一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法
2024-03-02 20:43:15
一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，將以牛肝臟為原料製備而來的穀氨酸脫氫酶粗提液，採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行穀氨酸脫氫酶的提取純化，取代了利用大量有機溶劑或無機鹽溶液等進行提取的複雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，大大降低了生產成本，另一方面將超濾濃縮產生的透過液重複回收利用，將每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了廢水的排放，是一種環境友好型生產工藝。另外，在搗碎過程中採用並補充預冷的磷酸鹽緩衝液，使搗碎過程始終處於低溫下進行，保證了穀氨酸脫氫酶的活性，所得穀氨酸脫氫酶酶活達到9000U/mg以上，產率達到21％以上。
【專利說明】一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法。
【背景技術】
[0002]穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase.⑶H)是參與穀氨酸新陳代謝的關鍵酶之一，它以NAD或NADP或者同時利用NAD和NADP作為輔酶，可逆的催化穀氨酸脫氨，使之形成Q.酮戊二酸和氨，從而參與到穀氨酸的合成與分解中，在生物體的碳、氮代謝中起著非常重要的作用。
[0003]尿素氦試劑盒主要用於臨床上血清以及血漿中尿素氮含量的測定，以此作為對肝臟、腎臟疾病的鑑別、診斷以及療效觀察的指標。雖然尿素氮含量測定的方法有許多，但脲酶.穀氨酸脫氫酶偶聯法以其獨特的優勢被廣泛使用。該方法不需要特殊儀器，操作簡單，還不受含氮化合物的幹擾，準確度較高，適用於自動分析。
[0004]在許多的動物組織中，包括:腦、肝臟、腎臟、心臟、胰腺、卵巢以及淋巴結等，都發現有穀氨酸脫氫酶的存在。動物體內的穀氨酸脫氫酶在催化反應發生時既可以NAD作為輔酶，又可以NADP作為輔酶，但以NAD作為輔酶的催化效率要高出以NADP作為輔酶的效率的數倍。目前，已有從牛腦、魚肝、牛肝、豬肝及鴨肝等組織中分離純化穀氨酸脫氫酶的報導。
[0005]目前國內報導的得到穀氨酸脫氫酶的方法有兩種:
[0006]一是發酵法生產，大連大學在申請號201210106727.9的專利中提到的一種方法方法是將產生的⑶H的微生物進行6-10次活化，再經過微生物定向馴化4-6次，使其在24-30°C的環境下生長，然後按照常規方法經過一級和二級種子罐，按照發酵液的3-9 %接種量接入發酵培養基中，在24-30°C中培養60-114小時得到含有穀氨酸脫氫酶的發酵液，然後經過發酵液的分離提取純化得到穀氨酸脫氫酶。西藏金稞集團公司在申請號為201110449716.6的專利中，提出了一種由穀氨酸棒桿菌發酵、製備粗酶液、離子交換層析、疏水分離等一系列的工藝得到最後產品穀氨酸脫氫酶。這類發酵工藝的主要弊端就是發酵產率低、工藝長而且複雜，導致生產成本很高。而且這些工藝目前都處於起步研究階段，穩定性和持續性很值得商榷。
[0007]二是從動物內臟中提取穀氨酸脫氫酶的工藝。
[0008]目前國內對從動物內臟中提取穀氨酸脫氫酶的工藝比較多，從工藝路線上來看大部分都大同小異，西藏金稞集團公司在申請號為201110422831.4的專利中提出了由動物內臟中提取穀氨酸脫氫酶的一種方法，大致工藝路線由動物內臟一絞碎一抽提一粗酶液一酸沉澱一硫酸銨鹽析一磷酸鈣凝胺吸附一離心一上清透析一冷凍、乾燥一試劑製備一穀氨酸脫氫酶成品，經過這大量的步驟得到最後的產品穀氨酸脫氫酶。這類型工藝的典型問題就是工藝路線長，而且工藝複雜，要用到大量的無機鹽沉澱，對環境造成不利影響的同時收率較低，而且生產過程中產生大量廢水，造成水資源的極大浪費。朱鴻、李想韻等人在生物工程2010，VOL0 31，N0.1中發表題目為鴨肝穀氨酸脫氫酶的純化與酶學性質研究的文章，其中涉及的穀氨酸脫氫酶提取工藝路線為:丙酮乾粉的製備一粗提液的製備一重金屬離子沉澱一硫酸銨分級沉澱一DEAE-Sepharose離子交換層析一Sephacryl S-200凝膠過濾柱層析，這類型工藝中要用到大量的有機溶劑，且和上一類型的工藝有同樣的缺點，工藝路線長，收率低，既不環保而且工藝複雜難於操作。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是針對現有的穀氨酸脫氫酶提取工藝的不足，提供一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，本發明以牛肝臟為原料製備穀氨酸脫氫酶粗提液，將所得粗提液採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行穀氨酸脫氫酶的提取及純化，取代利用大量有機溶劑提取、大量無機鹽沉澱等對環境汙染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進行重複利用，具有節能減排、經濟環保且酶活損失小的優點，適合工業化生產的要求。
[0010]本發明的技術方案為:
[0011]一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，
[0012]以牛肝臟為原料提取獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，將所得穀氨酸脫氫酶粗提液採用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以30_50L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度穀氨酸脫氫酶的穀氨酸脫氫酶濃縮液；
[0013]此外，還包括以下步驟:
[0014]步驟一、純化，將所得穀氨酸脫氫酶濃縮液採用superdex-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的穀氨酸脫氫酶母液；
[0015]步驟二、冷凍乾燥，將所得穀氨酸脫氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述穀氨酸脫氫酶。
[0016]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，所述穀氨酸脫氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟:
[0017]步驟一、將切碎的牛肝臟和預冷至5-10°C的磷酸緩衝液按照體積比1: 6-10混合後，進行搗碎20-30min，將搗碎後的物料於5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿；
[0018]步驟二、將所得牛肝勻漿在5-20°C條件下進行真空壓濾，收集過濾液既得所述穀氨酸脫氫酶粗提液。
[0019]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，搗碎過程中所用磷酸緩衝液的PH值為6.5-7.5，且在搗碎過程中至少補充一次預冷至5-10°C的磷酸緩衝液，補充的磷酸緩衝液的量以磷酸緩衝液的總加入量低於牛肝臟與磷酸緩衝液的最大體積比為準。
[0020]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，採用ΧΤΖ?_Φ260/Φ200真空過濾機，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進行真空壓濾。
[0021]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為6.5-7.5並預冷至5-10°C後，與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎。
[0022]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗。
[0023]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，步驟二中冷凍乾燥溫度為-55—60°C。
[0024]優選的是，所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，所用磷酸緩衝液的濃度均為 0.09-0.llmol/L。
[0025]本發明具有以下有益效果:首先，本發明將以牛肝臟為原料製備而來的穀氨酸脫氫酶粗提液，採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行穀氨酸脫氫酶的提取純化，取代了利用大量有機溶劑或無機鹽溶液等進行提取的複雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，大大降低了生產成本，另一方面由於可將超濾濃縮產生的透過液重複回收利用，將每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了一般提取工藝中大量廢水的排放，是一種環境友好型生產工藝，具有節能環保的優點。
[0026]其次，本發明在對牛肝臟的搗碎過程中採用預冷的磷酸鹽緩衝液，並在搗碎過程中補充預冷的磷酸鹽緩衝液，大幅度減少了在搗碎過程中由於機械摩擦升溫導致的酶失活，使搗碎過程始終處於低溫下進行，從而最大限度地保持了穀氨酸脫氫酶的活性，同時，由於提取過程中未採用有機溶劑及其他酸溶液進行沉澱，也避免了有機溶劑或酸溶液對穀氨酸脫氫酶造成一定的破壞，使本發明所述方法提取得到的穀氨酸脫氫酶酶活至少達到9000U/mg以上，甚至達到20000U/mg，產品回收率達到21 %以上，均高於現有的從動物內臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖對本發明做詳細說明，以令本領域普通技術人員參閱本說明書後能夠據以實施。
[0029]如圖1所示，一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其中，
[0030]以牛肝臟為原料提取獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，將所得穀氨酸脫氫酶粗提液採用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜為組件的超濾設備，本發明所採用濾膜為由吉林金賽提供的GP4012濾膜，孔徑為0.005 μ m，並以30_50L/h的流速進行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的肽鏈，收集超濾截留液得到含有高濃度穀氨酸脫氫酶的穀氨酸脫氫酶濃縮液；而將超濾透過液回收到儲蓄罐中，並利用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節透過液的pH值為6.5~7.5備用。在進行超濾濃縮之前先用純淨水對超濾設備進行衝洗，將超濾設備的管道及容器衝洗乾淨後再加入所述穀氨酸脫氫酶粗提液進行超濾濃縮。
[0031]此外，還包括以下步驟:
[0032]步驟一、純化，將所得穀氨酸脫氫酶濃縮液採用superdex-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱後，在進行凝膠過濾層析之前用濃度為0.09-0.llmol/L，pH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗，上樣後用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液對凝膠柱進行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的穀氨酸脫氫酶母液；所用superdex-200是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠混合後的產品，是最新的分子篩材料，和SephacrylS-200相比，具有剛性好、流速快的特點，更加適用於穀氨酸脫氫酶濃縮液的純化。
[0033]步驟二、冷凍乾燥，將所得穀氨酸脫氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述穀氨酸脫氫酶產品，冷凍乾燥溫度為-55—60°C，優選_60°C，所用冷凍乾燥儀器為FD — 27壓蓋型冷凍乾燥機。
[0034]所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，所述穀氨酸脫氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟:
[0035]步驟一、將新鮮牛肝臟用水洗淨後切碎，將切碎的牛肝臟和預冷至5-10°C的pH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液按照體積比1: 6-10混合後，用組織搗碎勻漿機進行搗碎20-30min，勻漿機轉速為2000-3000r/min，將搗碎後的物料於5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿，其中保持低溫的方式通過將搗碎後的物料置於冷凍機中進行攪拌來實現。可在進行搗碎之前先按照體積比加入預冷至5-10°C的磷酸緩衝液，在搗碎過程中至少補充一次少量的預冷至5-10°C的磷酸緩衝液，用以使物料在搗碎過程中始終保持一個低溫環境，有效避免溫度升高對穀氨酸脫氫酶酶活的降低，補充的磷酸緩衝液的量以磷酸緩衝液的總加入量低於牛肝臟與磷酸緩衝液的最大體積比為準。另外，本發明中所用的磷酸緩衝液的濃度均優選 0.lmol/Lo
[0036]步驟二、將所得牛肝勻漿在5_20°C條件下進行真空壓濾，由於過濾過程中具有一定的壓力，在壓力作用下有利於穀氨酸脫氫酶更充分地溶出，收集過濾液既得所述穀氨酸脫氫酶粗提液。本發明中採用XTZL-Φ 260/Φ 200真空過濾機，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進行真空壓濾。
[0037]所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為6.5-7.5並預冷至5-10°C後，替代磷酸緩衝液與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎，從而將超濾產生的大量透過液回收利用，實現提取工藝中的廢水零排放。
[0038]實施例1
[0039]將新鮮牛肝50kg用自來水洗淨，切碎，加入預冷至5°C的6倍體積的pH值為6.5的磷酸緩衝液中，用組織搗碎勻漿機搗碎20分鐘，並在搗碎至1min時補充I倍體積的預冷至5°C的磷酸緩衝液，然後保持5°C下緩慢攪拌3.0小時，得到牛肝勻漿，將所得牛肝勻漿在保持溫度10°C下用XTZL-Φ 260/Φ200真空過濾機，孔徑為0.5mm的棉綸濾布進行壓濾分離，過濾液為穀氨酸脫氫酶粗提液。先用純淨水衝洗超濾設備，確定超濾設備的管道及容器衝洗乾淨後，將待進行超濾的料液裝入超濾設備的原料槽，採用GP4012濾膜，以30L/h的流速進行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的母液既得所述穀氨酸脫氫酶濃縮液，而將透過液回收到儲罐中，然後調節透過液的PH值為6.5作為提取劑重複使用。將所得穀氨酸脫氫酶濃縮液採用superdex-200凝膠進行凝膠過濾層析,裝柱後,用濃度為0.lmol/L, pH值為
6.5的磷酸緩衝液衝洗,上樣後用濃度為0.lmol/L, pH值為6.5的磷酸緩衝液進行洗脫,流速為2.0L/h，收集洗脫液得到純化的穀氨酸脫氫酶母液。將純化後的穀氨酸脫氫酶母液用FD-27壓蓋型冷凍乾燥機，在_60°C冷凍乾燥，得到穀氨酸脫氫酶產品，酶活達到9000U/mg。
[0040]實例2.[0041 ] 將新鮮牛肝50kg用自來水洗淨，切碎，加入預冷至10°C的8倍體積的pH值為7.2的磷酸緩衝液中，用組織搗碎勻眾機搗碎25分鐘,並在搗碎至1min時補充I倍體積的預冷至10°C的磷酸緩衝液，然後保持10°C下緩慢攪拌4.0小時，得到牛肝勻漿，將所得牛肝勻漿在保持溫度10°c下用XTZL-Φ260/Φ200真空過濾機，孔徑為0.5mm的棉綸濾布進行壓濾分離，過濾液為穀氨酸脫氫酶粗提液。先用純淨水衝洗超濾設備，確定超濾設備的管道及容器衝洗乾淨後，將待進行超濾的料液裝入超濾設備的原料槽，採用GP4012濾膜，以30L/h的流速進行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的母液既得所述穀氨酸脫氫酶濃縮液，而將透過液回收到儲罐中，然後調節透過液的PH值為7.2作為提取劑重複使用。將所得穀氨酸脫氫酶濃縮液採用superdex-200凝膠進行凝膠過濾層析,裝柱後,用濃度為0.lmol/L, pH值為7.2的磷酸緩衝液衝洗,上樣後用濃度為0.lmol/L, pH值為7.2的磷酸緩衝液進行洗脫，流速為3.0L/h，收集洗脫液得到純化的穀氨酸脫氫酶母液。將純化後的穀氨酸脫氫酶母液用FD-27壓蓋型冷凍乾燥機，在_60°C冷凍乾燥，得到穀氨酸脫氫酶產品，酶活達到10000U/
mg ο
[0042]儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於， 以牛肝臟為原料提取獲得穀氨酸脫氫酶粗提液，將所得穀氨酸脫氫酶粗提液採用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以30_50L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度穀氨酸脫氫酶的穀氨酸脫氫酶濃縮液； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、純化，將所得穀氨酸脫氫酶濃縮液採用superdex-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液進行洗脫，流速為2.0-3.0L/h,收集層析洗脫液得到純化的穀氨酸脫氫酶母液； 步驟二、冷凍乾燥，將所得穀氨酸脫氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述穀氨酸脫氫酶。
2.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，所述穀氨酸脫氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟: 步驟一、將切碎的牛肝臟和預冷至5-10°C的磷酸緩衝液按照體積比1: 6-10混合後，進行搗碎20-30min，將搗碎後的物料於5_10°C攪拌3_5h，得到牛肝勻漿； 步驟二、將所得牛肝勻漿在5-20°C條件下進行真空壓濾，收集過濾液既得所述穀氨酸脫氫酶粗提液。
3.如權利要求2所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，搗碎過程中所用磷酸緩衝液的pH值為6.5-7.5，且在搗碎過程中至少補充一次預冷至5-10°C的磷酸緩衝液，補充的磷酸緩衝液的量以磷酸緩衝液的總加入量低於牛肝臟與磷酸緩衝液的最大體積比為準。
4.如權利要求2所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，採用XTZL-Φ 260/Φ 200真空過濾機，孔徑為0.4-0.6mm的棉綸濾布對牛肝勻漿進行真空壓濾。
5.如權利要求2所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為6.5-7.5並預冷至5-10°C後，與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎。
6.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為6.5-7.5的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗。
7.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，步驟二中冷凍乾燥溫度為-55—60°C。
8.如權利要求3或6所述的從牛肝臟中提取穀氨酸脫氫酶的方法，其特徵在於，所用磷酸緩衝液的濃度均為0.09-0.llmol/L.
【文檔編號】C12N9/06GK104178465SQ201410408915
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】張春穎, 楊旭錦 申請人:西藏天虹科技股份有限責任公司