一種用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒及檢測方法
2024-03-30 17:04:05
專利名稱：：一種用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：大豆北方莖潰瘍病菌Di即orthephaseolorum曹.caulivora(DPC)、大豆南方莖饋嫁病菌Diaporthephaseolorumvar.meridionalis(DPM)與近似禾中大豆擬蓬點禾中腐病菌Phomopsislongicolla(PL)在形態上很相似，經常在大豆上造成複合侵然，引起間座殼/擬莖點綜合症，是大豆生產上的毀滅性病害，能導致生長期和成熟期的大豆成片死亡，曾在二十世紀四十年代晚期和五十年代早期使美國中西部的大豆產量損失嚴重，1994年導致世界大豆產量損失約為200多萬噸；二十世紀八十年代莖潰瘍又在南美大發生，導致感病大豆品種的產量損失高達80%，1983年在美國東南部造成的損失為三千七百萬美元，1996年至2006年美國因潰瘍病損失大豆155萬噸，1998年阿根廷、玻利維亞、巴西、加拿大、義大利、巴拉圭、美國因莖潰瘍病共損失大豆19.1萬噸。大豆擬莖點種腐病菌能導致大豆根腐並影響大豆種子質量，造成大豆品質下降及種子萌發率降低，嚴重時能導致90%的種子不能萌發，經濟影響很大。目前這些病菌主要分布在美國、阿根廷、巴西、加拿大、義大利、前南斯拉夫、克羅埃西亞、巴拉圭、歐洲等地。這些病菌均可為害種子，並且以菌絲和子囊殼、分生孢子器的形式在大豆植株殘體上越冬，抗逆性很強，遠距離傳播主要通過大豆原糧貿易中的罹病種子和病殘體傳播。我國是大豆的生產大國，目前國內還沒有大豆北方和南方莖潰瘍病及擬莖點種腐病菌的發生，前兩種病菌還是我國進境植物檢疫性有害生物，這些病菌的人為和自然傳播對我國大豆生產構成了極大的潛在威脅，準確快速的檢測技術是阻止病菌傳入的有效手段。近年來RAPD、PCR-RFLP、血清學等方法已先後應用於大豆南北方莖潰瘍病菌及大豆擬莖點種腐病菌的鑑定，但是這些方法存在操作複雜或檢測靈敏度不高、或特異性不強、或重複性不好等缺點，在實際檢測工作中難以推廣應用。通過形態學鑑定需極豐富的經驗，容易誤判，而且檢測周期長。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提出快速、可靠、靈敏度高、特異性強和價格便宜的檢測大豆南北方莖潰瘍病菌及大豆擬莖點種腐病菌的引物、探針、試劑盒及實時螢光PCR檢測方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的—種大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，包括含Buffer,Mgcl2，dNTP，Taq酶的實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix、引物和探針。進一步來說，所述的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其組分為所述含Buffer,Mgcl2，d證，Taq酶的實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix每10iiL，所述引物0.9線所述探針0.2iiM。進一步來說，所述引物包括A6PL1F序列為5'-GAGCGTCATTTCAACCCTCAA-3'的大豆擬莖點種腐病菌上遊引及，A6PL1R序列為5'-GGCCTTCCAGAGCGAGATATG-3'的大豆擬莖點種腐病菌下遊引所述探針包括A6PL1M序列為5'-FAM-TTCGTCCAGAAAGC-MGB-3'的大豆擬莖點種腐病菌探針。進一步來說，所述引物包括DP1F序列為5'-AGCCAGGCTTGAGGGTTGA-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用上A、在待測物中加入所述引物、探針；B、擴增步驟；質控步驟採用大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其中，所述引物包括DP1F序列為5'-AGCCAGGCTTGAGGGTTGA-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用上遊引物，以及DP1R序列為5'-GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合5症通用下遊引物；所述探針包括DP1P序列為5'_FAM-ACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGG-TAMAR-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用探針；進行所述步驟A和B;以及，判定步驟。所述擴增步驟包括如下步驟5(TC持續2分鐘；95。C持續10分鐘；D、95。C持續15秒；63t:持續1分鐘，然後進行所述步驟D，直到所述步驟D進行了40個循環為止。與現有技術相比本發明的優點在於，能對實際檢疫和田間調查過程中所發現的病組織及病菌進行大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌分子生物學鑑定或檢測，對我國的出入境檢驗檢疫意義重大。圖1是採用本發明的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒對於大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.meridionalis)進行檢測的實施例的特異性檢測示意圖；圖2是採用本發明的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒對於大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivora)進行檢測的實施例的特異性檢測示意圖3是是採用本發明的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒對於大豆擬莖點種腐病菌進行檢測的實施例的特異性檢測示意圖；圖4是採用本發明的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒對於大豆間座殼/擬莖點綜合症檢測過程中的質控的特異性檢測示意圖。具體實施例方式下面結合附圖和較佳的實施例對本發明作進一步說明。本發明公開了用於大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌實時螢光PCR檢測的試劑盒，所述試劑盒包含上述的引物、探針。本發明還公開了大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌實時螢光PCR檢測方法，包括如下步驟(1)先對大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌及其近似種進行序列測定及比較分析，分別找出大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌不同於其它近似種的獨有的鹼基位點；(2)根據T叫ManMGB探針的設計原理和設計方法，設計大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌實時螢光PCR檢測的特異T叫ManMGB探針、引物以及通用探針、引物；(3)對所設計的探針進行篩選及反應體系和反應條件的優化，篩選出優化的特異性引物、探針和通用引物、探針，並優化出合適的反應體系和反應條件；(4)加入上述的引6物、探針進行大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌實時螢光PCR反應。本發明公開了用於大豆南北方莖潰瘍病菌及大豆擬莖點種腐病菌實時螢光PCR檢測的寡核苷酸探針及引物，所述寡核苷酸探針包括特異性檢測大豆南方莖潰瘍病菌的T叫ManMGB引物、探針；檢測大豆北方莖潰瘍病菌的T叫ManMGB引物、探針和檢測大豆擬莖點種腐病菌的TaqManMGB探針以及檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症質控引物、探針見下表tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8實例4、大豆間座殼/擬莖點綜合症T叫Man探針實時螢光PCR檢測及試劑盒如圖4所示，用於大豆間座殼/擬莖點綜合症實時螢光PCR檢測的通用引物、探針及試劑盒，用於大豆間座殼/擬莖點綜合症檢測過程中的質控。質控步驟即對檢驗的結果進行再次確定的過程，當然此步驟也可以在整個檢驗的最初階段，以便對所檢測的對象進行篩選。以上所有的試劑盒都有以下組分的實施例試劑盒包括應用該引物、探針製成的用於大豆間座殼/擬莖點綜合症檢測的實時螢光PCR檢測試劑盒。其檢測反應的體系總體積為lOyL，各成分為實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix(含Buffer,Mgcl2，d證，Taq酶)，弓l物0.9線探針O.2iiM。其檢測反應條件為擴增步驟，包括如下步驟5(TC持續2分鐘；95。C持續10分鐘；D、95。C持續15秒；63t:持續1分鐘，然後進行所述步驟D，直到所述步驟D進行了40個循環為止。其結果判定標準是1)若定量PCR儀檢測到以大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌DNA為模板的陽性對照報告螢光有明顯信號增長，陰性對照和空白對照的報告螢光沒有螢光信號增長，而樣品的檢測結果是報告螢光信號有明顯增長，質控的報告螢光陽性對照、陰性對照及樣品均有明顯信號增長，則表示所檢測的真菌是大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌；2)若定量PCR儀檢測到以大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌DNA為模板的陽性對照報告螢光有螢光信號增長，陰性對照和空白對照的報告螢光沒有螢光信號增長，而樣品的檢測結果是報告螢光也沒有螢光信號增長，質控的報告螢光陽性對照、陰性對照有螢光信號的增長，則表示所檢測的真菌不是大豆間座殼/擬莖點綜合症。—個檢驗的實驗例如下進口大豆北方莖潰瘍病菌的檢疫鑑定。從進口美國大豆中發現可疑罹病豆杆，按照實施例2和實施例4中所描述的方法進行檢測，實時螢光PCR檢測結果為用大豆間座殼/擬莖點綜合症通用引物、探針DP1F/DP1R、DP1P實時螢光PCR結果呈陽性，大豆北方莖潰瘍病菌特異性引物、探針DC2F/DC2R、DC2M實時螢光PCR結果呈陽性。採用相同方法驗證其餘種(大豆南方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌)，結果均證明採用本發明的方法檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症比傳統形態學方法更加快速、準確，且易於推廣應用。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。權利要求一種用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，包括含Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶的實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix、引物和探針。2.如權利要求l所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，其組分為所述含Buffer,Mgcl2，dNTP，Taq酶的實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix每10iiL，所述引物0.9iiM，所述探針0.2iiM。3.如權利要求1所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，所述引物包括A6PL1F序列為5'-GAGCGTCATTTCAACCCTCAA-3'的大豆擬莖點種腐病菌上遊引物，以及，A6PL1R序列為5'-GGCCTTCCAGAGCGAGATATG-3'的大豆擬莖點種腐病菌下遊引物；所述探針包括A6PL1M序列為5'-FAM-TTCGTCCAGAAAGC-MGB-3'的大豆擬莖點種腐病菌探針。4.如權利要求1所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，所述引物包括DP1F序列為5'-AGCCAGGCTTGAGGGTTGA-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用上遊引物，以及DP1R序列為5'-GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用下遊引物；所述探針包括DPIP序列為5'-FAM-ACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGG-TAMAR-3'的大豆間座殼/擬莖點綜合症通用探針。5.如權利要求1所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，所述引物包括DM1F序列為5'-AGGCGCACCCAGAAACC-3'的大豆南方莖潰瘍病菌上遊引物，以及，DM1R序列為5'-TTTTGCTCAGAGTTTCGGTGTAAA-3'的大豆南方莖潰瘍病菌下遊引物；所述探針包括DM1M序列為5'-FAM-TGAACTCATACCTTACTGTTG-MGB-3'的大豆南方莖潰瘍病菌探針。6.如權利要求1所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，其特徵在於，所述引物包括DC2F序列為5'-AGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA-3'的大豆北方莖潰瘍病菌上遊引物，以及，DC2R序列為5'-CCGGCGGCCAAGCTA-3'的大豆北方莖潰瘍病菌下遊引物；所述探針包括DC2M序列為5'-FAM-CATTTATGTTTATTTCTCAGAGTTT-MGB-3'的大豆北方莖潰瘍病菌探針。7.採用如權利要求1、2、3、5或6中任一權利要求所述的用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟A、在待測物中加入所述引物、探針；B、擴增步驟；質控步驟採用如權利要求4所述的大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，進行所述步驟A和B;以及，判定步驟。8.如權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括如下步驟5(TC持續2分鐘；95。C持續10分鐘;D、95。C持續15秒；63。C持續1分鐘，然後進行所述步驟D，直到所述步驟D進行了40個循環為止。全文摘要本發明提供一種用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒及檢測方法。用於檢測大豆間座殼/擬莖點綜合症的試劑盒，包括含Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶的實時螢光反應混合液TaqManUniversalPCRMasterMix、引物和探針。與現有技術相比本發明的優點在於，能對實際檢疫和田間調查過程中所發現的病組織進行大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆擬莖點種腐病菌分子生物學鑑定或檢測，對我國的出入境檢驗檢疫意義重大。文檔編號C12Q1/68GK101787390SQ20091010528公開日2010年7月28日申請日期2009年1月23日優先權日2009年1月23日發明者餘道堅,李一農,王穎,程穎慧,章桂明,趙巍巍,陳枝楠申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心