酮還原酶突變體的製作方法
2024-03-02 12:55:15
專利名稱：酮還原酶突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及酮還原酶突變體，該酮還原酶突變體可用於利用微生物對半合成生產的柔紅黴素衍生物進行發酵生產的方法。
背景技術：
蒽環類抗生素是芳香族聚酮的一群化合物，是由以7，8，9，10-四氫-5，12-四並苯醌(下圖)作為基本骨架的糖苷配基部分與以氨基糖為主體的糖類構成的色素糖苷(glycoside)。[化學式I]
O
O^OD蒽環類抗生素與DNA結合，產生自由基，切斷DNA鏈，或者抑制拓撲異構酶II。拓撲異構酶具有DNA酶(DNase)和連接酶(Iigase)活性，催化DNA鏈的暫時切斷與再結合，蒽環抗生物質通過抑制拓撲異構酶II，阻礙DNA複製，發揮抗腫瘤活性。蒽環類抗生素雖確認具有蓄積性心毒作用，但因其對廣範圍的癌細胞顯示出抗腫瘤活性，所以仍被認為是有用的抗癌劑。現在使用的主要蒽環系抗癌劑包括發酵產物來源的，例如柔紅黴素；以柔紅黴素作為原料的半合成品，例如多柔比星、表柔比星。[化學式2]
O OHO
χ^ο^·
IIIi
TCH3O OH O[表 I]
R1R2R3
柔紅黴素~CH^HOH多柔比星 ICH2OH[H[OH
表柔紅黴素^OHH
表柔比星 CH2OHOHH從抗腫瘤活性與毒性層面來看，表柔比星優於柔紅黴素、多柔比星，但是，用於將氨基糖部分的4位羥基反轉的化學合成步驟的收率低，現狀是雖然可以以柔紅黴素作為初始原料來生產表柔比星，但製造成本方面存在許多問題。另一方面，有報告稱進行了下述研究通過將編碼與柔紅黴素生物合成相關的酮還原酶產物立體特異性不同的酮還原酶(表位型酮還原酶(epitypeketoreductase))的基因導入柔紅黴素生產菌,對柔紅黴素的生物合成途徑進行修飾，來直接發酵生產表柔紅黴素(非專利文獻I)。表柔紅黴素的氨基糖部分的羥基的立體構象與表柔比星相同，因而，在表柔比星的生產方面，表柔紅黴素是極有用的初始原料。有報告稱，在導入了除蟲菌素生物合成相關的表位型酮還原酶基因 時，表柔紅黴素的生產量是最高的，但其生產量也僅僅不過是約54μ g/mL，尚未達到可實用化的水平。此外，有專利申請稱，對該研究中所得的表柔紅黴素生產菌進行突變原處理，將表柔紅黴素的生產性提高到100 μ g/mL以上(專利文獻I)，但實施例中並未記載所取得的突變株的具體情況。另一方面，本發明人發現在導入了氯伊瑞黴素(chloroeremomycin)中所含的氨基糖——表萬古胺的生物合成相關的酮還原酶基因(evaE)時，與導入了 avrE基因的情況相比，表柔紅黴素的生產量提高至2. 7倍，並進行了專利申請(專利文獻2)。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :國際公開第W02006/111561號小冊子專利文獻2 :國際公開第盟2009/035107號小冊子非專利文獻非專利文獻I :Madduri, K.等著，Nature Biotechnology,(美國)，1998 年,第 16卷，p. 69-74非專利文獻2 :Lipman DJ and Pearson WR 著.Science,(美國)，1985 年,第 227卷，p. 1435-1441非專利文獻3 :Lipman DJ and Pearson WR 著· Proceedings of theNationalAcademy of Sciences of the United States of America,(美國)，1988 年，第 85 卷，p.2444-2448非專利文獻4 :Schmitt_John, T. and Engels, J. ff.著，AppliedMicrobiology andBiotechnology,(獨國)，1992 年，第 36 卷，p. 493-498非專利文獻5 :Bibb, M. J.等著，Molecular Microbiology,(英國)，1994 年,第14 卷，ρ· 533-545非專利文獻6 Practical Streptomyces Genetics,The John InnesFoundation,(英國)，Norwick，2000 年，ρ· 311-338非專利文獻7 Bibb, M. J.等著，Gene,(英國)，1985 年，第 38 卷，p215_226非專利文獻8 Komiyama, T.等著，The Journal of Antibiotics,(日本)，1977年,第 30 卷，p. 619-62
發明內容
發明所要解決的問題本發明的課題是提供對於利用微生物進行的表柔紅黴素等柔紅黴素衍生物的直接發酵生產方法中使用的酮還原酶，進行修飾使得柔紅黴素衍生物的生產性提高而得到的酮還原酶突變體。解決問題的方法本發明人等作為利用微生物進行的柔紅黴素衍生物的直接發酵生產方法中使用的酮還原酶，對由SEQ ID NO :I所述的胺基酸序列組成的酮還原酶(EvaE)的修飾進行了深入研究發現通過使用將選自42位、149位、153位、270位、以及306位的胺基酸中的至少I 個位置的胺基酸取代成其他胺基酸而得到的酮還原酶突變體，能夠提高柔紅黴素衍生物的生產性,從而完成了本發明。S卩，本發明提供能夠在利用微生物進行的效率好的柔紅黴素衍生物的直接發酵生產中使用的酮還原酶突變體以及編碼該突變體的多核苷酸(特別是DNA)。此外，本發明在提供基於編碼本發明的酮還原酶突變體的DNA的轉化體的同時，還提供包括該培養轉化體、並從所得培養液收集柔紅黴素衍生物的步驟的柔紅黴素衍生物的製造方法。進一步，本發明提供利用本發明的轉化體生產的柔紅黴素衍生物。因此，本發明提供以下方面(I) 一種酮還原酶突變體，其是可用於柔紅黴素衍生物的發酵生產的酮還原酶的突變體，其中，突變是在親本酮還原酶的胺基酸序列中插入、取代、或缺失或者在其一個或兩個末端添加I個或多個胺基酸，且與使用親本酮還原酶的情況相比，柔紅黴素衍生物的生廣性提聞。(2) (I)所述的酮還原酶突變體，其中，親本酮還原酶包含與SEQ ID NO :1的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。(3)⑵所述的酮還原酶突變體，其中，選自與SEQ ID NO 1所述的胺基酸序列中的42、149、153、270和306位的胺基酸相當的位置的胺基酸中的I個或2個以上的胺基酸
殘基被其他胺基酸殘基取代。(4) (3)所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQ ID NO 1所述的胺基酸序列中的42位的胺基酸相當的位置的胺基酸被亮氨酸取代。(5) (3)所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQ ID NO : I所述的胺基酸序列中的149位的胺基酸相當的位置的胺基酸被絲氨酸取代。(6) (3)所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQ ID NO : I所述的胺基酸序列中的153位的胺基酸相當的位置的胺基酸被脯氨酸以外的胺基酸殘基取代。(7) (3)所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQ ID NO : I所述的胺基酸序列中的270位的胺基酸相當的位置的胺基酸被精氨酸取代。(8) (3)所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQ ID NO : I所述的胺基酸序列中的306位的胺基酸相當的位置的胺基酸被天冬氨酸取代。(9) (I廣(8)中任一項所述的酮還原酶突變體，其中，柔紅黴素衍生物是表柔紅黴素。(10)編碼(1) (9)中任一項所述的酮還原酶突變體的多核苷酸。(11)將(10)所述的DNA導入本來具有生產柔紅黴素的能力的放線菌宿主而得到的、賦予了柔紅黴素衍生物生產能力的轉化體。(12) (11)所述的轉化體，其中，宿主放線菌是天藍淡紅鏈黴菌(Streptomycescoeruleorubidus)。
(13) 一種柔紅黴素衍生物的製造方法，其包括培養(12)所述的轉化體、並從培養液收集柔紅黴素衍生物的步驟。(14)通過(13)所述的製造方法得到的柔紅黴素衍生物。發明的效果根據本發明的酮還原酶突變體,能夠提高柔紅黴素衍生物的生產性。發明的
具體實施例方式本發明的酮還原酶突變體可以作為對親本酮還原酶進行突變的結果而得到。而且，在本發明中，該突變是指在酮還原酶的胺基酸序列中插入、取代、或缺失或者其一個或兩個末端添加I個或多個胺基酸，且將酮還原酶突變體使用於柔紅黴素衍生物的發酵生產方法的情況與使用親本酮還原酶的情況相比，柔紅黴素衍生物的生產性提高。在本發明中，對親本酮還原酶沒有限制，可用於柔紅黴素衍生物的發酵生產方法即可，優選由SEQ ID NO :1所示胺基酸序列構成的酮還原酶或其同源體。這裡，「其同源體」是指在SEQ ID NO :1所示胺基酸序列中插入、取代或缺失、或其在其一個或兩個末端添加數個胺基酸而得到，且與SEQ IDNO 1所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性，且保持其酮還原酶活性。這裡所稱的「同一性」是指在本領域技術人員公知的同源性檢索程序[FASTA3; http ://fasta. ddb j. nig. ac. jp/top-j. html] (Science, 227,1435-1441 (1985) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85，2444-2448 (1988)(非專利文獻 2,3))中，採用默認(初始設定)參數計算出的數值。此外，酮還原酶活性的有無可以通過在後述的適當宿主中導入編碼同源體的基因，使之表達，並考察有無柔紅黴素衍生物生成，來進行判定。應該清楚的是，對於這樣的「同源體」，本領域技術人員能夠參照SEQ ID NO :1所示序列毫無困難地選擇來進行製造。根據本發明的優選方面，在親本酮還原酶由SEQ ID NO 1所示胺基酸序列構成的情況下，作為具體例子，可以列舉出選自該序列中的42、149、153、270、和306位的胺基酸中的I個或2個以上的胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代而得到的突變體。根據本發明的優選方面，優選可以列舉出將42位的胺基酸取代成亮氨酸而得到的、將149位的胺基酸取代成絲氨酸而得到的，將153位的胺基酸取代成脯氨酸以外的胺基酸而得到的，將270位的胺基酸取代成精氨酸而得到的，將306位的胺基酸取代成天冬氨酸而得到的。這些突變體具有用於柔紅黴素衍生物的發酵生產方法中的情況下，柔紅黴素衍生物的生產性提高這樣的有利性質。此外，在親本酮還原酶是SEQ ID NO :1所示胺基酸序列的同源體的情況下，作為具體例子可以列舉出選自與所述的42、149、153、270、和306位的胺基酸相當的位置的胺基酸中的I個或2個以上的胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代而得到的。這裡，在由SEQ IDNO 1所示胺基酸序列構成的親本酮還原酶的同源體中應取代的胺基酸殘基的位置可以通過基於公知算法的胺基酸序列比較容易地選擇。另一方面，在基於公知算法的胺基酸序列比較有困難的情況下，可以通過比較酶的立體結構來確定應取代的胺基酸殘基的位置。通過將本編碼發明的酮還原酶突變體的DNA導入本來具有生產柔紅黴素的能力的適當宿主，能夠得到生產柔紅黴素衍生物的轉化體。優選的宿主是放線菌，作為生產柔紅黴素的放線菌，已知有Streptomyces peuceticus、天藍淡紅鏈黴菌(Streptomycescoeruleorubidus),它們可以用作用於導入編碼本發明的酮還原酶突變體的DNA的宿主。此外，巴龍黴素(baumycin)是用柔紅黴素的氨基糖(L-柔紅糖胺(L-daunosamine))部分被修飾而得到的物質生物合成柔紅黴素的中間體，因而生產巴龍黴素的放線菌也可以作為宿主加以利用。此外，優選使用在上述的柔紅黴素或巴龍黴素生產菌中，通過缺損與柔紅黴素的L-柔紅糖胺部分的4位羥基生物合成相關的酮還原酶基因，從而喪失了柔紅黴素生產能力的菌株作為宿主。將基因導入宿主可以利用混合原生質體和目的DNA的方法、利用噬菌體的方法、利用接合轉移的方法等常規方法，可以在考慮宿主性質的基礎上選擇適當的方法來實施。為了挑選導入了基因的菌株，希望將作為目標的表位型酮還原酶基因與包含選擇標記基因的載體一起導入。對於選擇標記基因沒有限定，只要能夠挑選出導入了表位型酮還原酶基 因的菌株，優選卡那黴素抗性基因、鏈黴素抗性基因、潮黴素抗性基因、紫黴素抗性基因或者安普黴素(apramycin)抗性基因等。優選在導入的表位型酮還原酶基因中添加能夠在宿主中發揮功能的啟動子序列，紅黴素抗性基因來源的ermE*啟動子[Schmitt-John, T. andEngels, J. ff.著，「Applied Microbiology andBiotechnology」，(德國)，1992 年，第 36卷，ρ· 493-498 (非專利文獻 3) ]、[Bibb, M. J.等著，「Molecular Microbiology」，(英國)，1994年，第14卷，p. 533-545(非專利文獻4)]等是優選的例子。作為表位型酮還原酶基因在宿主內的存在狀態，可以將其導入可在染色體外自主複製的質粒，或者將其導入染色體中。此外，還可以採用以表位型酮還原酶基因取代宿主的與柔紅黴素的L-柔紅糖胺部分的4位羥基生物合成相關的酮還原酶基因的方法來進行導入。作為取代基因的方法，可以利用在放線菌中通常使用的方法[Practical StreptomycesGenetics,「The John InnesFoundation」，(英國)，Norwick, 2000 年，p. 311-338 (非專利文獻 5)]。本發明的轉化體所生產的柔紅黴素衍生物是將柔紅黴素的L-柔紅糖胺部分的4位羥基反轉而得到的柔紅黴素衍生物。優選為表柔紅黴素以及表柔比星，更優選為表柔紅黴素O採用常規方法培養本發明的轉化體，可以生產柔紅黴素衍生物。在培養基方面，作為常規成分例如碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、水飴(水飴)、糊精、澱粉、甘油、糖蜜、動植物油等。此外，作為氮源，大豆粉、小麥胚芽、玉米浸出液、棉子柏、肉提取物、多蛋白腖、麥芽提取物、酵母提取物、硫酸銨、硝酸鈉、尿素等。此外，視需要添加能夠產生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸(磷酸氫二鉀等)、硫酸(硫酸鎂等)以及其它離子的無機鹽類也是有效的。此外，視需要還可以添加硫胺(硫胺鹽酸鹽等)等各種維生素，穀氨酸(穀氨酸鈉等)、天冬醯胺(DL-天冬醯胺等)等胺基酸，核苷酸等微量營養素，抗生素等選擇藥物。而且，可以適當添加能夠幫助菌體發育、促進柔紅黴素衍生物生產的有機物和無機物。培養基的pH為例如pH5. 5 pH8左右。作為培養方法，可以採用需氧條件下的固體培養法、振蕩培養法、通氣攪拌培養法或深層需氧培養法來進行，特別是，深層需氧培養法是最為合適的。培養中的適當溫度是15°C 40°C，多數情況下在25°C 35°C左右進行生長。柔紅黴素衍生物的生產因培養基和培養條件、或所使用的宿主而異，在任何培養法中，蓄積通常均是在2天 10天達到最高。當培養中的柔紅黴素衍生物的量達到最高時停止培養，然後從培養物分離、純化目的物質。為了從培養本發明的轉化體所得的培養物收集柔紅黴素衍生物，可以單獨或適當組合使用利用了其性狀的常規分離手段、例如溶劑抽提法、離子交換樹脂法、吸附或分配柱層析法、凝膠過濾法、透析法、沉澱法、結晶化法等來進行抽提純化。為了進一步純化柔紅黴素衍生物，可以使用娃膠、氧化招等吸附劑、Sephadex LH_20 (Pharmacia公司製造)或T0Y0PEARLHW-40(東曹公司製造)等來進行層析。以下示出本發明的實施例，但這僅僅是一些例子，而非對本發明的限定，本發明還包括未在這裡示例的全部的許多改變或修飾。實施例I
對氯伊瑞黴素生產菌(Amycolatopsis orientalis,東方擬無枝酸菌)的酮還原酶基因(evaE)的導入突變將含ermE* 啟動子的質粒 DI.T4070「Bibb,Μ. T.等著,Gene,(英國)，1985 年,第 38卷，P215-226 (非專利文獻7)]用EmRI以及_HI雙重消化，電泳分級後，用凝膠抽提含ermE*啟動子的約O. 3kbp的EcoRI-BamHI片段。將該DNA片段插入質粒pSET152的EcoRI以及BamHI部位，得到了質粒pSET152_E*。對於氯伊瑞黴素生產菌(東方擬無枝酸菌)的酮還原酶基因(evaE)，全合成了由SEQ ID NO 2所示的鹼基序列構成的片段，將其插入質粒pSET152_E*的BamHI以及迎旦1部位，得到了質粒PEVA-E。以該質粒pEVA-E作為模板，使用GeneMorph II RandomMutagenesis Kit (Stratagene公司製造)按照附帶的說明書通過引物pSET153_R(5』_GCGGATAACAATTTCACA-3』、SEQ ID NO :3)和 pSETermE_R(5』-GTGCGGGCCTCTTCGCTATT-3』、SEQ IDNO 4)的組合導入了隨機突變。將導入了突變的evaE片段用BamHI以及XbaI雙重消化，克降至dSET152_E*的BamHI以及迎旦1部位，以此作為基因組DNA文庫。將保持該基因組DNA文庫的大腸桿菌(Escherichiacoli)ET12567/dUZ8002株接種於按氯黴素、卡那黴素以及安普黴素分別為25 μ g/mL,25 μ g/mL以及50 μ g/mL的濃度的IOOmL的LB液體培養基(1%DIFC0細菌用胰蛋白腖、O. 5%DIFC0酵母提取物、O. 5%NaCl、0. 1%葡萄糖)，37°C培養過夜,製備了前培養液。將前培養液接種於與前培養時相同的液體培養基中使得其終濃度為1%，37°C培養約4小時後，用LB液體培養基洗滌2次，最終將其懸浮於IOmL的LB液體培養基中，作為大腸桿菌液。將作為柔紅黴素生產菌的天藍淡紅鏈黴菌(Streptomyces coeruleorubidus)的dnmV基因破壞株(專利文獻2 :國際公開第W02009/035107號小冊子)塗布於MS瓊脂培養基(2%S大豆粉、2%甘露醇、2%瓊脂)，28°C培養4日。培養後，用20%甘油溶液3mL洗下孢子，製備了宿主的孢子液。將如上述製備的宿主的孢子液500 μ L與大腸桿菌液500 μ L混合併收集菌體後，塗布於添加有終濃度IOmmo 1/L的MgCl2的MS瓊脂培養基。28°C、培養20小時後，重層含安普黴素Img以及萘啶酸I. 5mg的滅菌水lmL，再於28°C培養5天，得到了安普黴素抗性株。
為了對這些株確認表柔紅黴素的生產性，在8分試管中接種製備的液體生產培養基[Komiyama, T.等著，The Journal of Antibiotics,(日本)，1977 年，第 30 卷，P. 619-621 (非專利文獻8) ] IOmL, 28°C培養2日後，將培養液ImL接種於製備於250mL容量三角燒瓶的同液體生產培養基20mL中，32°C振蕩培養7天。為了抽提菌體產物，將ImL的培養液、ImL的甲醇、70yL的50%H2S04裝入15mL容量的離心管，振蕩I小時後，冷藏過夜，2000 X g離心10分鐘，將其上清供HPLC分析。從所得生產性高的克隆株使用MagExtractor基因組DNA抽提機器(東洋紡績株式會社製造)按規程製備基因組DNA，通過引物pSET153-R(SEQ IDNO 3)與pSETermE_R(SEQID NO 4)的組合,使用 PrimeSTAR HS DNAPolymerase (TaKaRaBio 株式會社製造)按以下的循環條件進行了 PCR反應(98°C -10秒、60°C -5秒、72°C -I分X25次)。其結果，得到了約Ikbp的擴增DNA片段。對本DNA片段的鹼基序列進行了解析，結果可知顯示高生產性的克隆株中分別存在Q42L (42位的穀氨醯胺取代成亮氨酸)、K153T (153位的賴氨酸取代成蘇氨酸)、C270R(270位的半胱氨酸取代成精氨酸)的胺基酸取代。
[表2]
權利要求
1.一種酮還原酶突變體,其是可用於柔紅黴素衍生物的發酵生產的酮還原酶的突變體，其中，突變是在親本酮還原酶的胺基酸序列中插入、取代、或缺失I個或多個胺基酸，或者在親本酮還原酶的胺基酸序列的一個或兩個末端添加I個或多個胺基酸，且與使用親本酮還原酶時相比，柔紅黴素衍生物的生產性提高。
2.根據權利要求I所述的酮還原酶突變體,其中，親本酮還原酶包含與SEQID N0:1所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列。
3.根據權利要求2所述的酮還原酶突變體，其中，選自相當於SEQIDNO:l所示的胺基酸序列中的42、149、153、270和306位的胺基酸的位置的胺基酸中的I個或2個以上的胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代。
4.權利要求3所述的酮還原酶突變體，其中，相當於SEQID NO :1所示的胺基酸序列中的42位的胺基酸的位置的胺基酸被亮氨酸取代。
5.權利要求3所述的酮還原酶突變體，其中，相當於SEQID NO :1所示的胺基酸序列中的149位的胺基酸的位置的胺基酸被絲氨酸取代。
6.權利要求3所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQID NO :1所示的胺基酸序列中的153位的胺基酸相當的位置的胺基酸被脯氨酸以外的胺基酸殘基取代。
7.權利要求3所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQID NO :1所示的胺基酸序列中的270位的胺基酸相當的位置的胺基酸被精氨酸取代。
8.權利要求3所述的酮還原酶突變體，其中，與SEQID NO :1所示的胺基酸序列中的306位的胺基酸相當的位置的胺基酸被天冬氨酸取代。
9.權利要求廣8中任一項所述的酮還原酶突變體，其中，柔紅黴素衍生物是表柔紅黴素。
10.編碼權利要求f9中任一項所述的酮還原酶突變體的多核苷酸。
11.將權利要求10所述的多核苷酸導入本來具有生產柔紅黴素的能力的放線菌宿主而得到的、賦予了柔紅黴素衍生物生產能力的轉化體。
12.權利要求11所述的轉化體,其中，宿主放線菌是天藍淡紅鏈黴菌(Streptomycescoeruleorubidus)。
13.—種柔紅黴素衍生物的製造方法，其包括培養權利要求12所述的轉化體，並從培養液收集柔紅黴素衍生物的步驟。
14.通過權利要求13所述的製造方法得到的柔紅黴素衍生物。
全文摘要
本發明公開了可用於柔紅黴素(Daunorubicin)衍生物的有效生產的酮還原酶(Ketoreductase)突變體、編碼該突變體的DNA、導入了該DNA的生產柔紅黴素衍生物的轉化體、以及使用該轉化體的柔紅黴素衍生物製造方法。所述酮還原酶突變體中，氯伊瑞黴素生產菌(Amycolatopsis orientalis)的酮還原酶(EvaE)的胺基酸序列中的選自42、149、153、270和306位的胺基酸相當的位置的胺基酸中的1個或2個以上的胺基酸殘基被其他胺基酸殘基取代。
文檔編號C12P21/02GK102906258SQ20108006693
公開日2013年1月30日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者間塚風介, 福島崇惠, 隅田奈緒美, 矢內耕二 申請人:明治制果藥業株式會社