一種鴨AvBD2基因真核表達質粒及由該質粒製成的分子佐劑和疫苗的製作方法
2024-04-04 12:00:05 2
專利名稱：一種鴨AvBD2基因真核表達質粒及由該質粒製成的分子佐劑和疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種動物醫藥生物工程領域，特別是一種鴨β -防禦素-2基因真核表達質粒及其使用方法。
背景技術：
防禦素是一類古老的內源性抗菌多肽，在動物、植物、昆蟲體內廣泛存在。除具有廣譜抗菌活性外，防禦素在機體的先天性免疫及獲得性免疫中均具有重要作用。體外許多研究表明防禦素具有趨化和活化抗原提呈細胞(APCs)的功能，是天然免疫的重要組成部分，被認為是一種很好的內源性免疫佐劑。如Tettito等(1989)及Murphy等(1993)的研究證明人α -防禦素1，2，3對單核細胞具有細胞趨化活性，對上皮細胞及培養的成纖維細胞具有促有絲分裂活性。Yang等(1999與2000)研究表明，人上皮β -防禦素_1，2對未成熟樹狀突細胞和記憶性T-細胞具有趨化性；Biragyn等(2001)研究發現鼠日-防禦素_2，3 對骨髓來源的未成熟細胞具有化學趨化活性。體內實驗也表明防禦素具有免疫佐劑特性， 可以增強抗原特異性的免疫力。如^iang等(2010)發現雞β -防禦素_1以融合形式與 IBDV VP2基因相連後免疫雞隻，能增強VP2特異性抗體水平。Lillard等(1999)研究發現人α -防禦素能顯著增加血清中抗原特異性IgG與IgM的水平；增強抗原特異性CD4+T細胞的增值與IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-10的分泌。Tani等(2000)發現人α -防禦素可以刺激鼠脾臟細胞的增值及細胞因子的產生；可以提高小鼠血液IgGl、IgGh、IgG2b抗體水平。對鴨β -防禦素-2在不同組織器官中的表達分析發現其在脾臟和腎臟組織中均大量表達，在骨髓中呈中等水平表達，在心臟和肝臟中僅少量表達，在其他組織器官中均未檢測到有表達。鴨β -防禦素-2在脾臟和骨髓的高表達量，說明鴨β -防禦素-2是一種髓源性防禦素，在內源免疫防禦中起重要作用。對鴨防禦素-2的生物學功能研究也表明，體外具有抗菌活性與趨化活性(Soman等，2009)，具備成為一種內源性免疫佐劑基礎， 可能在促進機體特異性免疫能力方面具重要作用。
發明內容
本發明目的在於提供一種具有鴨β -防禦素-2 (AvBD2)所特有的免疫增強作用的、適合在禽類DNA疫苗中使用的鴨AvBD2基因真核表達質粒及由該質粒製成的分子佐劑和疫苗
本發明的鴨AvBD2基因真核表達質粒是這樣實現的，由pcDNA3. 1(+)真核表達載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達載體上的鴨AvBD2基因片段構成，該鴨AvBD2基因真核表達質粒的獲得方法依次包括1、上遊引物、下遊引物的設計過程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過程；3、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的構建過程；4、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD-2的製備過程；
1、上遊引物、下遊引物的設計過程引物的設計及合成是根據國內外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經多重比較後設計而成，並在5』端加入ATG啟動子，根據真核表達載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點，上遊引物設計去除了前導肽序列處開始，並加上/ ^ III酶切位點及2個保護性鹼基CG ；下遊引物設計在基因末端，並加上ife // I酶切位點及 2個保護性鹼基CC，所設計的引物序列為
上遊引物5』 -cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3』 (.Hind III)
下遊引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3』 (BamHl 酶切位點)
2、鴨AvBD2基因的PCR擴增過程以重組質粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaqDNA 聚合酶、上遊引物、下遊引物、dNIPs進行擴增反應，PCR的反應體系為5yL的10XPCR buffer(10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KClUOmmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)*HC1、0. 001wt%明膠)，2μ L的4XdNTPs(4XdNTPs包含有濃度均為2. 5mmol/ L的dATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸))，濃度為20ymol/L的0. 5 μ L的上遊引物，濃度為20 μ mol/L的0. 5 μ L的下遊引物，1 μ L的pMD-18T_AvBD2質粒，40. 5 μ L 的ddH20 (雙蒸水)，濃度為5umol/L的0. 5 μ L的Exhq DNA聚合酶，反應過程是a、混合物先在95°C處理:3min ；b、然後在94°C處理30s，再在56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應過程b循環30次；然後在72°C處理lOmin，重組質粒pMD-18T_AvBD2由佛山科學技術學院生命科學學院動物科學系張輝華克隆並保存並保證自申請日起20年內向公眾提供；所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約120bp的擴增條帶，表明已擴增到目標產物；
3、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+) _AvBD2的構建過程將過程2的鴨AvBD2基因片段的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉澱物，將沉澱物乾燥後用TE溶解，TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl 禾Π lmmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，TE 溶解物用 ^aaY !,HincI III進行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3. 1(+)質粒進行雙酶切處理，膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切後膠回收的鴨AvBD2基因片段和3 μ L雙酶切後膠回收的pcDNA3. 1 (+)質粒，加入IyL的IOX1M DNA連接Buffer (10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris 『 HCl, 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)，5mmol/L DATP(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)，0. 25mg/mL BSA(牛血清白蛋白))， IuL T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化DH5 α感受態細胞，在含有氨苄青黴素的LB平板上37°C培養18小時；pcDNA3. 1 (+)質粒為hvitrogen公司的產
P
PR，
a、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的雙酶切鑑定在含有氨苄青黴素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中， 37°C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行雙酶切鑑定；將鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進行雙酶切，酶切產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切後產生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經成功構建了鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鑑定在含有氨苄青黴素的 LB平板上挑取單個白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行PCR鑑定；以質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下遊引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下遊引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應過程為a、95°C 處理 !3min ;b、然後 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應過程 b 循環 30 次，然後 72°C延伸 lOmin， PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約120bp的擴增條帶，證明已經成功構建了鴨 AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的製備過程從過程3的LB固體培養平板中挑取單個白色菌落，接種於盛有IOml液體培養基的三角瓶中，37°C震蕩過夜培養以獲得菌種，然後在500ml的三角瓶中加入IOOml的發酵培養基，接入2ml的菌種，在37°C， 以200rpm/min速度搖晃，培養18h，然後用常規提取質粒的鹼裂解方法對500ml三角瓶中的培養物進行質粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本發明的由鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1⑴_AvBD2製成的分子佐劑是這樣實現的，將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成lmg/ml 即可。由鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2製成的疫苗是這樣實現的，將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2用PBS緩衝液稀釋成lmg/ml，然後與禽DNA 疫苗混合即可。本發明與已有技術相比，由於是選用了鴨AvBD2基因片段與真核表達載體連接來作為免疫增強劑，因此，具有鴨AvBD2所特有的免疫增強效果的、適合與禽DNA疫苗一起使用的優點。
具體實施例方式
現結合實施例對本發明作進一步詳細描述
本發明的鴨AvBD2基因真核表達質粒是這樣實現的，由pcDNA3. 1(+)真核表達載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達載體上的鴨AvBD2基因片段，該鴨AvBD2基因真核表達質粒的獲得方法依次包括1、上遊引物、下遊引物的設計過程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過程；3、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的構建過程；4、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的製備過程；
1、上遊引物、下遊引物的設計過程引物的設計及合成是根據國內外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經多重比較後設計而成，並在5』端加入ATG啟動子，根據真核表達載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點，上遊引物設計在去除了前導肽序列處開始，並加上/ ^ III酶切位點及2個保護性鹼基CG ；下遊引物設計在基因末端，並加上ife // I酶切位點及 2個保護性鹼基CC，所設計的引物序列為
上遊引物5』 -cgMGCTT^CTATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3' (Hind III) 下遊引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3』 (BamH I 酶切位點)
2、鴨AvBD2基因的PCR擴增過程以重組質粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaqDNA聚合酶、上遊引物、下遊引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為5μ L的10XPCR buffer (10 XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1， 0. 001% 明膠)，2 μ L 的 4X dNTPs (4X dNTPs 包含有濃度均為 2. 5mmol/L 的 dATP, dTTP, dCTP, dGTP)，0. 5μ L 的上遊引物(20 μ mol/L)，0. 5 μ L 的下遊引物(20 μ mol/L)，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2質粒，40. 5μ L 的 ddH20(雙蒸水)，0. 5 μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L)， 反應過程是a、混合物先在95°C處理:3min ；b、然後在94°C處理30s，再在56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應過程b循環30次；然後在72°C處理lOmin，重組質粒pMD-18T_AvBD2 由佛山科學技術學院生命科學學院動物科學系張輝華克隆並保存；所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約120bp的擴增條帶，表明已擴增到目標產物；
3、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的構建過程將過程2的鴨AvBD2 基因片段的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉澱物，將沉澱物乾燥後用TE (TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl, lmmol/L EDTA)溶解，TE 溶解物用 BatnH l.Hind III 進行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3. 1(+)質粒進行雙酶切處理，膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切後膠回收的鴨AvBD2基因片段和 3yL雙酶切後膠回收的pcDNA3. 1(+)質粒，加入IyL的10XT4 DNA連接BuffeK 10X T4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HCl，0. lmol/L MgC12, 50mmol/L DTT,5mmol/L DATP,0. 25mg/mL BSA)，1 μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化 DH5 α感受態細胞，在含有氨苄青黴素的LB平板上37°C培養18小時；pcDNA3. 1 (+)質粒為 Invitrogen公司的產品
a、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.l(+)-AvBD2的雙酶切鑑定在含有氨苄青黴素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中， 37°C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行雙酶切鑑定；將鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進行雙酶切，酶切產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切後產生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經成功構建了鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
b、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+)-AvBD2的PCR鑑定在含有氨苄青黴素的 LB平板上挑取單個白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行PCR鑑定；以質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下遊引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4X dNTPs (2. 5mmol/L) 2 μ L,上、下遊引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質
1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應過程為a、95°C處理 !3min ;b、然後 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應過程 b 循環 30 次，然後 72°C延伸 lOmin， PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約120bp的擴增條帶，證明已經成功構建了鴨 AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的製備過程從過程3的LB固體培養平板中挑取單個白色菌落，接種於盛有IOml液體培養基的三角瓶中，37°C震蕩過夜培養以獲得菌種，然後在500ml的三角瓶中加入IOOml的發酵培養基，接入2ml的菌種，在37°C， 以200rpm/min速度搖晃，培養18h，然後用常規提取質粒的鹼裂解方法對500ml三角瓶中的培養物進行質粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本發明過程中使用的限制性內切酶及 /7 !,Hind III、T4DNA連接酶、ExTaq DNA 聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。本發明的由鴨AvBD2基因真核表達質粒PCDNA3. l(+)-AvBD2製成的分子佐劑是這樣實現的，將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成lmg/ml 即可。本發明由鴨AvBD2基因真核表達質粒PCDNA3. l(+)-AvBD2製成的疫苗是這樣實現的，將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) _AvBD2用PBS緩衝液稀釋成lmg/ml，然後與禽DNA疫苗混合即可。用該分子佐劑pcDNA3. l(+)-AvBD2與禽流感病毒DNA疫苗(AIV HA DNA疫苗)聯合應用，免疫AIV HA血清抗體陰性雞隻，通過檢測血清AIV HA特異性抗體值、血液IL_4、IL_6 和INF-Y變化水平；同時分離淋巴細胞，用MTT法檢測淋巴細胞增值反應；並於免疫後17d 和31d測免疫器官指數(包括法氏囊、胸腺和脾臟指數)，以評價其對禽流感病毒DNA疫苗 (AIV HA DNA疫苗)的免疫增強作用。60隻14日齡健康雞，隨機分成3組，每組20隻，飼養在華南農業大學動物科學院家禽研究室。免疫兩次，第一次免疫後10天進行二免。第一組為PBS組(免疫劑量為0. 15ml)，第二組為AIV HA DNA疫苗組(免疫劑量為150 μ g)，第三組為AIV HA DNA疫苗組(免疫劑量為150 μ g) + pcDNA3. 1 (+) _AvBD2 (免疫劑量為150 μ g)。 結果發現第二組與第三組雞隻血清HA特異性抗體水平及IL-4、IL-6及INF- Y細胞因子水平隨免疫時間的延長而增加，在Md時達到最高水平，31d時開始下降；並且自從一免後的17d開始，第三組血清HA特異性抗體水平及IL-4、IL-6及INF-Y細胞因子水平顯著高於第二組。第一組血清撤特異性抗體水平及11^-4、11^-6及1順-^細胞因子水平一直變化不大，顯著低於第二與第三組。免疫後第17 d、31 d，法氏囊、胸腺和脾臟指數，第三組均顯著高於第二組與第一組，第二組顯著高於第一組。外周血T淋巴細胞的轉化率，隨著時間增加，三個組均呈下降趨勢，但在各個日齡第三組顯著高於第二組與第一組，第二組顯著高於第一組。上述實驗結果表明分子佐劑pcDNA3. l(+)-AvBD2對AIV HA DNA疫苗具有很好的免疫增強作用。
權利要求
1. 一種鴨AvBD2基因真核表達質粒，其特徵在於由pcDNA3. 1(+)真核表達載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達載體上的鴨AvBD2基因片段構成，該鴨AvBD2基因真核表達質粒的獲得方法依次包括1、上遊引物、下遊引物的設計過程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過程；3、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的構建過程；4、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的製備過程；(1)上遊引物、下遊引物的設計過程引物的設計及合成是根據國內外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經多重比較後設計而成，並在5』端加入ATG啟動子，根據真核表達載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點，上遊引物設計去除了前導肽序列處開始，並加上/ ^ III酶切位點及2個保護性鹼基CG ；下遊引物設計在基因末端，並加上ife // I酶切位點及 2個保護性鹼基CC，所設計的引物序列為上遊引物5，-cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3』 Hind III，下遊引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3』 BamHl 酶切位點，(2)鴨AvBD2基因的PCR擴增過程以重組質粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上遊引物、下遊引物、dNIPs進行擴增反應，PCR的反應體系為5 μ L的10 X PCR buffer, 2 μ L的4Χ dNTPs，濃度為20 μ mol/L的0. 5 μ L的上遊引物，濃度為20 μ mol/L的 0. 5 μ L 的下遊引物，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2 質粒，40. 5 μ L 的 ddH20,濃度為 5umol/L 的 0. 5μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶，10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris ·Ηα、0. 001wt% 明膠，4X dNIPs 包含有濃度均為 2. 5mmol/L 的 dATP、dTTP、 dCTP和dGTP，反應過程是a、混合物先在95°C處理^iin ；b、然後在94°C處理30s，再在 56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應過程b循環30次；然後在72°C處理lOmin，所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見到約120bp的擴增條帶，表明已擴增到目標產物；(3)鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的構建過程將過程2的鴨AvBD2 基因片段的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉澱物，將沉澱物乾燥後用TE溶解， TE 包含有 10mmol/L Tris 'HCl 禾Π lmmol/L EDTA, TE 溶解物用 ^aaY l.Hind III 進行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對pcDNA3. 1(+)質粒進行雙酶切處理， 膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切後膠回收的鴨AvBD2基因片段和3 μ L 雙酶切後膠回收的pcDNA3. 1 (+)質粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA連接Buffer，1 μ L T4 DNA 連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化DH5ci感受態細胞，在含有氨苄青黴素的LB平板上37°C培養18小時，10XT4 DNA連接Buffer包含有0. 5mol/L Tris · HCl、 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP、0. 25mg/mL BSA ；a、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的雙酶切鑑定在含有氨苄青黴素的LB平板上挑取單個的白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中， 3 7 °C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行雙酶切鑑定；將鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進行雙酶切，酶切產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切後產生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經成功構建了鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鑑定在含有氨苄青黴素的 LB平板上挑取單個白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C振搖培養18小時，抽提質粒DNA進行PCR鑑定；以質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下遊引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下遊引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應過程為a、95°C 處理 !3min ;b、然後 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應過程 b 循環 30 次，然後 72°C延伸 lOmin， PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約120bp的擴增條帶，證明已經成功構建了鴨 AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；(4)鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的製備過程從過程3的LB固體培養平板中挑取單個白色菌落，接種於盛有IOml液體培養基的三角瓶中，37°C震蕩過夜培養以獲得菌種，然後在500ml的三角瓶中加入IOOml的發酵培養基，接入2ml的菌種，在 37°C，以200rpm/min速度搖晃，培養18h，然後用常規提取質粒的鹼裂解方法對500ml三角瓶中的培養物進行質粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達質粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2。
2.由鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2製成的分子佐劑，其特徵在於將權利要求1所述的鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成 lmg/ml 艮阿。
3.由鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.l(+)-AvBD2製成的疫苗，其特徵在於將權利要求1所述的鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成Img/ ml，然後與禽DNA疫苗混合即可。
全文摘要
一種鴨AvBD2基因真核表達質粒及由該質粒製成的分子佐劑和疫苗其特徵在於鴨AvBD2基因真核表達質粒由pcDNA3.1(+)真核表達載體、連接在pcDNA3.1(+)真核表達載體上的鴨AvBD2基因片段構成，由該質粒製成的分子佐劑是將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成1mg/ml即可，疫苗是將鴨AvBD2基因真核表達質粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS緩衝液稀釋成1mg/ml，然後與禽DNA疫苗混合即可。本發明與已有技術相比，具有鴨β-防禦素-2(AvBD2)所特有的免疫增強作用的、適合在禽類DNA疫苗中使用的優點。
文檔編號C12N15/66GK102433353SQ20111040078
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月6日 優先權日2011年12月6日
發明者張輝華, 李辰, 畢英佐, 謝青梅, 韓小鳳, 馬保華, 馬靜雲 申請人:佛山科學技術學院