一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法
2024-04-05 01:04:05
專利名稱：一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法
技術領域：
本發明屬於植物育種領域，涉及一種辣椒感疫病育種材料的淘汰方法， 特別涉及一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法。利用該方法可 將辣椒感疫病育種材料在其生長的早期階段予以淘汰，具有周期短、成本低、 結果可靠等優點，且不影響對其他性狀的觀察，可節約大量的人力、物力及
土地資源，並大大提高育種效率。
背景技術：
辣椒疫病是由疫黴菌(屍AF^。/^y^ra L.)引起的一種毀滅性
土傳病害，在世界各地均有發生，我國則有逐年加重的趨勢。該病大流行時， 田間辣椒成片萎蔫直至全部死亡，致使辣椒的產量急劇減少，甚至絕收。
選育辣椒抗疫病品種是防治該病害最經濟有效的途徑之一，但辣椒對疫 病的抗性既存在垂直抗性，也存在水平抗性，在某些育種材料中，垂直抗性 和水平抗性共存。另外，不同辣椒育種材料對疫病的抗性呈現"遺傳多樣化" 的特點，表現為單基因遺傳、寡基因遺傳和多基因遺傳共存。這樣，直接篩 選抗病育種材料進行辣椒抗疫病新品種選育就會存在鑑定結果不準確、育種 周期長及新品種抗性不穩定等諸多局限。
將感病育種材料淘汰是辣椒抗疫病育種的另一種可行途徑，不僅可以避 免辣椒抗疫病性鑑定困難的問題，而且能夠最大限度地保留抗病育種材料的 遺傳多樣性，最大限度地滿足其他不同育種目標的實現。
目前使用的淘汰辣椒感疫病育種材料的主要方法是人工苗期接種，這種 方法操作繁瑣、易受環境影響，鑑定結果不準確、不穩定。利用分子標記進 行辣椒感疫病育種材料的淘汰具有操作簡單，結果可靠，不受環境影響，鑑定成本低等優點。發明人利用cDNA-AFLP技術獲得了接種疫黴菌後在辣椒感 疫病育種材料中特異誘導表達的基因，根據此基因的核苷酸序列設計特異引 物即可獲得感疫病辣椒育種材料的分子標記，以用於感疫病辣椒育種材料的 快速淘汰，加快辣椒抗疫病優良新品種的選育進程。
發明內容
針對上述辣椒育種材料抗疫病性鑑定中存在的問題，本發明的目的在 於，提出一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法。該方法利用分 子標記技術在生長早期階段淘汰感疫病的辣椒育種材料，具有周期短、成本 低、結果可靠等優點，且不影響對其他性狀的觀察，可節約大量的人力、物 力及土地資源，並大大提高育種效率。
為了實現上述目的，本發明採用如下的技術解決方案 一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，其特徵在於，具體 過程包括如下步驟 '
(1) 將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種於育苗盤進行常規管理，待 幼苗長至3 4片真葉時，用改良SDS法分別提取不同育種材料幼嫩葉片的 基因組DNA;
(2) 以上述幼嫩葉片的基因組DNA為模板，利用分子標記的正反向引 物進行PCR擴增反應；
上述PCR擴增反應所用分子標記的正向引物的核苷酸序列為5' -ctg tgatatggaagggg認c-3 ，， 反向弓l物的核苷酸序歹廿為5, -認tcgctggg 朋aagaatg-3，。
上述PCR擴增反應的總體積為25uL，其中含1X擴增Buffer, 10ng 25ng模板DNA， 2. 0mmol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L 的反向引物，0.2 mmol/L的dNTPs， 0. 5 U ra《DNA聚合酶。
上述PCR擴增反應的程序為95"C預變性5min，再進入PCR循環，循環程序為94。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進行34個 循環，最後在72t:下延伸10min， 4"C保存。
(3) PCR擴增產物在1. 2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，溴化乙錠染色， 利用凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果；
(4) 對電泳結果進行如下判定 若電泳結果顯示能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，說明該育種材
料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；
若電泳結果顯示不能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，說明該育種 材料為抗疫病辣椒育種材料，可用於進一步的辣椒抗疫病新品種選育。
本發明的方法和人工苗期接種方法相比，具有下述技術效果
(1) 利用本發明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，可在育種材料生長 的早期階段進行，而不影響對其他性狀的觀察。
(2) 利用本發明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，可靠性高，不受外 界環境條件影響。
(3) 利用本發明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，所需周期短，可在 1 2天內得到篩選結果。
(4) 利用本發明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，所需成本低，僅為 2元/份 3元/份育種材料。
圖1為利用本發明的方法對公認的辣椒抗疫病育種材料CM334和感疫病 育種材料Early Calwonder的淘汰結果。圖中，第1泳道為CM334，無990bp 條帶；第2泳道為Early Calwonder，有990bp條帶；第3泳道為DNA分子量標 準DL2000。
圖2為利用本發明的方法對抗疫病辣椒育種材料CM334、感疫病辣椒育種 材料Early Calwonder,以及A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性未知的辣椒育種材料的鑑定結果。其中，第1泳道和第2 4 泳道分別為Early Calwonder和其他3份感疫病育種材料(B27、茄門和2096)， 有990 bp條帶出現。第5泳道和第6 10泳道分別為CM334和其他5份抗疫病育 種材料(A2、 All、 B19、 2056、 2031)，無990bp條帶出現。第11泳道為DNA 分子量標準DL2000。
以下結合附圖和應用實例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發明是利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，首次利用分子 標記技術對辣椒感疫病育種材料在生長早期階段進行淘汰，其具體步驟如
下
(1) 將抗疫病性未知的育種材料播種於育苗盤進行常規管理，溫度保
持在25。C 30。C、相對溼度50% 70%，光照3000 4000 Lx。待幼苗長至3 4片真葉時，用改良SDS方法(鞏振輝等，以PCR鑑定轉基因植株的微量DNA 提取方法[J].西北農業大學學報，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同育 種材料幼嫩葉片的基因組DNA，用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，並用1X TE緩衝溶液將DNA濃度調至25ng/ u L。
(2) 以上述基因組DNA為模板，根據發明人獲得的接種疫黴菌後在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導表達的基因序列設計分子標記的正反向引物 進行PCR擴增反應。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaagg gg獄c -3，，反向弓i物的核苷酸序歹廿為5，-認tcgctgggaaa卿atg-3，0
PCR擴增反應的總體積為25u L，其中含1X擴增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. 0 mmol/L的MgCl2， 0.4 umol/L的正向引物，0.4umol/L的 反向引物，0.2ramol/L的dNTPs， 0. 5 U 7a《DNA聚合酶。其中，PCR擴增的 反應程序為95"C預變性5min，再進入PCR循環，循環程序為94"C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進行34個循環，最後在72""C下延伸10min， 4'C保存。PCR擴增反應在美國Bio-rad DNA擴增儀上進行。
(3) PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，用終濃度為1 Ug/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果。 根據所記錄的電泳結果，按如下方式判定
如果電泳結果顯示能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，說明該材料 為感病育種材料，可將其淘汰；
如果電泳結果顯示不能擴增出一條長度為990 bp的特徵條帶，說明該 材料為抗病育種材料，可用於進一步的辣椒抗疫病新品種選育。
以下是本發明的具體應用實例，這些均是較優的例子，本發明的應用並 不限於這些實施例。 應用實施例1:
(1) 將公認的辣椒感疫病育種材料Early Calwonder和抗疫病育種材 料CM334播種於育苗盤進行常規管理，溫度保持在25'C 3(TC、相對溼度 50% 70%，光照3000Lx 4000Lx。待幼苗長至3 4片真葉時，用改良SDS 方法(鞏振輝等，以PCR鑑定轉基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農業 大學學報，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同親本嫩葉的基因組DNA， 用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，並用1XTE緩衝溶液將DNA濃度調至25 ng/u匕。
(2) 以上述基因組DNA為模板，根據發明人獲得的接種疫黴菌後在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導表達的基因序列設計分子標記的正、反向引物 進行PCR擴增反應。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaaggg gaacc-3，，反向弓l物的核苷酸序歹!j為5， -aactcgctgggaaaagaatg-3，。
PCR擴增反應的總體積為25uL，其中含IX擴增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. 0mmol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L的反 向引物，0. 2mmol/L的dNTPs， 0. 5 U 7^^DNA聚合酶。其中PCR擴增反應的程序為95t:預變性5min，再進入PCR循環，循 環程序為94。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進行34個 循環，最後在72。C下延伸10min， 4。C保存。PCR擴增反應在美國Bio-rad DNA 擴增儀上進行。
(3) PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，用終濃度為1 Hg/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果。 根據電泳結果顯示，感疫病辣椒育種材料Early Calwonder能擴增出一條長 度為990bp的特徵條帶，而抗疫病辣椒育種材料CM334不能擴增出一條長度 為990bp的特徵條帶(參見圖1)。 應用實施例2:
(1) 將公認的辣椒感疫病育種材料Early Calwonder和抗疫病育種材 料CM334和A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性 未知的辣椒育種材料按羅德旭等方法(羅德旭等，辣椒疫病抗病性分子鑑定 技術研究[J].西北農業學報，2008， 17 (5): 76-80)進行抗病性鑑定，即 在植株6 8葉時採用灌根法進行接種，接種前ld灌透水。接種時，用玻棒 在距幼苗根莖約3 cm處扎一孔，孔深3 cm，準確吸取3mL濃度為1X lOVmL 疫黴菌遊動孢子懸浮液注入孔內，每品種10株，重複3次。保溼24h後， 在28'C，相對溼度90%，光照為4000Lx， 12h的人工氣候箱內促使發病。接 種後7d調査發病級別，並計算病情指數。
(2) 接種結果顯示，Early Calwonder的病情指數為97. 6，屬於高感 疫病育種材料；CM334的病情指數為0，屬於高抗疫病育種材料。A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性未知的辣椒育種材料中， 表現感病的有3份，分別為B27、茄門和2096，其病情指數分別為80. 7、 72.7、 54.2;表現抗病的有5份，分別為All、 A2、 B19、 2056、 2031，其 病情指數分別為0 (高抗)、5 (高抗)、12.7 (抗病)、42.5 (中抗)、45.7(中抗)。
(3) 將上述10份辣椒育種材料播種於育苗盤進行常規管理，溫度保持 在25。C 30。C、相對溼度50% 70%，光照3000 Lx 4000Lx。待幼苗長至3 4片真葉時，用改良SDS方法(鞏振輝等，以PCR鑑定轉基因植株的微量DNA 提取方法[J].西北農業大學學報，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同親 本嫩葉的基因組DNA，用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，並用1XTE緩衝溶 液將DNA濃度調至25ng/ u L。
(4) 以上述基因組DNA為模板，根據發明人獲得的接種疫黴菌後在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導表達的基因序列設計分子標記的正、反向引物 進行PCR擴增反應。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaaggg gaacc-3，，反向弓I物的核苷酸序歹U為5， -aactcgctgggaaaagaatg-3，。
PCR擴增反應的總體積為25uL，其中含IX擴增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. Ommol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L的反 向引物，0. 2mmol/L的dNTPs， 0. 5 U 7sg DNA聚合酶。PCR擴增反應的程序 為95'C預變性5min，再進入PCR循環，循環程序為94。C變性lmin， 54°C 退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進行34個循環，最後在72t)下延伸10min， 4。C保存。PCR擴增反應在美國Bio-rad DNA擴增儀上進行。
(5) PCR擴增產物在1. 2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，用終濃度為1 u g/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果。
(6) 電泳結果顯示，感疫病辣椒育種材料Early Calwonder和其他3 份感疫病育種材料(B27、 2096、茄門)能擴增出一條長度為990bp的特徵 條帶，而抗疫病辣椒育種材料CM334和其他5份抗疫病育種材料(A2、 All、 B19、 2056、 2031)不能擴增出一條長度為990 bp的特徵條帶(附圖2)。
(7) 分子標記淘汰結果與人工苗期接種淘汰結果表現一致。
權利要求
1、一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，其特徵在於，具體過程包括如下步驟(1)將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種於育苗盤進行常規管理，待幼苗長至3～4片真葉時，用改良SDS法分別提取不同育種材料幼嫩葉片的基因組DNA；(2)以上述幼嫩葉片的基因組DNA為模板，利用分子標記的正反向引物進行PCR擴增反應；分子標記的正向引物的核苷酸序列為5』-ctgtgatatggaaggggaacc-3』，反向引物的核苷酸序列為5』-aactcgctgggaaaagaatg-3』(3)PCR擴增產物在1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，溴化乙錠染色，利用凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果；(4)對電泳結果進行如下判定若電泳結果顯示能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，說明該育種材料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；若電泳結果顯示不能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，說明該育種材料為抗疫病辣椒育種材料。
2、 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中PCR擴增反應的總體積為25uL，其中含1X擴增Buffer, 10ng 25ng模板DNA， 2.0mmol/L MgCl2，0. 4 u mol/L的正向引物，0. 4 y mol/L的反向引物，0. 2 mmol/LdNTPs， 0. 5 U DNA聚合酶。
3、 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中PCR擴增反應的程序為95-C預變性5min，再進入PCR循環，循環程序為94。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72""C延伸1. 5min，共進行34個循環，最後在72°C下延伸10min， 4'C保存。
全文摘要
本發明公開了一種利用分子標記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種於育苗盤進行常規管理，等幼苗長至3～4片真葉時，用改良SDS法分別提取不同育種材料嫩葉的基因組DNA，利用分子標記的正反向引物進行PCR擴增。PCR擴增產物在1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，溴化乙錠染色，利用凝膠成像系統觀察、記錄電泳結果。若電泳結果顯示能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，則該材料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；若電泳結果顯示不能擴增出一條長度為990bp的特徵條帶，則該材料為抗疫病辣椒育種材料。該方法可將辣椒感疫病育種材料在其生長的早期階段予以淘汰，具有淘汰周期短、成本低、結果可靠等優點，且不影響對其他性狀的觀察。
文檔編號C12Q1/68GK101487049SQ200910021240
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月24日 優先權日2009年2月24日
發明者劉珂珂, 鞏振輝, 李大偉, 逯明輝, 陳儒鋼, 煒 黃 申請人:西北農林科技大學