適用於荷花淹水脅迫基因表達研究的內參基因及其應用的製作方法

2024-04-04 02:10:05 1

本發明涉及農業生物技術領域，具體涉及荷花淹水脅迫基因表達領域，尤其是適用於荷花淹水脅迫基因表達研究的內參基因及其應用。

背景技術：

荷花是多年生挺水植物，是我國十大名花中唯一的水生花卉，因花色豐富、群體花期長、葉色碧綠、深受人們的喜愛，加上寓意深刻、文化價值，是極好的水景園林美化植物和家庭園藝常用植物，在我國應用和分布都極其廣泛。淹水脅迫：荷花是一種水生花卉，環境的變化使荷花時常要面對淹水脅迫影響。因此，耐淹水脅迫資源和基因的挖掘是荷花育種目標之一。

隨著分子生物學研究的不斷發展，功能基因研究已成為植物抗逆育種的重要手段，基因表達分析則是植物功能基因研究的基礎。為了校正不同樣本rna提取效率、質量、反轉錄效率及擴增效率上的差異，通常在基因表達分析中需要用到在細胞中表達恆定的基因即內參基因作為標準。在比較耐淹水品種基因表達差異的研究過程中，較多的涉及到應用qpcr驗證和分析基因表達模式和水平，因此篩選淹水脅迫條件下穩定表達的內參基因對qpcr結果有著關鍵的作用。

技術實現要素：

本發明的目的在於克服現有技術存在的以上問題，提供適用於荷花淹水脅迫基因表達研究的內參基因，本發明解決了荷花淹水脅迫基因表達研究中沒有內參基因的現狀。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

適用於荷花淹水脅迫基因表達研究的內參基因，內參基因包括：荷花肌動蛋白actin基因和核糖體蛋白18srna基因。

優選地，所述荷花肌動蛋白actin基因的核苷酸序列為seqidno.1。

優選地，所述核糖體蛋白18srna基因的核苷酸序列為seqidno.2。

優選地，荷花肌動蛋白actin基因的引物為seqidno.8、seqidno.9。

優選地，核糖體蛋白18srna基因的引物為seqidno.6、seqidno.7。

優選地，荷花肌動蛋白actin基因在荷花耐淹水脅迫基因篩選或研究中的應用。

優選地，核糖體蛋白18srna基因在荷花耐淹水脅迫基因篩選或研究中的應用。

本發明的有益效果是:

發明公開了2個用於研究荷花淹水脅迫基因表達的內參基因，並揭露了利用這2個基因為基礎設計的實時螢光定量pcr引物，解決了荷花淹水脅迫基因表達研究中沒有內參基因的現狀，本發明的內參基因可在荷花應對淹水脅迫時穩定表達，所設計的實時螢光定量pcr引物用於荷花應對淹水脅迫時的基因表達分析，可提高研究的穩定性、可靠性和重複性。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明如後。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例技術中的技術方案，下面將對實施例技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發明18srna5的溶解曲線；

圖2是actin的溶解曲線；

圖3是ef1a的溶解曲線；

圖4是β-tubulin的溶解曲線；

圖5是histone的溶解曲線；

圖6是erfb2-1的溶解曲線；

圖7是erfb2-2的溶解曲線；

圖8是本發明應用1的結果圖；

圖9是本發明應用2的結果圖；

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例

1、材料處理：以荷花種子為材料，尾部破殼後，在25℃及16h/day光照條件下浸種，胚軸發生1～2周後，選取芽長度一致的種子用於淹水脅迫試驗。淹水脅迫時間為1h、2h、4h、12h。

2、螢光定量試驗：rna提取採用葉芽材料，提取方法參照上海生工柱式植物總rna抽提純化試劑盒說明書(產品編號：b518661-0100),cdna第一鏈合成參照上海生工m-mulv第一鏈cdna合成試劑盒說明書(產品編號：b532435-0020)。

根據5個內參候選序列，使用primerpremier5.0軟體設計引物，引物序列及預計擴增片段長度如表1所示。

qpcr方法參照上海生工2xsgfastqpcrmastermix試劑盒說明書(產品編號：b639271-0005)。

表15個候選內參基因qpcr引物及預計擴增片段長度

表2淹水脅迫不同時間候選內參基因荷花葉片中的ct值

表3bestkeeper、genorm和normfinder三種軟體對5個候選內參基因評價

ct值與基因表達量成反比，ct值越大，表達量越小。表2為淹水脅迫處理不同時間5個候選內參基因在荷花葉片中qpcr反應的ct值。結果表明，5個看家基因的ct值在21～32之間，actin的ct值最低，在21.2441～22.6662；histone的ct值最高，在27.4985～31.1361。說明各看家基因的表達量不同，有的差別較大。

bestkeeper、genorm和normfinder是三種常用的用於內參基因穩定性分析的軟體。表3為3種軟體對5個候選內參基因在不同時間淹水脅迫處理時間下qpcr反應的表達量穩定性分析結果。bestkeeper根據內參基因的ct值計算標準偏差，sd值越小，基因的穩定性越好，根據該軟體分析，5個內參基因穩定性從高到低排序為18srna>actin>ef1a>β-tubulin>histone；genome根據平均表達穩定性指數m確定最穩定的內參基因，m值越大，基因的穩定性越低，根據該軟體分析，5個內參基因穩定性從高到低排序為actin>18srna>ef1a>β-tubulin>histone；normfinder使用excel軟體計算基因的穩定值m，m值越低，則該基因越穩定，根據該軟體分析，5個內參基因穩定性從高到低排序為actin>18srna>ef1a>β-tubulin>histon。綜合表現看，actin和18srna為淹水脅迫不同時間處理下表達量最穩定的2個基因。

內參基因的應用1

以18srna為內參基因，以淹水脅迫1h、2h、4h的荷花白洋澱紅蓮幼苗為材料，未淹水材料為對照，實時螢光定量pcr檢測荷花erfb2-1基因在不同脅迫時間處理下的表達情況。螢光定量體系和反映程序參照實施例，螢光定量內參基因和目的基因erfb2-1均設3個重複孔，每個處理均為3個生物學重複，相對定量數據處理採用2-△△ct法，△△ct＝△ct處理樣本-△ct對照樣本。△ct＝△ct目的基因-△ct內參基因。各處理間差異採用excel進行統計分析。

結果如圖8所示，淹水脅迫處理後，erfb2-1基因表達量有顯著提高，其中以淹水脅迫第1個小時表達量最高，為對照的3.63倍。此後表達量呈現一個先降低後升高的趨勢，淹水脅迫處理2小時、4小時erfb2-1基因表達量分別為對照的2.54倍和3.07倍。

內參基因的應用2

以actin為內參基因，以淹水脅迫1h、2h、4h的荷花普者黑白荷幼苗為材料，未淹水材料為對照，實時螢光定量pcr檢測荷花erfb2-2基因在不同脅迫時間處理下的表達情況。

實施方法如應用1所示，結果如圖9所示，淹水脅迫處理後，erfb2-2基因表達量無顯著變化，淹水脅迫處理1小時、2小時、4小時erfb2-2基因表達量分別為對照的1.02倍、0.80倍和0.99倍。

圖1-7是5個候選內參基因及應用提及的erfb2-1、erfb2-2基因的溶解曲線。出現單峰說明擴增產物特異性好，出現雜峰特異性差，存在非特異性擴增，如引物二聚體等。圖1-7中的顯示5個候選內參基因及erfb2-1、erfb2-2基因的溶解曲線均為單峰，無非特異擴增，試驗結果可靠。

上述2個用於研究荷花淹水脅迫基因表達的內參基因，並揭露了利用這2個基因為基礎設計的實時螢光定量pcr引物，解決了荷花淹水脅迫基因表達研究中沒有內參基因的現狀，本實施例的內參基因可在荷花應對淹水脅迫時穩定表達，所設計的實時螢光定量pcr引物用於荷花應對淹水脅迫時的基因表達分析，可提高研究的穩定性、可靠性和重複性。

對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制於本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的範圍。

sequencelisting

蘇州市農業科學院

適用於荷花淹水脅迫基因表達研究的內參基因及其應用

2017.5.17

patentinversion3.3

2003

dna

人工合成

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