菸草番茄紅素β環化酶基因及其應用的製作方法

2024-03-01 06:33:15 2

菸草番茄紅素β環化酶基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種菸草番茄紅素β環化酶基因，其鹼基序列如SEQIDNO：1所示。本發明研究了Ntβ-LCY基因在菸草不同時期不同器官中的轉錄水平表達模式，發現該基因主要表達在幼葉中；利用OE和RNAi兩種方法研究了Ntβ-LCY基因在表達量變化情況下對菸草植株生長發育情況及色素含量的影響，分析了Ntβ-LCY基因在菸草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明確而有針對性地對該基因開展研究；其次是採用穩定的轉基因技術分析基因功能。
【專利說明】菸草番茄紅素β環化酶基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物基因工程領域，具體地，本發明涉及菸草類胡蘿蔔素合成關鍵基 因，涉及β-番茄紅素環化酶基因（Nti3-LCY)在類胡蘿蔔素合成及植物生長發育中的重要 作用。

【背景技術】
[0002] 類胡蘿蔔素是生物體內通過類異戊二烯途徑合成而呈現黃色、橙紅色和紅色的 一類萜類物質。類胡蘿蔔素在植物光合作用中承擔著光吸收的重要功能，主要存在於植 物葉片的葉綠體及許多花和果實的有色體中，具有吸收和傳遞電子的能力，並在清除光合 作用中產生的葉綠素三線態和單線態及超氧陰離子等自由基方面起著重要的作用。另一 方面，類胡蘿蔔素在光抑制條件下能通過葉黃素循環，以非光化學輻射的方式耗散光系統 II (PSII)的過剩能量，保護葉綠素免受氧化損傷的破壞。此外，類胡蘿蔔素也是植物激素脫 落酸（ΑΒΑ)合成的前體物，ΑΒΑ廣泛地參與植物生長周期發育的各個環節和抗逆過程。所 以類胡蘿蔔素在植物生長發育過程中具有重要的作用。
[0003] 番茄紅素環化是植物體內類胡蘿蔔素生物合成途徑的一個重要分枝點。植物體 中存在兩種環化酶，一種是番茄紅素環化酶（β-LCY)，在其催化下，番茄紅素轉化為 胡蘿蔔素，進而生成玉米黃質、紫黃質、新黃質等葉黃素，另一種是番茄紅素 ε-環化酶 (ε-LCY)，與β-LCY共同作用下生成α-胡蘿蔔素，進而生成黃體素等。β-LCY和ε-ΙΧΥ 兩個酶的活性在一定程度上決定了兩個分枝產物β-胡蘿蔔素、紫黃質、玉米黃質和黃體 素等類胡蘿蔔素物質的比例及類胡蘿蔔素的總量。
[0004] 菸草是重要的經濟作物，在發展地方經濟、增加國家財政積累方面有突出作用。煙 葉中類胡蘿蔔素含量與菸葉品質之間存在正相關關係，一方面菸葉外觀品質與類胡蘿蔔素 成分含量直接相關，另一方面類胡蘿蔔素是菸草香氣成分的重要前提物質，對菸草的香氣 量和香氣質有直接作用。研究表明類胡蘿蔔素是影響烤菸香氣質量重要的萜烯類化合物， 其降解產物佔菸葉總揮發性香氣成分的8% -12%。類胡蘿蔔素的降解和熱裂解產物可生 成近百種香氣化合物，如巨豆三烯酮、β-大馬酮等，這些香味物質閾值相對較低，刺激性較 小，對菸葉香氣貢獻率大，是形成烤菸細膩、高雅和清新香氣的主要成分。因此，在菸草中尋 找類胡蘿蔔素合成過程中起關鍵作用的基因並探索其應用將具有重要的意義。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是通過同源克隆的方式，從栽培菸草紅花大金元體內克隆獲得 Nt β-LCY基因編碼區序列，並且進行了表達模式分析。利用穩定的轉基因技術過量表達 (overexpression, 0Ε)和 RNA 幹涉（RNA interference, RNAi)方法研究了 Ν?β -LCY 基因在 表達量變化情況下對菸草植株的生長發育情況的影響及類胡蘿蔔素含量的影響。本發明旨 在探索Nt β -LCY基因在菸草中的功能，是否直接控制著類胡蘿蔔素的含量，該研究結果能 夠為利用基因工程技術培育優良品種提供理論依據和基因資源。
[0006] 本發明的技術方案是：菸草番茄紅素 β環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0007] 菸草番茄紅素 β環化酶基因，其RNAi序列如SEQ ID NO :2所示。
[0008] 所述的菸草番茄紅素 β環化酶基因的應用，所述菸草番茄紅素 β環化酶基因提 高菸草類胡蘿蔔素含量。
[0009] -種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，通過過表達和RNA幹涉技術研究了該基因 功能，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
[0010] 所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，以所述菸草番茄紅素 β環化酶基因的 編碼核酸片段作為功能序列，將該序列插入到含有35S啟動子的表達框下，該表達框屬於 植物雙源表達載體的一部分，構建菸草番爺紅素 β環化酶基因的過表達載體。
[0011] 首先，研究了 Nt β -LCY基因在菸草不同時期不同器官中的轉錄水平表達模式，發 現該基因主要表達在幼葉中；利用0Ε和RNAi兩種方法研究了 Nt β -LCY基因在表達量變化 情況下對菸草植株生長發育情況及色素含量的影響，分析了 Nti3-LCY基因在菸草中的重 要功能。首先是先得到基因，可以明確而有針對性地對該基因開展研究；其次是採用穩定的 轉基因技術分析基因功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :定量PCR分析普通菸草中不同時期、（Stagel-Stage4分別為還苗期、打頂期、 盛花期和成熟期）的各類器官（根-R、莖-S、葉-L (5葉位-5L，10葉位-10L，15葉位-15L)、 花-F，）中Nt β -LCY基因的轉錄表達模式；
[0013] 圖2 :定量PCR分析低溫弱光脅迫下Nti3 -LCY基因表達模式，C0N為正常條件下基 因相對表達量；LL為低溫弱光下基因相對表達量；
[0014] 圖3 :Nt β -LCY轉基因表型，C0N為菸草未轉基因對照植株；0E為Nt β -LCY過表 達植株；RNAi為Nt β -LCY-RNAi轉基因植株；
[0015] 圖4 :Nt β -LCY-RNAi轉基因沉默效果，NT為未轉基因對照植株；Nt β -LCY-RNAi 為轉基因植株；
[0016] 圖5 :Nt β -LCY-RNAi轉基因株系中色素含量，NT為未轉基因對照植株； Nt β -LCY-RNAi為轉基因植株；
[0017] 圖6 :Nt β -LCY-0E轉基因植株篩選；
[0018] 圖7 :Nt β -LCY-0E轉基因植株β -LCY基因表達量分析，NT為未轉基因對照植株； Nt β -LCY-0E為轉基因植株；
[0019] 圖8 :NtP-LCY-〇E轉基因株系中色素含量，NT為未轉基因對照植株；NtP-LCY-OE 為轉基因植株。

【具體實施方式】
[0020] 菸草番茄紅素 β環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0021] 菸草番茄紅素 β環化酶基因，其RNAi序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0022] 所述的菸草番茄紅素 β環化酶基因的應用，所述菸草番茄紅素 β環化酶基因提 高菸草類胡蘿蔔素含量。
[0023] -種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，通過過表達和RNA幹涉技術研究了該基因 功能，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
[0024] 所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，以所述菸草番茄紅素 β環化酶基因的 編碼核酸片段作為功能序列，將該序列插入到含有35S啟動子的表達框下，該表達框屬於 植物雙源表達載體的一部分，構建菸草番爺紅素 β環化酶基因的過表達載體。
[0025] l、Nt@-LCY基因的同源克隆
[0026] 通過NCBI-Blastn搜索到Nt β -LCY基因所有的EST序列，在ATG和TGA處設計保 守引物。分別以普通菸草cDNA和基因組DNA為模板進行PCR擴增，回收目的片段，Τ-Α連 接，轉化大腸桿菌（DH5a)感受態，37°C培養，菌落PCR鑑定得到陽性克隆。陽性質粒提取， 最後進行質粒酶切鑑定和測序得到普通菸草Nt β -LCY編碼區全長及基因全長序列。獲得 Ν?β-ΙΧΥ編碼區（CDS)全長序列1503bp，共編碼500個胺基酸，Ν?β-ΙΧΥ基因全長1503bp， 所以Nt β -LCY基因在菸草中不存在內含子。
[0027] 具體步驟如下所述：
[0028] 所用引物為 5' -ATGGATACATTGTTGAAAACCCCAAAT-3' 和 5' -TTCTGTATCCTGTAACAAAT TGTTGATC-3'。作為模板的cDNA和DNA都來自栽培菸草紅花大金元旺長期幼葉片（RNA和DNA 提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取試劑盒說明書進行）。按照Reverse transcription system試劑盒說明書，以01igo(dT)18(TaKaRa公司）為引物合成cDNA第一鏈。PCR反應條 件為 94°C，3min ;94°C，30s，58°C，30s，72t：，l· 5min，35cycles ;72°C，10min ;4°C，pause。反 應體系 50 μ L :cDNA 或 DNA 模板 2 μ L，上下遊引物各 5 μ L (10 μ Μ)，dNTPs 4 μ L (10 μ Μ)， 10 X Buffer 5 μ L，HiFi酶（北京全式金生物技術有限公司）0.5 μ L，無菌水33. 5 μ L。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒（GelExtraction KIT，購自QIAGENE)從瓊 脂糖凝膠上純化目標Nt β-LCY DNA片段（方法參照試劑盒說明書），用Eppendorf公司 BioPhotometer測定濃度後用於酶切、連接或存-20°C備用。純化的Nt β -LCYDNA片段與 PMD19-T載體（TaKaRa公司，氨苄黴素抗性）連接（Solution I，TaKaRa公司，按照試劑盒 說明書操作），熱激轉化（42°C 90s)入大腸桿菌DH5 a (TaKaRa公司）。從得到的克隆轉化 子中用菌落PCR(引物為上述擴增引物）鑑定陽性克隆，提取陽性克隆質粒（小提質粒試劑 盒，QIAGENE，方法參照試劑盒說明書進行）。
[0029] 2、Nt β -LCY表達模式分析
[0030] 採集栽培菸草的各個時期（還苗期、打頂期、盛花期和成熟期）的各類器官（根、 莖、5葉位，10葉位，15葉位、花）樣品，並提取它們的總RNA，反轉錄成為cDNA(方法如1所 述）。定量PCR (BI0-RAD，USA)分析Nt β -LCY時空表達模式及低溫弱光脅迫條件下的表達 模式。如附圖1中所示，Nti3-LCY在盛花期表達量較高，且多表達在幼葉中（表達水平：10 葉位> 15葉位> 5葉位>花彡莖>根）。在低溫弱光脅迫下，Nt β -LCY表達量有顯著變 化，說明該基因是受低溫弱光脅迫條件誘導表達基因 。Nt β -LCY表達量在6h時呈下升趨 勢，12h以後表達量逐漸提高，在24h達到最大（見圖2)。轉錄水平表達模式的研究結果表 明，該基因與植物的生理狀態密切相關，在煙株光合生理較為強盛的幼嫩組織表達量較高， 且能夠被光抑制條件誘導，參與煙株抵禦光抑制的過程，其生物學功能應該與光合生理過 程存在密切的關係。
[0031] 表達模式分析所用菸草器官樣品均在雲南大田採樣，所用的定 量弓I 物為 Ntβ-LCY-Q-F/R,5' 一GATGACAATACAACTAAAGATCTTGATAG-3 和 5'-CATAAGCTACTTGATATCCAGGAT-3'。採用 26s RNA 作為內參。PCR 擴增反應條件：95°C預 變性 3min ;95°C 20s, 60°C 20s, 40 個循環。反應體系：1 μ L cDNA，10μ L SYBR Green,上下 遊引物各1 μ L(l〇 μ mol/L)，補ddH20至20 μ L。低溫弱光處理條件：100 μ mol nT2s- S 4°C。
[0032] 3、菸草中RNAi介導的基因沉默研究Nt β -LCY基因功能
[0033] 為了更確切的了解Nti3-LCY基因在菸草中的功能，我們利用穩定的轉基因技術 採用RNAi方法對該基因進行體內功能研究。構建Nt β -LCY基因 RNAi載體轉化農桿菌 GV3101，利用農桿菌介導的遺傳轉化技術轉化SR1普通菸草，採用卡那抗性基因進行陽性 植株篩選，得到轉化成功的菸草植株。轉基因菸草植株葉片出現明顯的光漂白或黃化現象， 植株嚴重矮化（圖3)，生長的進行，葉片越髮漂白，部分植株逐漸的死掉。並對生存下來的 煙株樣品進行培養，直至接種子，然後用T2代煙株菸葉進行Nt β -LCY基因轉錄表達分析及 代謝物分析。定量PCR結果顯示，在RNAi轉基因煙株中Nt β -LCY基因表達量顯著降低（圖 4)，沉默效率高達90%。利用HPLC對類胡蘿蔔含量進行分析，發現β-胡蘿蔔素、紫黃質、 新黃質及黃體素（Lutein)類胡蘿蔔素及葉綠素 a和b含量明顯下降（圖5)。轉基因 RNAi 結果表明，Nti3-LCY基因對煙株的雙環葉黃素的生成有重要影響，而雙環葉黃素對植株生 長發育起著至關重要的作用，是生物體不可或缺的重要組成部分，主要控制著植物類胡蘿 卜素等色素物質合成，進而影響著植物的光合作用。
[0034] 具體方法如下所述：
[0035] 採用Gateway重組技術，利用pHellsgate2 (壯觀黴素抗性）載體構建轉化菸草 的 RNAi 載體。引物是 5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACGAGGAAGCTAAATCTATGC-3'（帶有 attBl 接頭）和 5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATACGTAATCCAGGACGAGCA AC-3'（帶有attB2接頭）。PCR反應以1中Nt β -LCY-T為模板進行擴增，產物膠回收純 化。然後進行ΒΡ重組實驗。體系如下：attB-PCR產物（100ng/yL)2.5yL，pHellsgate 2 vector(400ng/μ L)0. 4 μ L, BP clonase II enzyme mix 2 μ L,補充 TE Buffer (pH 8. 0) 5. 1 μ L至10 μ L體系，25°C反應3h，加入1 μ L K蛋白，37°C溫浴10min，然後取1 μ L反 應液熱激轉化大腸桿菌DH5 α，經菌落PCR鑑定陽性克隆，並提質粒進行酶切驗證，確認正 確後，得到pHellsgate2-Nt0-LCY-RNAi質粒。然後轉入農桿菌感受態GV3101中，挑取適 量的轉化菌斑PCR鑑定無誤後搖菌轉化菸草植株。
[0036] 質粒轉化農桿菌：取pHellsgate2_Nti3 -LCY-RNAi質粒1 μ L，加入含0· lmL的 GV3101農桿菌感受態的EP管中，冰上放置30min ;將含有該質粒的農桿菌感受態放入液氮 速凍lmin，然後37°C溫育5min ;加入lmL LB液體培養基，28°C震蕩培養3h ;5, OOOrpm離心 lmin，棄去上清，加入200 μ L LB液體培養基，重懸沉澱；取200 μ L重懸液（即轉化產物） 均勻地塗於含25mg/mL利福平（Rif, Sigma)和50mg/mL壯觀黴素（Spe, Sigma)的LB平板 上，28°C培養2-3天；挑取適量的轉化菌斑PCR鑑定無誤後，搖菌轉化SR1普通煙苗。
[0037] 農桿菌轉化菸草：將鑑定無誤的農桿菌接種於5mL LB液體培養基中（含25mg/mL 利福平和50mg/mL壯觀黴素），28°C震蕩培養過夜，次日以1:100的比例轉移至50mL LB液 體培養基中（含25mg/mL利福平和50mg/mL壯觀黴素），28°C震蕩培養至0D6(?為0· 8左右； 離心收集菌體，用5〇1111^轉化培養基]\^(|&!15.9，]\111四8]1丨86&3]1〇〇8]\16(1;[11111，購自011(3]161^ Biochemia)懸浮該農桿菌，採用浸泡法轉化菸草葉片，即將切成片狀的葉片浸泡在含有目 標載體的農桿菌培養基中2min。然後取出葉片貼在不含抗生素的MS固體培養基上28 °C暗 培養2天，2天後移到含有卡那黴素和頭孢黴素（購自Sigma)的MS分化培養基上等待分 化，7-10天換一次培養基。分化後轉移到生根培養基上直至長出根後，移栽在土中，按正常 的方法培育植株至結實，收穫成熟種子。
[0038] 菸草正常培養條件：培養條件為（28± 1) °C，光照16h，黑暗8h，（60±2) %的相對 溼度。
[0039] 4、菸草中過量表達Nti3_LCY基因，能夠增加類胡蘿蔔素含量
[0040] 類胡蘿蔔素不但對植物的生長發育有重要影響，而且對菸草的香味品質有重要的 貢獻，為了更全面的了解Nti3_LCY基因在菸草中的功能，探索如何增加菸草中類胡蘿蔔素 含量，利用穩定的轉基因技術採用過量表達的方法對Nti3_LCY的功能進行了進一步的研 究。首先構建Nt β -LCY基因0E載體轉化農桿菌GV3101，利用農桿菌介導的遺傳轉化技術 轉化SR1普通菸草，採用跨目標基因和標籤蛋白Flag基因引物進行陽性植株篩選（圖6)， 並對β -LCY表達量進行定量PCR分析，發現轉基因煙株β -LCY表達量顯著升高（圖7)，得 到轉化成功的菸草植株。對Τ2代Nt β -LCY基因過量表達轉基因煙株菸葉樣品進行代謝分 析，發現β-胡蘿蔔素、紫黃質、新黃質及黃體素類胡蘿蔔素及葉綠素 a和b含量明顯增加 (圖8)，菸草植株生長狀態良好（圖3)。轉基因 RNAi和0E結果表明，Nt β -LCY基因對煙株 類胡蘿蔔素合成及生長發育至關重要，是類胡蘿蔔素合成通路上的關鍵基因，其表達水平 直接關係到菸草的生長狀況，進而影響著菸草菸葉的產量及質量。在菸草中開展Nti3-LCY 基因的功能研究為其它植物的研究工作打下了很好的基礎，同時該研究結果可以從源頭上 提高菸葉品質，為菸草利用基因工程技術培育優良品種提供理論依據和基因資源。
[0041] Nt β -LCY-0E載體構建具體方法如下所述：
[0042] 構建 Nt β -LCY-0E 所用引物是 Nt β -LCY-spl300-SpeI-F :5'-GCACTAGTATGGATACA TTGTTGAMACCCCMATMG-3'（帶有 Spel 酶切位點）和 NtP -LCY-spl300-KpnI-R :5'-TAGGTAC CTTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATCAT-3'（帶有 Kpnl 酶切位點）。PCR 反應以 1 中 Nt β -LCY-T 為模板進行擴增，產物膠回收純化，使用Spel和ΚρηΙ酶切PCR回收片段和spCAMBIA1300 載體（由PCAMBIA1300,載體改造而來，在多克隆酶切位點後加入Flag標籤蛋白），回收目 的片段並連接，轉化細菌（DH5 a，TaKaRa公司），菌落PCR鑑定陽性克隆，提質粒得到目的 載體Nt β -LCY-0E，酶切驗證並測序確認序列正確並無移碼情況。然後轉入農桿菌感受態 GV3101中，囷落PCR鑑定陽性後，搖囷，按照3中步驟轉化煙早植株。跨目標基因和標籤蛋 白 Flag 基因引物序列為：Nt β -LCY-0E-JC-F5' -CGGTATGGATATTCTTCTGAAGCTTG-3 和？1&8-R5' -CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCG-3'。
[0043] 質粒轉化農桿菌：將Nt β -LCY-0E質粒按照3中步驟轉入農桿菌，然後將轉化產物 均勻地塗於含25mg/mL利福平（Rif, Sigma)和50mg/mL卡那黴素（kana, Sigma)的LB平板 上，28°C培養2-3天；挑取適量的轉化菌斑PCR鑑定無誤後，搖菌轉化SR1普通煙苗。
[0044] 農桿菌轉化菸草：將鑑定無誤含有Nt β -LCY-0E質粒的農桿菌按照3中方法轉化 菸草，培養菌所用培養基中含25mg/mL利福平和50mg/mL卡那黴素。
【權利要求】
1. 菸草番茄紅素，環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 菸草番茄紅素，環化酶基因，其RNAi序列如SEQ ID NO :2所示。
3..如權利要求1所述的菸草番茄紅素，環化酶基因的應用，其特徵在於：所述菸草 番茄紅素々環化酶基因提高菸草類胡蘿蔔素含量。
4. 一種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，其特徵在於：通過過表達和RNA幹涉技術研 究了該基因功能，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
5. 如權利要求4所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，其特徵在於：以所述菸草番 茄紅素，環化酶基因的編碼核酸片段作為功能序列，將該序列插入到含有35S啟動子的表 達框下，該表達框屬於植物雙源表達載體的一部分，構建菸草番爺紅素 A環化酶基因的過 表達載體。
【文檔編號】C12N15/61GK104152474SQ201410405713
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】王燃, 史豔梅, 羅朝鵬, 李鋒, 劉萍萍, 武明珠, 金立鋒, 魏春陽, 魏攀, 陳霞, 鄭慶霞, 林福呈, 楊軍, 屈凌波 申請人:中國菸草總公司鄭州菸草研究院