑。
本發明涉及用於檢測樣品中存在的腸出血性大腸桿菌的2型志賀菌毒素家族基因(stx2)的檢測試劑，該試劑用於使用RNA擴增方法的檢測法，該方法包括步驟
使用來自stx2的RNA的特定序列作為模板，以及具有與所述特定序列同源的序列的第一引物，和具有與所述特定序列互補的序列的第二引物，用RNA依賴的DNA聚合酶產生cDNA，從而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或者第二引物具有這樣的序列，其中RNA聚合酶的啟動子序列已經被添加到該引物的5』末端；通過核糖核酸酶H降解所述雙鏈RNA-DNA的RNA部分，從而產生單鏈DNA；和使用所述單鏈DNA作為模板用DNA依賴的DNA聚合酶產生具有這樣啟動子的雙鏈DNA，所述啟動子能夠轉錄為由所述RNA特定序列組成的RNA，或轉錄為與所述RNA特定序列互補的序列；其中，雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下產生RNA轉錄產物，所述RNA轉錄產物作為隨後用RNA依賴的DNA聚合酶進行cDNA合成的模板；其中試劑含有，作為第一引物，由SEQ.ID No.1所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸，或者為這樣的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.1所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸中的一個或多個核苷酸被缺失、替換或者添加並且能夠特異結合與該特定序列互補的序列，或者在高嚴格條件下與該由SEQ.ID No.1所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸雜交並且能夠特異結合與該特定序列互補的序列的寡核苷酸；和作為第二引物，由SEQ.ID No.2所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸，或者為這樣的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.2所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸的一個或多個核苷酸被缺失、替換或者添加並且能夠特異結合與該特定序列互補的序列，或者在高嚴格條件下與該由SEQ.ID No.2所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸雜交並且能夠特異結合與該特定序列互補的序列的寡核苷酸。
高嚴格雜交條件指任何雜交條件並且，例如，為下面的實例中所指的條件，由在60mM Tris、17mM氯化鎂、100-150mM氯化鉀和1mM DTT存在下在41℃到44℃的溫度下進行雜交組成。
此外，對於旨在檢測與來自stx2的RNA互補的RNA的情況，具有與上面提到的第一引物互補的序列並且其序列從5』末端到3』末端被顛倒的寡核苷酸應該被用作第一引物，具有與上面提到的第二引物互補的序列並且其序列從5』末端到3』末端被顛倒的寡核苷酸應該被用作第二引物。
優選地，在切割用寡核苷酸的存在下進行前述RNA擴增方法，該切割用寡核苷酸在前述特定序列的5』末端切割前述目標RNA並且具有與所述特定序列的5』末端相鄰並重疊的區域互補的序列。
在一個優選的方面，前述第一引物是SEQ.ID No.1中所示序列的寡核苷酸。
在另一優選的方面，前述第二引物是SEQ.ID No.2中所示序列的寡核苷酸。
在更優選的方面，前述第一引物是SEQ.ID No.1中所示序列的寡核苷酸，並且前述第二引物是SEQ.ID No.2中所示序列的寡核苷酸。
在另一優選的方面，在螢光嵌入染料標記的寡核苷酸存在下進行前述RNA擴增過程，並且通過測量反應液的螢光強度進行EHEC的檢測。這裡，所述寡核苷酸的序列與RNA轉錄產物的序列的至少一部分互補，並且在所述寡核苷酸與所述RNA轉錄產物的互補結合存在的情況下，反應液的螢光特徵與沒有複合體形成的情況相比發生改變。
優選地，前述螢光嵌入染料標記的寡核苷酸由SEQ.ID No.3中所示至少10個相鄰鹼基組成。
使用本申請發明的檢測試劑的檢測方法用於檢測腸出血性大腸桿菌的stx2 RNA，而與基因型的差異無關，該檢測方法比現有技術中的方法(日本特開2002-253257)更快並且有更高的特異性。
附圖簡述圖1顯示了實施例1和實施例2中所用檢測stx2 RNA的每一寡核苷酸的結合位點以及RNA擴增區和三種stx2基因的外圍鹼基序列(見Ito等，Microbial Pathogenesis 8，47-60(1990)和GenBank No.X07865)。鹼基序列中用「-」指出的位點表示與GeneBank No.X07865的鹼基序列相同的位點。本申請的發明中所用的所有寡核苷酸都基於基因型之間沒有改變的位點設計。
圖2(A)顯示了隨著反應時間和RNA產物的增加(最初stx1 RNA量從102個拷貝/實施例1中進行的試驗到105個拷貝/實施例1中進行的試驗)螢光強度的比率圖(stx1的螢光強度圖)，(B)顯示了隨著反應時間和RNA產物的增加(最初stx2 RNA量從102個拷貝/實施例1中進行的試驗到105個拷貝/實施例1中進行的試驗)螢光強度的比率圖(stx2的螢光強度圖)。「Nega」指其中使用稀釋劑代替RNA樣品的樣品。在約14分鐘檢測到102個stx1 RNA拷貝，而約17分鐘檢測到102個stx2 RNA拷貝，並且指出stx2 RNA的檢測時間比stx1 RNA的檢測時間長。
圖3(C)顯示了在最初RNA量的對數值和從102份拷貝/在實施例1中進行的試驗到105份拷貝/實施例1中進行的試驗的最初stx1 RNA量的上升時間之間得到的校正曲線(stx1的校正曲線)，和(D)顯示了在最初RNA量的對數值和從102份拷貝/在實施例1中進行的試驗到105份拷貝/實施例1中進行的試驗的最初stx2 RNA量的上升時間之間得到的校正曲線(stx2的校正曲線)。
圖4(A)顯示了隨著反應時間和RNA的產生(最初stx2 RNA量為從102份拷貝/在實施例2中進行的試驗到105份拷貝/在實施例2中進行的試驗)螢光強度比率圖(stx2的螢光強度圖)，和(B)顯示了最初RNA量的對數值和上升時間之間得到的校正曲線(stx2的校正曲線)。「Nega」指其中用稀釋劑代替RNA樣品的樣品。在約14分鐘檢測到stx2 RNA的102份拷貝，表明與現有技術的方法相比更短的檢測時間(日本特開2002-253257)。
下面提供了本發明的詳細說明。
實施本發明的最佳模式下面提供了本發明的詳細說明。
在本發明中，儘管序列表中每個所列鹼基序列的全長可分別用於第一和第二引物，但是由於約10個鹼基已足夠特異結合到特定核酸序列等，所以也可以使用由每一序列中至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸的組合。
本發明的擴增方法包括NASBA方法、3SR方法和TRC方法(見例如，日本特開2000-014400)，本發明的擴增方法通過反轉錄酶和RNA聚合酶的協同作用擴增stx2 RNA序列(通過在反轉錄酶和RNA聚合酶協同作用的條件下使它們反應)。這裡，儘管對溫度沒有特定限制，但是優選35到50℃。
在本申請的前述發明的一個方面，目標RNA必須在特定序列的5』末端被切割。以這種方式切割該目標RNA的一個優選方法由通過加入具有與和該特定序列的5』末端相鄰並重疊的區域互補的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)，用核糖核酸酶H等切割目標RNA組成。這裡，重疊鹼基的數目尤其優選為5或6個鹼基。在所述切割用寡核苷酸中，3』末端羥基優選被化學修飾並且，例如，可以被胺化，以抑制從3』末端的延伸反應。
儘管在前述核酸擴增方法中得到的擴增產物可以用公知的核酸檢測方法檢測，但是在該方法的一個優選方面，優選在嵌入螢光染料標記的寡核苷酸存在下進行前述核酸擴增，然後測定反應液的螢光特徵的變化。在所述寡核苷酸中，由於嵌入螢光染料通過銜接子結合該寡核苷酸中的磷原子，與目標核酸形成雙鏈的嵌合部分(互補核酸)而嵌入到雙鏈部分，導致螢光特徵的改變，從而導致不需要分離並分析的特徵(Ishiguro，T.等(1996)Nucleic Acid Res.24(24)4992-4997)。
被所述寡核苷酸結合的序列可以是對stx2 RNA特異的任何序列，雖然對其沒有特定限制，但是優選由SEQ.ID No.3中所示序列中至少10個連續鹼基組成的序列或其互補序列。此外，所述寡核苷酸的3』末端的羥基優選被化學修飾以抑制通過使用該寡核苷酸作為引物可能發生的延伸反應，其一個實例是日本特開2000-316587中描述的方法。
結果，可以在單個試管中，在恆溫下一步快速並具有高度特異性地擴增和檢測EHEC的stx2 RNA，從而方便了自動化應用。
實施例儘管下面通過實施例提供了對申請的發明的更詳細說明，但是本發明不被這些實施例所限制。
實施例1使用日本特開2002-253257中描述的寡核苷酸的組合檢測了不同拷貝數的腸出血性大腸桿菌(EHEC)stx1 RNA和stx2 RNA。
(1)將含有EHEC stx1 RNA的鹼基編號228到1558(RNA的鹼基編號根據Calderwoods等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(13)，4364-4368(1997)，GeneBank No.M16625)的標準RNA樣品(1337個鹼基)通過260nm處紫外吸收定量，然後用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制劑)(TakaraBio))從105個拷貝/5μL稀釋到102個拷貝/5μL。僅僅稀釋劑用於對照組(陰性對照)。
(2)將含有EHEC stx2 RNA的鹼基編號125到1479(RNA的鹼基編號根據GeneBank No.X07865)的標準RNA樣品(1361個鹼基)通過260nm處紫外吸收定量，然後用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制劑)(Takara Bio))從105個拷貝/5μL稀釋到102個拷貝/5μL。僅僅稀釋劑用於對照組(陰性對照)。
(3)具有下面指出的組分的20μL反應液置於0.5mL PCR管(GeneAmp薄壁反應管，Applied Biosystems)，然後向其中加入5μL前述RNA樣品。此外，製備溶液製得了第一引物、第二引物、切割用寡核苷酸和用嵌入染料標記的寡核苷酸的組合如表1中所示的組合。
反應液的組分(濃度以30μL最終反應液體積中的濃度顯示)60mM Tris-HCl緩衝液(pH8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀(對於stx1)或150mM氯化鉀(對於stx2)
6U RNase抑制劑1mM DTT0.25mM每一種dATP、dCTP、dGTP和dTTP3.6mM ITP3.0mM每一種ATP、CTP、GTP和UTP0.16μM切割用寡核苷酸1.0μM第二引物1.0μM第一引物25nM嵌入染料標記的寡核苷酸13％DMSO用於調節體積的蒸餾水(3)在44℃(對stx1)或41℃(對stx2)孵育前述反應液5分鐘後，加入具有下面指出的組分並在44℃(對stx1)或41℃(對stx2)預熱2分鐘的5μL酶溶液。
酶溶液的組分(值以30μL最終反應液體積中的濃度顯示)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)6.4U AMV反轉錄酶(LifeScience)用於調節體積的蒸餾水(4)隨後，使用具有溫度控制功能並且能夠直接測量PCR管的螢光分光光度計，在激發波長470nm和螢光波長520nm下，隨時間測量每個PCR管中的反應液(這些反應液在44℃(對stx1)或41℃(對stx2)被孵育)。
通過將酶的加入時間設定為0分鐘，stx1和stx2樣品的螢光強度比率(預定時間的螢光強度值+背景螢光強度值)的隨時間的變化在圖2(A)和2(B)中顯示。此外，在圖3(C)和3(D)中顯示了stx1和stx2樣品的對最初RNA量和「上升時間」(螢光比率增加到陰性對照樣品的平均值加上3個標準誤的和的1.2倍所需要的時間)之間的關系所得結果。此外，對於tx1和tx2，最初的RNA量為102個拷貝/試驗到105個拷貝/試驗。
根據圖2，在約14分鐘檢測到stx1 RNA的102個拷貝，在約17分鐘檢測到stx2 RNA的102個拷貝。根據這些結果，日本特開2002-253257中描述的使用寡核苷酸組合檢測stx2 RNA表明了與用於檢測stx1 RNA的那些寡核苷酸組合相比更慢的檢測時間。
表1
表1顯示了用於實驗體系的第一引物、第二引物、切割用寡核苷酸和用嵌入染料標記的寡核苷酸的組合。在圖1中顯示了檢測stx2所用的每一種寡核苷酸組合相應於EHEC的stx2 RNA中寡核苷酸的位點。切割用寡核苷酸的鹼基序列的3』末端羥基被胺化。從第一引物的鹼基序列的5』末端開始的1位「A」到22位「A」的區域是T7啟動子區，隨後的從23位「G」到28位「A」的區域是增強子序列。用嵌入染料標記的寡核苷酸在YO-VT1-S-G(SEQ.ID No.9)的5』末端的6位「C」和7位「G」之間，和在YO-VT2-S-G(SEQ.ID No.3)的5』末端的12位「T」和13位「A」之間的磷原子處用嵌入染料標記，3』末端的羥基用乙二醇基團修飾。
切割用寡核苷酸VT1-5S(SEQ.ID No.4)VT2-5S(SEQ.ID No.5)第一引物VT1-5F(SEQ.ID No.6)VT2-5F(SEQ.ID No.7)第二引物VT1-6R(SEQ.ID No.8)
VT2-7R(SEQ.ID No.2)嵌入染料標記的寡核苷酸YO-VT1-S-G(SEQ.ID No.9)YO-VT2-S-G(SEQ.ID No.3)實施例2使用本申請發明的寡核苷酸的組合檢測不同最初拷貝數的EHEC的stx2 RNA。
(1)類似於實施例1，用RNA稀釋劑(10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制劑)(Takara Bio))將EHEC的stx2 RNA從105個拷貝/5μL稀釋到102個拷貝/5μL。僅僅稀釋劑用於對照組(陰性對照)。
(2)將具有下面指出的組分的20μL反應液置於PCR管(體積0.5mL，GeneAmp薄壁反應管，Applied Biosystems)中，然後向其中加入5μL前述RNA樣品。
反應液的組分(濃度以30μL的最終反應液體積中的濃度顯示)60mM Tris-HCl緩衝液(pH8.6)18mM氯化鎂100mM氯化鉀6U RNase抑制劑1mM DTT0.25mM每一種dATP、dCTP、dGTP和dTTP3.6mM ITP3.0mM每一種ATP、CTP、GTP和UTP0.16μM切割用寡核苷酸(VT2-12S，SEQ.ID No.10；其3』末端羥基被胺化)1.0μM第一引物(VR2-12F，SEQ.ID No.11)1.0μM第二引物(VT2-7R，SEQ.ID No.2)25nM嵌入染料標記的寡核苷酸(YO-VT2-S-G，SEQ.ID No.3，在5』末端的12位「T」和13位「A」之間的磷原子處用嵌入螢光染料標記，並且其3』末端的羥基被乙二醇基團標記。)13％DMSO用於調節體積的蒸餾水(3)將前述反應液在43℃孵育5分鐘後，加入具有下面指出的組分並在43℃預熱2分鐘的酶溶液。
酶溶液的組分(值以30μL最終反應液體積中的濃度顯示)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)6.4U AMV反轉錄酶(LifeScience)用於調節體積的蒸餾水(4)隨後，使用具有溫度控制功能並且能夠直接測量PCR管的螢光分光光度計，在激發波長470nm和螢光波長520nm下，於43℃孵育時隨時間測量每個PCR管中的反應液。
通過將酶的加入時間設定為0分鐘，樣品的螢光強度比率(預定時間的螢光強度值+背景螢光強度值)的隨時間的變化在圖4(A)中顯示。此外，在圖4(B)中顯示了從最初RNA量和「上升時間」(螢光比率增加到陰性對照樣品的平均值加上3個標準誤的和的1.2倍所需要的時間)之間的關系所得結果。此外，最初的RNA量為102個拷貝/試驗到105個拷貝/試驗。
根據圖4，在約14分鐘檢測到102個拷貝，表明檢測比現有技術的方法更快(日本特開2002-253257和實施例1)。此外，由於本申請的發明中所用的所有寡核苷酸都基於基因型之間沒有改變的位點設計(見圖1)，所以認為本申請發明的檢測方法在特異性方面也優於現有技術(日本特開2002-253257)的方法。
工業可應用性如上面已經解釋的，本申請的發明的檢測方法可用於檢測腸出血性大腸桿菌的stx2 RNA，而與基因型的差異無關，比現有技術(日本特開2002-253257)中的方法更快且具有更高特異性。
本申請的發明的寡核苷酸不限於序列表中所列的鹼基序列(具有20到23個鹼基)，而是可以是由這些序列中至少10個相鄰鹼基組成的核苷酸。這是因為很明顯約10個鹼基的鹼基序列在相對低溫(優選43℃)條件下足以保證對引物或探針的目標核酸的特異性。
本領域技術人員將明白儘管將本發明與特定實施方案和實施例一起描述，但是本發明不一定被如此限制並且可以得到與這些實施方案、實施例和用途相偏離但不脫離本申請的發明範圍的多種其他實施方案、實施例、用途、修改方案。
序列表110東曹株式會社120腸出血性大腸桿菌的志賀菌毒素家族基因的檢測試劑130R003150JP 2004-0269961512004-02-0316011210121123212DNA213人工序列220
223VT2-12F-T74001ataccactct gcaacgtgtc gca23210221120212DNA213人工序列220
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220
223YO-VT2-S-G4003ttaacgccag atatgatgaa20210421139212DNA213人工序列220
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223YO-VT1-S-G
4009tgtaacgtgg tatagctact202101021124212DNA213人工序列220
223VT2-12S40010tggtataact gctgtccgtt gtca 242101121151212DNA213人工序列220
223VT2-12F40011aattctaata cgactcacta tagggagaat accactctgc aacgtgtcgc a 5權利要求
1.用於檢測樣品中存在的腸出血性大腸桿菌的2型志賀菌毒素家族基因(stx2)的檢測試劑，該試劑用於使用RNA擴增過程的檢測方法，所述檢測方法包括步驟使用來自stx2的RNA的特定序列作為模板，以及具有與所述特定序列同源的序列的第一引物，和具有與所述特定序列互補的序列的第二引物，用RNA依賴的DNA聚合酶產生cDNA，從而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或者第二引物具有這樣的序列，其中RNA聚合酶的啟動子序列已經被添加到該引物的5』末端；通過核糖核酸酶H降解所述雙鏈RNA-DNA的RNA部分，從而產生單鏈DNA；和使用所述單鏈DNA作為模板用DNA依賴的DNA聚合酶產生具有所述啟動子的雙鏈DNA，其中所述啟動子能夠轉錄為由所述RNA特定序列組成的RNA，或轉錄為與所述RNA特定序列互補的序列；其中，雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下產生RNA轉錄產物，所述RNA轉錄產物作為隨後用RNA依賴的DNA聚合酶進行cDNA合成的模板；該試劑包含第一引物和第二引物，其中第一引物為由SEQ.ID No.1所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸，或者為這樣的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.1所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸中的一個或多個核苷酸被缺失、替換或者添加並且能夠特異結合與該特定序列互補的序列；第二引物為由SEQ.ID No.2所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸，或者為這樣的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.2所示序列的至少10個相鄰鹼基組成的寡核苷酸中的一個或多個核苷酸被缺失、替換或者添加並且能夠特異結合所述特定序列。
2.根據權利要求1的檢測試劑，其中第一引物為由SEQ.ID No.1中所示序列組成的寡核苷酸。
3.根據權利要求1的檢測試劑，其中第二引物為由SEQ.ID No.2中所示序列組成的寡核苷酸。
4.根據權利要求1的檢測試劑，其中第一引物為由SEQ.ID No.1中所示序列組成的寡核苷酸，並且第二引物為由SEQ.ID No.2中所示序列組成的寡核苷酸。
5.根據權利要求1到4任一項的檢測試劑，其中在螢光嵌入染料標記的寡核苷酸存在下進行所述RNA擴增過程，並且通過測定反應液的螢光強度檢測腸出血性大腸桿菌；其中所述寡核苷酸的序列與RNA轉錄產物的序列的至少一部分互補，並且在所述寡核苷酸與所述RNA轉錄產物存在互補結合的情況下，反應液的螢光特徵與沒有複合體形成的情況相比發生改變。
6.權利要求5的檢測試劑，其中嵌入螢光染料標記的寡核苷酸由SEQ.ID No.3中所示序列的至少10個相鄰鹼基組成。
全文摘要
本發明提供了優選用於腸出血性大腸桿菌(EHEC)的2型志賀菌毒素家族基因(stx)的快速和特異性基因檢測試劑的寡核苷酸的組合。更具體地，本發明提供了用於檢測EHEC的stx2 RNA的方法，所述方法通過使用具有與EHEC的stx2基因特異的鹼基序列同源或互補的並且位於基因型之間無變化的位點之間的序列引物以及結合stx2 RNA的特定位點的寡核苷酸而僅特異擴增stx2 RNA。
文檔編號C12Q1/68GK1661112SQ20051000164
公開日2005年8月31日 申請日期2005年2月3日 優先權日2004年2月3日
發明者益田昇佳, 保川清, 堀江隆一 申請人:東曹株式會社