棒麴黴素的製備方法
2024-03-02 20:51:15
棒麴黴素的製備方法
【專利摘要】一種棒麴黴素的製備方法，包括發酵、分離、純化步驟。所製備的棒麴黴素，經高效液相色譜儀、核磁共振對產物進行分析鑑定，核磁共振的表徵數據以及質譜儀確定產物的分子量，確認所製備的產物為棒麴黴素。各項指標達到sigma公司同類產品的指標，產品的成本是sigma公司同類產品的1/380，大大降低了產品的成本。CCTCC NO：M20140402014.02.19
【專利說明】棒麴黴素的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物【技術領域】，具體涉及到棒麴黴素的製備方法。
【背景技術】
[0002] 棒麴黴素（Patulin，PAT)，又稱展青黴素，就是一種具有較強毒性的真菌代謝產 物，晶體無色稜形，分子式為C7H604,分子量為154,化學名稱為4-羥基4-氫-呋喃（3， 2 -碳）駢批喃-2(6_氫）酮[4-hydroxy-4-H-furo(3,2c)pyran_2(6H)-0ne]。在許多因黴 菌腐敗的水果，如蘋果、杏子、藍莓、櫻桃、葡萄、梨、桃子和李子及其製品中都有發現，以蘋 果發黴最易積累該種毒素。
[0003] 大量的研究表明，棒麴黴素具有基因毒性和細胞毒性，能導致哺乳動物細胞的DNA 損傷[Zhou SM等，2010]，染色體畸變和微核形成[Aives I等，2000 ;Melo FT等，2012]，並 具有致癌性，致畸性，免疫毒性和生殖毒性[Puel 0等，2010]，在動物活體內，會損害腎臟、 肝臟和腸等器官組織[Saxena N等，2011 ;Mohan HM等，2012]。因而它成為判斷食品質量 安全的一個重要指標，受到世界各國及國際組織的極大關注，例如歐盟在2004年就頒布了 限制含棒麴黴素食品進口的法令。
[0004] 隨著棒麴黴素汙染食品的問題日趨嚴重，對於其毒性、檢測方法和控制技術的研 究越來越廣泛。無論基礎研究還是檢測和控制研究，都需要大量的毒素樣品。而市售的棒 麴黴素標準品價格昂貴，如：Sigma公司98%以上純度的棒麴黴素 P1639-5MG(5mg)的價格 是1946. 88元人民幣，P1639-10MG (IOmg)的價格是3601. 26元人民幣。這大大增加了科學 研究工作的成本，一定程度上限制了研究工作。
[0005] 微生物具有代謝旺盛，酶活高，生長繁殖速度快，發酵不受季節和水土環境影響， 發酵產物產量高等優點，可利用其發酵製備各種真菌代謝產物，為大量獲得低成本、高純度 的棒麴黴素，保證檢測分析和控制去除技術研究對棒麴黴素標準品的需求提供新思路。本 專利利用高產該毒素的擴展青黴菌株在蘋果中發酵，分離純化發酵產物以製備高純度的棒 麴黴素，工藝方法簡單，製備成本低於目前的市售價格的1/380,可為棒麴黴素的深入研究 提供物質基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題在於克服上述棒麴黴素製備方法的缺點，提供一種制 備方法簡單、棒麴黴素產率高、產品成本低的棒麴黴素的製備方法。
[0007] 解決上述技術問題所採用的技術方案是包括下述步驟組成：
[0008] 1、發酵
[0009] 每個250mL三角瓶中裝入IOOg去皮蘋果塊作為培養基，加8層紗布塞，121 °C滅菌 20分鐘。將擴展青黴FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無菌 水製備成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個裝IOOg蘋果培養基的三角瓶中接入ImL濃度為 10 7cfu/mL的孢子懸液，28°C避光培養10天，獲得培養物。
[0010] 上述擴展青黴FP2菌株的篩選方法如下：
[0011] ⑴分離純化
[0012] 無菌接種針蘸取不同腐爛蘋果上的黴點，分別劃線接種於HM固體培養基平板 上，28°C培養。待長出的菌落有明顯孢子後，無菌接種針蘸取孢子分別劃線於PDA固體培養 基平板，28°C培養5天，挑取單菌落邊緣菌絲分別於PDA斜面上28°C培養7天，加入IOmL無 菌水，無菌接種針蘸取孢子懸液於PDA固體培養基平板上劃線，純化，28°C培養7天，分別挑 取單菌落於PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0013] ⑵篩選
[0014] 每IOOg去皮蘋果塊裝入250mL三角瓶中，加8層紗布塞，121 °C滅菌20分鐘，製成 無菌蘋果培養基；
[0015] 將分離得到的12株黴菌分別用PDA斜面28°C活化7天後，各加入無菌水製備成濃 度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取ImL孢子懸液接種於IOOg無菌蘋果培養基中，28°C培養 箱中避光培養8天，分別取出培養物，研磨，各加入IOOmL乙酸乙酯，180r/min避光振蕩抽提 1小時，靜置5?10分鐘分層，上層有機相用無水硫酸鈉過濾，下層培養物再次用IOOmL乙 酸乙酯抽提2次，合併3次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾後，40°C旋轉蒸發至乾燥，用 15mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存，每株黴菌平行2組，用0. 22 μ m水系濾膜 過濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T2008-2007 《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》進行檢測，相同條件下比較棒麴黴 素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒麴黴素含量最多。篩選出產棒麴黴素最多的菌株，命 名為擴展青黴FP2菌株（Penicillium expansum FP2)，於2014年2月19日保藏於武漢武 漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2014040。
[0016] 擴展青黴FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0017] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0018] 2、分離
[0019] 取培養物，分別研磨成糊狀，每IOOg加入乙酸乙酯IOOmL, 150?200r/min避光振 蕩抽提1小時，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養物中加入乙酸乙 酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙 酯抽提液，下層培養物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小 時，靜置5?10分鐘分層，合併三次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾，40°C旋轉蒸發至 乾燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0. 22 μ m水系濾膜過濾，得到棒麴黴素的 粗提取液。
[0020] 取棒麴黴素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國出入境檢驗檢 疫行業標準SN/T2008-2007《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》檢測 其中棒麴黴素含量。
[0021] 使用的色譜柱為：Diam〇nsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內徑），粒徑5 μ m。棒麴黴 素標準品，購於Sigma公司，準確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒麴黴 素標準品，吸取其中ImL的棒麴黴素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標準液，以棒麴黴素的出峰面積X為橫坐標，棒麴黴素含量Y為縱坐標，繪製標準曲線， 得到標準曲線回歸方程：
[0022] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0023] 根據繪出的標準曲線和測定出的棒麴黴素峰面積計算棒麴黴素的含量。
[0024] 3、純化
[0025] -70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素粗提取液至幹，用乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉蒸 發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷或三氯甲烷體 積比為1 : 20?40的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中 含有棒麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10? 15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0. 5?3的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析， 用石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0.5?3的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層 析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避光40°C旋轉 蒸乾，溶於5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物。
[0026] 上述薄層層析法的條件為：採用矽膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2 為展開劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對比觀察樣品與從Sigma公司購買棒麴黴素標 準品的Rf值。
[0027] 4、鑑定
[0028] 採用核磁共振分析儀，按儀器的使用方法對產物進行分析鑑定。用質譜分析儀，以 ESI電離方式對產物進行分析，確定產物的分子量。
[0029] 本發明的純化步驟3為：-70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥，用 IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析 純化，用丙酮與二氯甲烷的最佳體積比為1 : 30的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄 層層析法檢測每管洗脫液中含有棒麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避 光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙酸乙酯最佳體積比為I : 1的溶劑中；再次 200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯最佳體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，溼法裝 柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶 液合併，避光40°C旋轉蒸乾，溶於5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物。
[0030] 在製備棒麴黴素的發酵步驟1中，由於米用了擴展青黴FP2囷株，所製備的棒麴黴 素，經高效液相色譜儀、核磁共振對產物進行分析鑑定，核磁共振的表徵數據以及質譜儀確 定產物的分子量，確認所製備的產物為棒麴黴素。各項指標達到sigma公司同類產品的指 標，產品的成本是sigma公司同類產品的1/380,大大降低了產品的成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1是Sigma公司生產的棒麴黴素標準品的高效液相色譜圖。
[0032] 圖2是擴展青黴FP2菌株在蘋果培養基上發酵10天所得棒麴黴素粗提取液稀釋 100倍的高效液相色譜圖。
[0033] 圖3是棒麴黴素的純化產物溶於pH為4. 0的冰醋酸水溶液的高效液相色譜圖。
[0034] 圖4是棒麴黴素的1H-NMR譜圖。
[0035] 圖5是棒麴黴素的3C-NMR譜圖。
[0036] 圖6是Sigma公司公布的棒麴黴素核磁圖譜。
[0037] 圖7是棒麴黴素的ESI質譜分析圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。
[0039] 實施例1
[0040] 1、發酵
[0041] 取28個250mL三角瓶，每瓶裝入IOOg去皮蘋果塊作為培養基，加8層紗布塞， 121°C滅菌20分鐘。將擴展青黴FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面 加入無菌水製備成濃度為10 7cfu/mL孢子懸液，在每個裝蘋果培養基的三角瓶中接入ImL 濃度為107cfu/mL的孢子懸液，28°C避光恆溫培養10天，獲得培養物。
[0042] 2、分離
[0043] 取28瓶培養物，分別研磨成糊狀，每瓶加入乙酸乙酯IOOmL, 150?200r/min避光 振蕩抽提1小時，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養物中加入乙酸 乙酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸 乙酯抽提液，下層培養物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1 小時，靜置5?10分鐘分層，合併三次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾後，40°C旋轉蒸 發至乾燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL,用0. 22 μ m水系濾膜過濾,得到棒麴黴 素的粗提取液。
[0044] 取棒麴黴素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國出入境檢驗檢 疫行業標準SN/T2008-2007《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》檢測 其中棒麴黴素含量，見圖1，圖2。
[0045] 使用的色譜柱為：Diamonsil(E)C18柱，250mmX4. 6mm(內徑），粒徑5 μ m。棒麴黴 素標準品，購於Sigma公司，準確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒麴黴 素標準品，吸取其中ImL的棒麴黴素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標準液，以棒麴黴素的出峰面積X為橫坐標，棒麴黴素含量Y為縱坐標，繪製標準曲線， 得到標準曲線回歸方程：
[0046] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0047] 根據繪出的標準曲線和測定出的棒麴黴素峰面積計算棒麴黴素的含量。測得棒曲 黴素粗提取液中含有棒麴黴素 I. 35X 104mg/L，即含有棒麴黴素675mg。
[0048] 3、純化
[0049] 用蘋果培養基發酵擴展青黴FP2菌株製備棒麴黴素的粗提取液三批，每批30瓶， 高效液相色譜法檢測，方法與分離步驟2相同，所得粗提取液中共有棒麴黴素2. 139g。
[0050] -70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解， 40°C旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體 積比為1 : 30的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含有棒 麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的 石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 1的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液 中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避光40°C旋轉蒸乾，溶於5?15mL 的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物I. 509g。
[0051] 上述薄層層析法的條件為：採用矽膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2 為展開劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對比觀察樣品與從Sigma公司購買棒麴黴素標 準品的Rf值。
[0052] 4、鑑定
[0053] 採用氫核磁共振和碳核磁共振，按儀器的使用方法對產物進行分析鑑定。
[0054] 1H NMR和13C NMR核磁檢測：瑞士 fcuker公司，AVANCF300MHZ核磁共振儀，圖 譜見圖4和圖5,與Sigma公司公布的棒麴黴素核磁圖譜數據吻合，見圖6。數據表徵= 1H NMR(300MHz，CDC13)S 6.07-5.77(m，2H)，4.66(d，J = 17.2Hz，lH)，4.36(dd，J = 17.2， 3.9Hz，lH)，3.23(s，lH) ;13C NMR(75MHz，CDC13) δ168·60，149·83，146·26，111·19，107·48， 88.87,59. 56。這與棒麴黴素相關文獻數據吻合。
[0055] 用Bruker質譜儀對產物進行分析，確定產物的分子量。電離方式：ESI，圖譜見圖 7。C 7H6Na04(M+Na)+ :分子量計算值為 177. 0158,實測值為 177. 0160，C7H704(M+H)+ :實測值為 155. 0340,故純化的物質分子量為154,與棒麴黴素的分子量吻合。
[0056] 由以上的核磁共振的表徵數據以及質譜儀確定產物的分子量，確認採用擴展青黴 FP2(CCTCC N0:M2014040)菌株製備的產物為棒麴黴素。
[0057] 本實施例中，用蘋果培養基發酵擴展青黴FP2菌株製備棒麴黴素三批，每批30瓶， 所得粗提取液中共有棒麴黴素2. 139g，經過純化得到棒麴黴素產物I. 509g，溶於pH為4. 0 的冰醋酸水溶液中，高效液相色譜法檢測其純度大於等於98%，見圖3,成本為1350?1450 元人民幣，是購買Sigma公司同類產品銷售價格的1/380。
[0058] 實施例2
[0059] 在本實施例的純化步驟3中，_70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥， 用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層 析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1 : 20的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層 析法檢測每管洗脫液中含有棒麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋 轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200? 300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上 樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避 光40°C旋轉蒸乾，溶於5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物。該步驟中的 其它步驟與實施例1相同。
[0060] 其它步驟與實施例1相同。
[0061] 實施例3
[0062] 在本實施例的純化步驟3中，_70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥， 用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層 析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1 : 40的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層 析法檢測每管洗脫液中含有棒麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋 轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200? 300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上 樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避 光40°C旋轉蒸乾，溶於5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物。該步驟中的 其它步驟與實施例1相同。
[0063] 其它步驟與實施例1相同。
[0064] 實施例4
[0065] 在以上的實施例1?3的純化步驟3中，所用的二氯甲烷用等體積的三氯甲烷替 換。該步驟中的其它步驟與實施例1相同。
[0066] 其它步驟與實施例1相同。
[0067] 實施例5
[0068] 在以上的實施例1?3的純化步驟3中，用丙酮與二氯甲烷為洗脫劑矽膠柱層析 後，將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 0.5的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體 積比為1 : 0.5的洗脫劑洗脫，該步驟中的其它步驟與實施例1相同。
[0069] 其它步驟與實施例1相同。
[0070] 實施例6
[0071] 在以上的實施例1?3的純化步驟3中，用丙酮與二氯甲烷為洗脫劑矽膠柱層析 後，將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1 : 3的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積 比為1 : 3的洗脫劑洗脫，該步驟中的其它步驟與實施例1相同。
[0072] 其它步驟與實施例1相同。
[0073] 根據上述原理還可設計出另一種具體的棒麴黴素中的製備方法，但均在本發明的 保護範圍之內。
【權利要求】
1. 一種棒麴黴素的製備方法，其特徵在於包括下述步驟： (1) 發酵 每個250mL三角瓶中裝入IOOg去皮蘋果塊作為培養基，加8層紗布塞，121 °C滅菌20分 鍾；將擴展青黴FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無菌水製備 成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個裝IOOg蘋果培養基的三角瓶中接入ImL濃度為IO 7Cfu/ mL的孢子懸液，28°C避光恆溫培養10天，獲得培養物； (2) 分離 取培養物，分別研磨成糊狀，每IOOg加入乙酸乙酯l〇〇mL，150?200r/min避光振蕩 抽提1小時，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養物中加入乙酸乙酯 100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙酯 抽提液，下層培養物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小時， 靜置5?10分鐘分層，合併三次乙酸乙酯抽提液，用無水硫酸鈉過濾後，40°C旋轉蒸發至幹 燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL,用0. 22 μ m水系濾膜過濾,得到棒麴黴素的粗 提取液； 取棒麴黴素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行 業標準SN/T2008-2007《進出口果汁中棒麴黴毒素的檢測方法高效液相色譜法》檢測其中 棒麴黴素含量； 使用的色譜柱為：Diamonsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內徑），粒徑5 μ m ;棒麴黴素標 準品，購於Sigma公司，準確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解IOmg棒麴黴素 標準品，吸取其中ImL的棒麴黴素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L 的標準液，以棒麴黴素的出峰面積X為橫坐標，棒麴黴素含量Y為縱坐標，繪製標準曲線，得 到標準曲線回歸方程： Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994) 根據繪出的標準曲線和測定出的棒麴黴素峰面積計算棒麴黴素的含量； (3) 純化 -70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C 旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷或三氯 甲烷體積比為1 : 20?40的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗 脫液中含有棒麴黴素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於 10?15mL的石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0. 5?3的溶劑中；再次200?300目矽膠柱 層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比為1 : 0.5?3的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄 層層析法檢測每管洗脫液中含棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避光40°C 旋轉蒸乾，溶於5?15mL的乙酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物； 上述薄層層析法的條件為：採用矽膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1 : 2為 展開劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對比觀察樣品與從Sigma公司購買棒麴黴素標準 品的Rf值。
2. 根據權利要求1所述的棒麴黴素中的製備方法，其特徵在於所述的純化步驟（3) 為：-70°C，IOOPa冷凍乾燥棒麴黴素的粗提取液至乾燥，用IOOmL乙酸乙酯充分溶解，40°C 旋轉蒸發乙酸乙酯至10?15mL，200?300目矽膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比 為I : 30的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含有棒麴黴 素的情況；將含有棒麴黴素的洗脫液合併，40°C避光旋轉蒸發至幹，溶於10?15mL的石油 醚與乙酸乙酯體積比為I : 1的溶劑中；再次200?300目矽膠柱層析，用石油醚與乙酸乙 酯體積比為1 : 1的洗脫劑洗脫，溼法裝柱，幹法上樣，用薄層層析法檢測每管洗脫液中含 棒麴黴素的情況；將只含有棒麴黴素的溶液合併，避光4(TC旋轉蒸乾，溶於5?15mL的乙 酸乙酯中，靜止放置，得到棒麴黴素產物。
【文檔編號】C12P17/18GK104263777SQ201410408772
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】張曉瑞, 郭玉蓉, 柴永海, 馬瑜 申請人:陝西師範大學