用於柑橘潰瘍病菌檢測的引物對及檢測方法

2024-04-02 17:15:05 1

專利名稱：用於柑橘潰瘍病菌檢測的引物對及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及柑橘潰瘍病菌檢測用引物和檢測方法。
背景技術：
柑橘潰瘍病是由柑桔潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv. Citri)感染所致的
重要的檢疫性病害，為國內外檢疫對象，嚴重影響柑桔安全生產和對外貿易，已被我國國家
質檢總局列入2007年公布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。 該病菌在葉、枝梢及果實的病斑中越冬，翌年春條件適宜時從病部溢出，借風雨、
昆蟲傳播，經寄主的氣孔，皮孔和傷口侵入。使葉片、嫩梢和果實發病，目前還沒有一種有效
根除該病菌的方法。我國多數甜橙和柚類產區此病有不同程度發生，在經濟上造成損失最
大的是柑橘。 柑橘潰瘍病的檢疫目前大多以植株發病症狀的觀察為主，在一般情況下完全可憑 肉眼判斷，但許多抗病或非敏感品種缺乏明顯症狀，易與其他病害混淆，同時由於黃單胞菌 的種類及變種繁多，針對柑桔潰瘍病菌的生化鑑定十分繁雜和困難。目前國內外針對柑 橘潰瘍病菌的檢測技術研究基本建立在常規PCR和實時螢光PCR的基礎上，王中康等和 H. D. Coletta-Filho設計了柑橘潰瘍病菌的檢測引物並採用常規PCR方法對該病菌進行了 檢測，Vessela Mavrodieva等應用實時螢光PCR方法對柑橘潰瘍病菌進行了檢測方面的研 允。 雙重PCR技術可針對兩個不同區域的DNA序列進行檢測，大大提高DNA分子檢測 的精準度，達到提高檢出率的目的。變性高效液相色譜(DHPLC)技術是通過將待測的PCR 核酸片段在緩衝液攜帶下流過專利的DNA分離柱，利用緩衝液的不同梯度變化，實現對不 同大小核酸片段的分離和分析，由紫外檢測被分離的DNA樣品；並在部分變性的柱溫條件 下通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間不同的原理，檢測分析DNA位點差異和突變，對 結果進行更靈敏的分析和比對。目前尚沒有採用雙重PCR結合高效變性液相色譜(doublx PCR-DHPLC)的技術對柑橘潰瘍病進行快速準確檢測的研究報導。

發明內容
本發明目的在於提供用於柑橘潰瘍病菌雙重PCR-DHPLC檢測的引物和方法。
本發明通過已報導的柑橘潰瘍病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri 0PM-12SCAR fragment區域序列(gb IAF312370. 1)設計了用於本發明的引物對SEQ ID NO. 1 和2，並結合Coletta-Filho等報導的引物SEQ ID NO. 3和4對進行雙重PCR-DHPLC方法檢 測柑橘潰瘍病菌，所述的兩對由正向和反向引物組成的引物對，其核苷酸序列分別為
SEQ ID NO. 1 :5' -ACGCTCGATCTGCACCTATT—3，；
SEQ ID NO. 2 :5' -CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3，；
SEQ ID NO. 3 :5' -CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3';
SEQ ID NO. 4 :5' -AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3，。
本發明還給出了應用上述引物的雙重PCR-DHPLC方法，其以細菌DNA為模板，進行 雙重PCR擴增，擴增後的PCR產物直接進行DHPLC分析。 其反應體系為10 X PCR buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgC12(25,l/L)2iiL，10iimol/L弓l物各l.OiiL， Taq DNA polymerase (2U/ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii L， DNA模板5 y L，滅菌超純水補足至25 y L。 其中，上述反應條件可以是96。C預變性5min ;96。C變性30s， 63。C退火30s， 72°C 延伸30s，循環反應30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析條件設定為進樣量5 ii L，柱溫50°C ，選擇全片段檢測程序進行檢測， 流速0. 9mL/min。 本發明還建立了進一步對雙重PCR-DHPLC分析得到結果陽性的PCR產物進行鑑定 的DHPLC分子鑑定體系和分子標本。即以設計的引物SEQ ID NO. 1和2擴增柑橘潰瘍病菌 菌株DNA的PCR產物作為PCR-DHPLC鑑定方法的標記物。未知擴增產物通過與該標記物進 行半變性DHPLC分析可以對未知菌進行柑橘潰瘍病菌的鑑定。DHPLC檢測條件為設定片 段大小為236bp，每次進樣5 ii L，檢測溫度Tm = 65°C ，以流速0. 9mL/min進行分析。
對於雙重PCR-DHPLC而言，選擇適當的引物是分析方法靈敏度和準確度的保障。
本發明還提供含有所述弓I物的試劑盒。 進一步，本發明提供的試劑盒中還有引物SEQ ID NO. 1或/和2編碼的核酸分子。
本領域技術人員熟知，SEQ ID NO. 1或/和2中個別鹼基的變化是可以容忍的。 本發明設計用於檢測柑橘潰瘍病菌的引物特異性好，檢測靈敏度高，本發明的檢
測方法準確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有柑橘潰瘍病菌，為進出口安
全提供了保證。


圖1雙重PCR-DHPLC檢測柑橘潰瘍病菌DNA結果；
圖2本發明方法靈敏度檢測結果； 圖3引物SEQ ID NO. 1和2擴增柑橘潰瘍病菌DNA片段DHPLC半變性檢測。
具體實施例方式
下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。 實施例1 引物的設計和合成*艮據矛艮道的樹橘饋嫁病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri 0PM—12 SCARfragment區域序列(gb | AF312370. l)，設計了引物序列為
SEQ ID NO. l(正向):5， -ACGCTCGATCTGCACCTATT—3，;
SEQ ID NO. 2(反向):5， -CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3，。
根據報導的引物，引物序列為 SEQ ID NO. 3(正向):5， -CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3，;
SEQ ID NO. 4(反向)5， -AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3，。
實施例2
菌體的收集 平板上生長的菌落接種環直接挑取菌落至少5個至1. 5mL離心管中，加入lmL滅 菌水充分振蕩，8000g離心3min，棄上清，再向管中加入lmL滅菌水，重複三次，取沉澱提取 DNA，進行雙重PCR-DHPLC檢測。 柑橘葉片或材料用6mm打孔器在柑橘葉片上打取小孔50片，有病斑材料打取病
斑部分，或取有病症組織材料約lg加入lmL滅菌蒸餾水充分振蕩洗滌，取洗滌液8000g離
心5min，棄去上清，取沉澱提取DNA，進行雙重PCR-DHPLC檢測。 實施例3 細菌DNA的提取
1)在沉澱中加入TE緩衝液600 ii L， 10% SDS溶液30 y L， 20mg/mL蛋白酶K15 y L，
混勻，37t:水浴孵育lh。 2)加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24 : l)，混勻。10000g離心5min，將上清液
移至一個新離心管中。 3)加入等體積酚-三氯甲烷-異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻，10000g離心5min，將
上清液移至一新離心管。 4)加入O. 6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，-2(TC沉澱lh， 10000g離心5min，棄上清。
5)加入lmL70X乙醇洗滌沉澱，8000g離心，棄上清，晾乾。
6)加入50 ii LTE緩衝液溶解DNA沉澱，-2(rC長期保存備用。
實施例4 雙重PCR-DHPLC檢測方法的建立 本方法選擇了 5株不同來源的柑橘潰瘍病菌菌株作為陽性對照，同時採用了柑橘
葉片中分離的部分微生物、幾種常見並與柑橘潰瘍病菌近緣的植物病原菌及部分其它植物
病原菌做為參試菌株進行比較分析。供試菌株具體情況如表1。 表1供試菌及其來源菌株編號菌種名稱來源
Al中國檢驗檢疫科學研究院
A2X(3"//z。;w。"as axoMopocfo pv. c/W中國檢驗檢疫科學研究院
A3X朋Aootowos axoMopocifo pv. c"n'重慶大學
A4XaW/zow owas axoMO/W(fc pv,重慶大學
A5A-a"論。附cwas axo"qpo(sfo pv. c"W湖南農業大學
CK1自然界柑橘葉片中分離
CK2Jf朋決oOTOwas spp.自然界柑橘葉片中分離
CK3屍wwc cwo"as spp.自然界柑橘葉片中分離
CK4 Pcwtoea spp.自然界柑橘葉片中分離
CK5ATCC 11662
CK6CGMCC 1.1813
CK7/"■sewrfoTMOMas avewae pv. paniciCGMCC 1.1726
CK8CGMCC1. 1781
CK9XaW/zomowaw cawpeWWs pv. /jo/"'co/a.CGMCC1. 1530
CK10NCPPB 2274
CK11Xa滅,owas o，ae pv. Oyza^NCPPB 2446
CK12Jfaw決OOTonas or;^zae pv. O 7zZco/aNCPPB 1632
CK13Jc/ctovorax ave"ae subsp.c"ra/Zz'NCPPB 4207
CK14屍a",oeasubsp. Wevrart/z'ATCC 29227
CK15NCPPB 1269
CK16ATCC 15580
CK17ATCC 10200 對上述菌株進行DNA提取後，應用下述反應體系和條件進行雙重PCR檢測研究。所 使用PCR儀器為Biometra公司產品。 反應體系10XPCR buffer 2. 5 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25mmol/ L) 2 ii L， 10 ii mol/L弓|物各1. 0 ii L， Taq DNA polymerase (2U/ ii L) 1. 0 ii L， lng/ ii L 10ng/ ii L， DNA模板5 ii L，滅菌超純水補足至25 y L。 反應條件96。C預變性5min ;96。C變性30s，63。C退火30s，72。C延伸30s，循環反 應30次；72。C延伸5min。 DHPLC分析條件設定為進樣量5 y L，柱溫50°C ，選擇全片段檢測程序進行檢測， 流速0. 9mL/min。 將PCR產物放入DHPLC進樣室，洗脫液由緩衝液A(O. lmol/L三乙胺乙醯鹽)和緩 衝液B(O. lmol/L三乙胺乙醯鹽和25%乙腈)組成，設置進樣量5 y L，柱溫50°C ，選擇全片 段檢測程序進行檢測，流速0. 9mL/min，系統自動按照線性遞增的方式，以流速0. 9mL/min 的流速將DNAS印柱上的DNA分子洗脫下來，波長260nm處讀取吸光值，經系統自動處理後， 形成DHPLC峰型圖譜，供分析鑑定。
特異性檢測 採用提取得到的柑橘潰瘍病菌陽性菌株DNA和其它參試菌株DNA進行檢測，用水
作為對照進行擴增。 試驗結果 5株柑橘潰瘍病菌均擴增出明顯的陽性峰，見圖1。其它參試菌株DNA均無陽性信 號。
6
靈敏度檢測 接種柑橘潰瘍病菌於100ml PSA液體培養基中，2『C震蕩培養24h，用平板計數法 對各菌濃度進行測定，並將培養液用生理鹽水製成2X 105、2X 104、2X 103、2X 102、2X 101 6 個稀釋梯度。提取菌液DNA，並進行PCR-DHPLC分析。 試驗結果如圖2，利用本方法能有效地從含有2X102CFU/mL的柑橘潰瘍病菌的菌
液中檢測出該病原菌。
實施例5 PCR-DHPLC分子標準體系的建立 通過鑑定5株柑橘潰瘍病菌DNA擴增產物序列的同源性是否一致，以期建立統一 的分子標本和分子標準體系。 採用DHPLC對自行設計的引物對擴增得到的PCR產物間進行了序列半變性檢測 將每兩種同數量級濃度的PCR產物相互間按照1 : l的比例混合，將混合產物及單一PCR產 物在PCR儀上進行以下變性-復性過程95t:起始變性5min，94. 5。C變性20s，以後每20s — 個循環降低0. 5t:，緩慢降溫到25°C，以形成同源或異源雙鏈DNA分子混合物。將降溫處理 後的PCR產物放入DHPLC進樣室，輸入被檢測片段序列，設定每次進樣5ii L。檢測溫度以該 序列片段的解鏈溫度(Tm = 64. 9°C )為參照，分別選擇柱溫為65。C，設定片段大小236bp， 以流速0. 9mL/min，進行DHPLC分析。 通過變性並緩慢復性處理的PCR混合產物，進行半變性DHPLC分析結果為引物 SEQ ID NO. 1和2擴增柑橘潰瘍病菌A1-A5DNA的PCR混合產物在4. 6min (圖3)左右均只 出現一個明顯的吸收峰，結果與相同處理後的單一PCR產物結果一致。試驗證明通過引物 SEQ ID NO. 1和2進行PCR擴增後，各柑橘潰瘍病菌DNA的PCR產物片段序列一致，同源性 高，無突變位點。 因引物SEQ ID NO. 1和2擴增5株菌株的PCR產物序列均一致，可以建立起以引 物SEQ ID NO. 1和2擴增Al-A5中任意一株菌株DNA的PCR產物作為PCR-DHPLC鑑定方法 的標記物。將未知的片段大小一致或相近的PCR產物與分子標本進行變性並緩慢復性處理 後，進行DHPLC半變性分析。DHPLC鑑定條件為設定片段大小為236bp，每次進樣5 y L。檢 測溫度Tm = 65°C ，以流速0. 9mL/min，進行DHPLC分析。結果出現單一的峰型且其它峰型 正常情況下，可判斷為柑橘潰瘍病菌。
序列表 〈110〉湖南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
〈120〉用於柑橘潰瘍病菌檢測的引物對及檢測方法
〈130>PLH091016
〈140〉
〈141〉
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>20
〈212>DNA
7
〈213〉人工序列 〈400〉1 acgctcgatc tgcacctatt 20 2 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ccaacgagtc tcaagcatca 20 〈210>3 〈211>24 〈212>DNA 人工序列 〈400>3 cgccatcccc accaccacca cgac 24 〈210>4 24 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 aaccgctcaa tgccatccac ttca 2權利要求
用於柑橘潰瘍病菌檢測的引物，其核苷酸序列為SEQ ID NO.15』-ACGCTCGATCTGCACCTATT-3』；SEQ ID NO.25』-CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3』；SEQ ID NO.35』-CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3』；SEQ ID NO.45』-AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3』。
2. —種由SEQ ID NO. 1或2編碼的核酸分子。
3. —種檢測柑橘潰瘍病菌的方法，該方法以柑橘潰瘍病菌的DNA為模版，利用權利要 求1所述的引物進行雙重PCR擴增，反應結束後應用DHPLC進行結果分析和判定。
4 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，雙重PCR的反應過程中的退火溫度為63°C。
5. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，DHPLC檢測過程中，檢測片段設定大小為 236bp。
6. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，DHPLC判定過程中，應用權利要求2中的核 酸分子作為分子標本並建立分子標準體系進行柑橘潰瘍病菌的判定，檢測柱溫為50°C。
7. 含有權利要求1所述引物的試劑盒。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其還包括權利要求2所述的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及柑橘潰瘍病菌檢測用引物和檢測方法。本發明目的在於提供用於柑橘潰瘍病菌雙重PCR-DHPLC檢測的引物和方法。本發明設計用於檢測柑橘潰瘍病菌的引物特異性好，檢測靈敏度高，本發明的檢測方法準確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有柑橘潰瘍病菌，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101712983SQ200910044688
公開日2010年5月26日 申請日期2009年11月4日 優先權日2009年11月4日
發明者左靜, 朱金國, 王象賢, 莫瑾, 陳小帆 申請人:中華人民共和國湖南出入境檢驗檢疫局