一種降解高油脂餐廚垃圾的複合菌劑及其製備方法與流程

2024-04-04 08:04:05

本發明屬於垃圾處理技術領域，具體涉及一種降解高油脂餐廚垃圾的複合菌劑及其製備方法。

背景技術：

餐廚垃圾是是城市生活垃圾的重要組成部分，佔到城市生活總量的40-60％。餐廚垃圾鹽分高，含油量可達20％，產量大、產地分散；餐廚垃圾以澱粉、食物纖維類、蛋白質、油脂等為主要成分，極易腐敗發酸發臭，滋生有害生物。現有技術中由於以往缺少相應的處理條件，往往要麼將餐廚垃圾與其他垃圾混在一起送往垃圾填埋場填埋，但是這種處理方式選址較困難，不僅要考慮地形、地質條件、防止地表水、地下水汙染，而且需要選擇遠離市區，因此運輸距離較遠。要麼用於堆肥，但是重金屬等可能隨堆肥製品汙染地下水，建立穩定的堆肥市場較困難。或者焚燒，焚燒投資大，對垃圾的熱值有一定的要求，而且可能會成為向大氣排放有害物質的新汙染源，使一些有價值的組分喪失掉。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明的目的之一在於提供一種降解高油脂餐廚垃圾的複合菌劑。

本發明的目的之二在於提供所述降解高油脂餐廚垃圾的複合菌劑的製備方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種降解高油脂餐廚垃圾的複合菌劑，包括按質量份計算的如下菌種組成：地衣芽孢桿菌劑20-30份、黑麴黴菌劑20-30份、枯草芽孢桿菌劑40-50份、釀酒酵母菌劑20-30份和洋蔥假單胞菌劑為20-30份。

其中，所述地衣芽孢桿菌劑由地衣芽孢桿菌粉和菌粉載體組成、所述黑麴黴菌劑由黑麴黴菌粉和菌粉載體組成、所述枯草芽孢桿菌劑由枯草芽孢桿菌粉和菌粉載體組成、所述釀酒酵母菌劑由釀酒酵母菌粉和菌粉載體組成、所述洋蔥假單胞菌劑由洋蔥假單胞菌粉和菌粉載體組成；其中各單一菌劑中所述菌粉載體的質量百分比為85％-95％。

所述菌粉載體為麩皮和木屑按照質量比1:1混合均勻並滅菌而得。

所述地衣芽孢桿菌粉、黑麴黴菌粉、枯草芽孢桿菌粉、釀酒酵母菌粉和洋蔥假單胞菌粉分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、黑麴黴（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）經過逐級增加油脂含量的梯度培養條件下進行富集培養而得。

所述地衣芽孢桿菌、黑麴黴、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和洋蔥假單胞菌均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號分別為地衣芽孢桿菌 CICC 10037；黑麴黴 CICC 2041；枯草芽孢桿菌 CICC10027；釀酒酵母 CICC1015；洋蔥假單胞菌 CICC 20699。

所述地衣芽孢桿菌粉的製備：吸取地衣芽孢桿菌母液，依次進行在液體活化培養、一級梯度周期培養、二級梯度周期培養，最後擴大培養製得地衣芽孢桿菌粉；所述液體活化培養基為：蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L、pH值為7.0-7.5；

一級梯度培養基為：蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L、PH值為7.0-7.5；

二級梯度培養基為：蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5 g/L、pH值為7.0-7.5；

擴大培養的培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測細菌OD600值，直至OD600為0.8±0.05，培養時間約為18h；最後通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥，製得地衣芽孢桿菌粉。

所述黑麴黴菌粉的製備：吸取黑麴黴母液，依次進行在液體活化培養、一級梯度周期培養、二級梯度周期培養，最後擴大培養製得黑麴黴菌粉；

所述液體活化培養基為：蔗糖20g/L、動植物油5g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀 0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5；

一級梯度培養基為：蔗糖10g/L、動植物油15g/L、硝酸鈉5 g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5；

二級梯度培養基為：蔗糖5g/L、動植物油20 g/L、硝酸鈉5 g/L、氯化鉀 0.5 g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5；

擴大培養的培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測黑麴黴OD520值，直至OD520為0.8±0.05，培養時間約為21h；最後通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥，製得黑麴黴菌粉。

所述枯草芽孢桿菌粉的製備：吸取枯草芽孢桿菌母液，依次進行在液體活化培養、一級梯度周期培養、二級梯度周期培養，最後擴大培養製得枯草芽孢桿菌粉；所述液體活化培養為：葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、蛋白腖10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；

一級梯度培養基為：葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、蛋白腖10g/L、氯化鈉3 g/L、牛肉膏0.5g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養基為：葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、蛋白腖10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

擴大培養的培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測細菌OD600值，直至OD600為0.8±0.05，培養時間約為18h；最後通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥，製得枯草芽孢桿菌粉。

所述釀酒酵母菌粉的製備：吸取釀酒酵母母液，依次進行在液體活化培養、一級梯度周期培養、二級梯度周期培養，最後擴大培養製得釀酒酵母菌粉；所述液體活化培養為：20％馬鈴薯浸汁培養基；

一級梯度培養基為：10％馬鈴薯浸汁培養基和動植物油10 g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養基為：5％馬鈴薯浸汁培養基和動植物油20g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

擴大培養的培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測細菌OD600值，直至OD600為0.8±0.05，培養時間約為24h；最後通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥製得釀酒酵母菌粉。

所述洋蔥假單胞菌粉的製備：吸取洋蔥假單胞菌母液，依次進行在液體活化培養、一級梯度周期培養、二級梯度周期培養，最後擴大培養製得洋蔥假單胞菌粉；所述液體活化培養為：蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5 g/L、氯化鈉5g/L；

一級梯度培養基為：蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

二級梯度培養基為：蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5 g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L，培養基pH值為7.0-7.5；

擴大培養的培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測細菌OD600值，直至OD600為0.8±0.05，培養時間約為27h；最後通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥製得洋蔥假單胞菌粉。

其中，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）具有較強的蛋白酶、脂肪酶和澱粉酶的活性，可促進有機質中營養素的降解，在複雜環境中能抵抗較大的PH和鹽分變動，同時抑制致病菌的生長繁殖。

黑麴黴（Aspergillus niger）是重要的發酵工業菌種，可生產澱粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，黑麴黴具有裂解大分子有機物和難溶無機物，便於微生物吸收利用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在生長過程中能產生多種菌素、短桿菌Taipe肽等活性物質，能抑制致病菌的生長，同時自身合成α-澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，對有毒有害物質有很強的分解和清理作用，也被廣泛應用於飼料、汙水處理、水產養殖等工業農業領域。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是發酵中最常用的生物種類，擁有豐富的酶系統，對高糖、高油脂、高滲透壓環境具有很強的耐受性，代謝產物多，綜合利用光，在現代工業如食品、釀酒、生物工程等行業中有廣泛的用途。

洋蔥假單胞菌：（Pseudomonas cepacia）環境適應性較強，在營業基質缺乏情況下仍能生長，菌種所產生的脂肪酶對各種有機溶劑(醇等)、熱、氧化劑、表面活性劑、去汙劑、蛋白酶等均有較好的抗性,是目前在有機合成、洗滌劑添加劑、生物柴油合成中應用得最為廣泛的脂肪酶之一。

本發明選取幾種耐高油脂的高效分解菌種，在逐級梯度油脂含量的培養條件下進行富集培養，做成單一菌粉後混合做成複合菌劑，複合菌劑中推薦菌劑比例為地衣芽孢桿菌為20-30份，黑麴黴為20-30份，枯草芽孢桿菌40-50份，釀酒酵母20-30份，洋蔥假單胞菌為20-30份。

進行餐廚垃圾降解實例發現，有效提高了複合菌劑協同降解餐廚垃圾的程度，結果顯示和未進行梯度培養的菌種相比，通過梯度培養基培養的複合菌劑在處理含油量較低的情況下，降解能力基本相同（86.3％，84.5％）；但在含油量為10％的情況下，降解能力可提高7.9％（88.2％。80.3％）；在含油量20％的情況下，降解能力可提高10.9％（84.3％，73.4％）。這證明通過梯度培養基培養的複合菌劑具備了明顯的耐高油脂的適應性，並通過菌種之間的協同作用可提高脂肪利用率，並作為碳源進行新陳代謝，對高油脂的餐廚垃圾具有明顯的降解優勢。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明，以助於本領域技術人員理解本發明。

1.1 對於地衣芽孢桿菌，吸取1ml地衣芽孢桿菌母液，接種至裝有100ml的上述培養基的250ml三角瓶中，液體活化培養基成分為：蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5）；

在培養溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min條件下培養，培養24h。重複此培養步驟5天，經過加動植物油的活化培養基培養過的地衣芽孢桿菌對油脂有一定適應性，隨後油脂濃度進行逐級增大培養。

取經5天活化培養的菌株液1ml接種至裝有100ml一級梯度培養基的250ml三角瓶中，一級梯度培養基成分為：蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5），在培養基溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min條件下培養24h，重複此培養步驟5天。

取經5天一級梯度培養的菌株液1ml接種至裝有100ml二級梯度培養基的250ml三角瓶中，二級梯度培養基成分為蛋白腖5g/L、酵母膏8g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L、pH值保持中性（7.0-7.5），在培養基溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min條件下培養24h，重複此培養步驟5天。

隨後取1ml經5天培養的二級梯度的菌液放入1000ml的3L發酵罐中進行放大培養，發酵罐培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測細菌OD600值，直至OD600為0.8±0.05，培養時間約為18h。通過高速離心收集菌體，並冷凍乾燥做成菌粉。

1.2 吸取1ml黑麴黴母液，接種至裝有100ml的上述培養基的250ml三角瓶中液體活化培養基成分為：蔗糖20 g/L、動植物油5g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5；在培養溫度為28-30℃，搖床轉速為120r/min條件下培養，培養24h。重複此培養步驟5天。

取經5天活化培養的黑麴黴菌液1ml接種至裝有100ml一級梯度培養基的250ml三角瓶中，一級梯度培養基成分為：蔗糖10g/L、動植物油15 g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5； 培養溫度為28-30℃，搖床轉速為120r/min，培養24h。重複此步驟5天。

取經5天一級梯度培養的菌株液1ml接種至裝有100ml二級梯度培養基的250ml三角瓶中，二級梯度培養基成分為蔗糖5g/L、動植物油20g/L、硝酸鈉5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸二氫鉀1g/L硫酸鎂0.5g/L，培養基pH值為6.0-6.5；在培養基溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min條件下培養24h，重複此培養步驟5天。

隨後取1ml經5天培養的二級梯度的菌液放入1000ml的3L發酵罐中進行放大培養，發酵罐培養基為二級梯度的培養基，培養過程中每隔3個小時測黑麴黴OD520值，直至OD520為0.8±0.05，培養時間約為21h。高速離心收集菌體，並冷凍乾燥做成菌粉。

1.3 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、洋蔥假單胞菌培養過程類似。其中枯草芽孢桿菌活化培養基為葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、蛋白腖10 g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；一級梯度培養基為葡萄糖10g/L、動植物油10g/L、蛋白腖10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L；二級梯度培養基為葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、蛋白腖10g/L、氯化鈉3g/L、牛肉膏0.5g/L，培養基pH值保持中性（7.0-7.5）。培養基溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min。放大培養時測OD600（0.8±0.05），培養時間約為18h。

釀酒酵母活化培養基為20％馬鈴薯浸汁培養基（將去皮馬鈴薯200g切成小塊，加入蒸餾水1000ml，煮沸半小時，紗布過濾後，補足1000ml，貯存備用。）；一級梯度培養基為10％馬鈴薯浸汁培養基，動植物油10g/L；二級梯度培養基為5％馬鈴薯浸汁培養基，動植物油20g/L，培養基pH值保持中性（7.0-7.5）。

培養基溫度為30℃，搖床轉速為120r/min；放大培養時測OD560（0.8±0.05），培養時間約為24h。

洋蔥假單胞菌活化培養基為蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖15g/L、動植物油5g/L、氯化鈉5g/L；一級梯度培養基為蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖10 g/L、動植物油10g/L、氯化鈉5g/L；二級梯度培養基為蛋白腖5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5g/L、動植物油15g/L、氯化鈉5g/L。培養基pH值保持中性（7.0-7.5），培養溫度為36-38℃，搖床轉速為120r/min；放大培養時測OD600（0.8±0.05），培養時間約為27h。

1.4 菌粉載體製作：將麩皮：木屑按照質量比1:1混合均勻並滅菌作為載體，將用上述培養方式培養的菌粉和載體在無菌操作條件下充分混勻製作為單一菌劑，單一菌劑中菌粉質量比約為10％。

將製作好的單一菌劑按照一定比例混合均勻即得複合菌劑。推薦比例為地衣芽孢桿菌為20-30份，黑麴黴為20-30份，枯草芽孢桿菌40-50份，釀酒酵母20-30份，洋蔥假單胞菌為20-30份。

上述實施例，只是本發明的較佳實施例，並非用來限制本發明實施範圍，故凡以本發明權利要求所述的特徵及原理所做的等效變化或修飾，均應包括在本發明權利要求範圍之內。

餐廚垃圾降解實例：

本次餐廚垃圾樣品為3份，每份餐廚垃圾均為1000g，並進行人工配製。其中第一份為澱粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉500g（含油量＜10％）；第二份為澱粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉400g，動植物油100g（含油量約10％）；第三份為澱粉200g，青菜葉300g，豬瘦肉300g，動植物油200g（含油量約20％）。每份樣品的菜葉和豬肉均剁碎後和澱粉混勻作為餐廚垃圾樣品。

同時設置對照組實驗，將未進行過梯度培養的原各菌種進行放大培養至各相應的OD值為（0.8±0.05），並按照相同的方式製作成對照組複合菌劑。

將兩組複合菌劑均和餐廚垃圾按照4:1的質量比進行混合，並分別放入餐廚垃圾處理機中進行通風攪拌，保持溫度為37℃。

餐廚垃圾降解率計算採用以下公式進行：降解率=（A-B）/C×100％。其中A表示處理機、餐廚垃圾、複合菌劑投入後的總重量；B表示處理機、餐廚垃圾、複合菌劑處理24h後的總重量；C表示投入的餐廚垃圾的總重量。

通過24h後的降解後，實驗組和對照組的餐廚垃圾降解率分別如下：

從結果來看，和對照組相比，通過梯度培養基培養的複合菌劑在處理含油量較低的情況下，降解能力基本相同（86.3％，84.5％）；但在含油量為10％的情況下，降解能力提高7.9％（88.2％，80.3％）；在含油量20％的情況下，降解能力提高10.9％（84.3％，73.4％）。這證明通過梯度培養基培養的複合菌劑具備了明顯的耐高油脂的適應性，並通過菌種之間的協同作用可將脂肪充分利用並作為碳源進行新陳代謝，對高油脂的餐廚垃圾具有明顯的降解優勢。