用於增強植物脅迫耐受性的方法

2024-04-05 04:53:05 1

專利名稱：用於增強植物脅迫耐受性的方法
技術領域：
本發明涉及植物中冷、旱、鹽、冷發芽(cold germination)、熱和其他非生物脅迫耐受性以及植物中病毒、真菌、細菌和其他非生物脅迫耐受性。具體來說，本發明涉及一種通過在植物細胞內表達冷休克蛋白增強所述植物生物和非生物脅迫耐受性的方法。
背景技術：
種子和果實生產是數十億美元的商品行業，對於美國許多州和世界上許多國家來說是其收入的主要來源。商業上有價值的種子包括，例如，低芥酸菜子(canola)、棉籽和向日葵籽，其備受珍視，因為從種子中可以榨取植物油。諸如豌豆、菜豆和小扁豆的豆科植物的種子由於它們富含蛋白質，因此在商業上也有價值，例如，就大豆來說，其含有40-45％的蛋白質及18％的脂類和油類。此外，咖啡亦是一種有價值的作物，由乾燥並烘烤過的阿拉伯咖啡(Coffeaarabica)植物的種子製成，而巧克力則由可可樹種子或「豆」製成。同樣地，許多果實和種子在商業上也有價值，包括，例如玉米、稻、小麥、大麥和其他穀類、堅果、豆類、西紅柿和柑橘類水果。例如，玉米種子可製成多種食品或用於烹飪的物品，如玉米面豆卷殼、玉米油、玉米餅、玉米片、玉米面等。玉米也用作為許多產品生產的原料，包括但不限於，飼料和酒精生產。
由於生物和非生物脅迫，種子和果實生產固有地受之所限。例如，大豆(Glycine max)是一種在貯藏期間遭受種子發芽損失並當土壤溫度降低時無法發芽的作物(Zhang等，Plant Soil 188(1997))。這種現象實際上也存在於玉米和其他重要的農作物中。改善植物的非生物脅迫耐受性在農業上將有利於作物，使得生長增加和/或在冷、旱、洪澇、熱、紫外線脅迫、臭氧增加、酸雨、汙染、鹽脅迫、重金屬、礦化土壤和其他非生物脅迫下發芽。生物脅迫，例如真菌和病毒感染，在世界範圍內也導致大量作物減產。
幾世紀來，傳統育種(將一種基因型的特定等位基因與另一種雜交)業已用於增強生物脅迫耐受性、非生物脅迫耐受性和產量。傳統育種固有地受限於親本植物中所存在的有限數量的等位基因。其又限制了以這種方式累積的遺傳變異性的數量。分子生物學已容許本發明的發明人能廣泛地尋找可改善植物脅迫耐受性的基因。我們的發明人尋求確定其他生物如何對脅迫環境起反應並耐受之。冷休克蛋白是為細菌和其他生物在冷和脅迫環境下生存所使用系統的一部分。本發明人提出將編碼冷休克蛋白及其相關蛋白的基因導入植物中並表達，將能增強植物的冷、旱、熱、水分和其他非生物脅迫耐受性以及植物的真菌、病毒、和其他生物脅迫耐受性。他們也相信使用與冷休克蛋白同源或具有序列相似性的基因，也將能增強生物和非生物脅迫耐受性。
經營農業者可使用本發明來減少它們因生物和非生物脅迫所造成的損失。
發明概述本發明提供了一種在植物細胞中表達冷休克蛋白(Csp)的植物。冷休克蛋白的表達在所述植物中產生了更強的非生物脅迫耐受性。在一個實施方案中，編碼冷休克蛋白的多核苷酸通過可操縱地連接到在植物中起作用的啟動子和終止子而得到表達。
更具體地說，本發明提供了一種重組DNA分子，在5』至3』方向包含包含在植物中起作用的啟動子的第一DNA多核苷酸，可操縱地連接到編碼冷休克蛋白的第二DNA多核苷酸，其可操縱地連接到提供多腺苷酸化位點的3』轉錄終止DNA多核苷酸。所述第一DNA多核苷酸通常優選與第二DNA多核苷酸異源。本發明也提供了一種具有在第一DNA多核苷酸和第二DNA多核苷酸之間插入內含子的重組DNA分子。本發明也提供了一種重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼一種包含SEQ ID NO3基序的蛋白。在本發明重組DNA的特定實施方案中，所述第二DNA多核苷酸編碼一種選自(a)具有基本上同一於革蘭氏陽性細菌冷休克蛋白胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白，(b)來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的冷休克蛋白，(c)枯草桿菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，(d)具有基本上同一於SEQ ID NO2的胺基酸序列的蛋白，(e)具有基本上同一於革蘭氏陰性細菌冷休克蛋白胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白，(f)包含來自大腸桿菌(Escherichia coli)冷休克蛋白的蛋白，(g)大腸桿菌冷休克蛋白A(CspA)同系物，(h)具有基本上同一於SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白，(i)來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的冷休克蛋白，和(j)具有基本上同一於SEQ ID NO5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63或65任一的胺基酸序列的蛋白。
本發明也提供了一種重組DNA分子，其中所述啟動子選自由誘導型啟動子、組成型啟動子、時序調節型啟動子、發育調節型啟動子、組織優選型啟動子、低溫增強型啟動子、低溫特異性啟動子、脅迫增強型啟動子、脅迫特異性啟動子、乾旱誘導型啟動子、缺水誘導型啟動子和組織特異性啟動子組成的組。
本發明也提供了在其基因組中包含上述重組DNA分子的植物細胞和植物以及繁殖體及由其產生的後代。植物包括，但不限於作物植物、單子葉植物和雙子葉植物。更具體地說，這些植物可包括大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麥、燕麥、草坪草、棉花和小麥。
本發明也提供了非生物脅迫耐受的轉基因植物，其已用表達冷休克蛋白的重組DNA分子轉化。這樣的植物及其細胞和諸如種子的繁殖體在它們的基因組中包含表達冷休克蛋白的重組DNA分子。這樣的植物具有一種或多種下列增強的性狀在限制相同種非轉化植物生長的低溫條件下更高的生長率，(a)在限制相同種非轉化植物生長的高溫條件下更高的生長率，(b)在限制相同種非轉化植物生長的水分條件下更高的生長率，(c)在限制相同種非轉化植物生長的土壤和/或水中增加的鹽類或離子條件下更高的生長率，(d)在冷休克後較相同種未轉化植物更大百分率的植物存活率，(e)當與相同種未轉化植物相比時增加的產量，或(f)與相同種未轉化植物相比對乾旱的抗性。
本發明的一種方法包含繁殖本發明的植物，如，為了產生種子，僅通過將上述種子種植在土壤中並使之生長，如在脅迫環境下。更具體地說，本發明提供了一種生產的植物的方法，所述植物具有諸如非生物脅迫耐受性、增加的產量或增加的根群的增強的性狀。所述方法包括步驟a)將包含編碼冷休克蛋白DNA的重組DNA分子插入到植物細胞的基因組中，b)獲得轉化的植物細胞，c)從所述轉化的植物細胞再生植物；和d)擇具有增強的性狀的植物。
在本發明的一個方面，植物選自具有增強的非生物脅迫耐受性的植物，所述非生物脅迫耐受性選自耐熱性、耐鹽性、耐旱性和冷休克後存活。
本發明也提供了分離的蛋白質，其是至少40％同一於具有選自SEQ ID NOS5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的胺基酸序列的蛋白質。在某些方面，可通過用具有較40％同一性更高的同源性的蛋白質來取代冷休克蛋白以獲得類似的性狀。如，用與在此具體披露的冷休克蛋白具有至少50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性的蛋白質來取代。同樣地，本發明也提供了一種編碼冷休克蛋白基序的分離的核酸，其可與具有選自SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，90和92的DNA序列的核酸雜交。
本發明也具體提供了編碼冷休克蛋白的分離的核酸，所述冷休克蛋白具有基本上同一於選自SEQ ID NOs5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65序列的DNA序列。
本發明也提供了包含上述重組DNA分子的繁殖體，當它們被種植或以其他方式發芽時，從所述繁殖體發芽的田間作物，如在上述繁殖體所播種的田地上。
本發明也提供了一種生產種子的方法，包括在土壤中種植權利要求59的種子；b)從所述植物收穫種子；因此生產得到種子。
也提供了一種生產轉基因植物的方法，所述方法包括步驟(i)將DNA分子導入植物細胞的基因組中，所述DNA分子包含至少40％同源於具有選自SEQ ID Nos5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的胺基酸序列的蛋白的DNA多核苷酸，或其片段、順式元件，其中所述DNA多核苷酸可操縱地連接到啟動子並且可操縱地連接到3』轉錄終止DNA多核苷酸；和(ii)選擇所述轉基因植物細胞；和(iii)在轉基因植物中再生所述轉基因植物細胞；也提供了通過該方法生產的植物。
附圖簡述

圖1顯示了pMON57396的質粒圖。
圖2顯示了pMON23450的質粒圖。
圖3顯示了pMON57397的質粒圖。
圖4顯示了pMON57398的質粒圖。
圖5顯示了pMON23450的質粒圖。
圖6顯示了pMON57399的質粒圖。
圖7顯示了pMON48421的質粒圖。
圖8顯示了pMON56609的質粒圖。
圖9顯示了pMON56610的質粒圖。
圖10顯示了pMON73607的質粒圖。
圖11顯示了pMON61322的質粒圖。
圖12顯示了pMON73608的質粒圖。
圖13顯示了pMON65154的質粒圖。
圖14顯示了pMON72472的質粒圖。
圖15顯示了pENTRl的質粒圖。
圖16顯示了表達指示基因植物和對照植物的生長型，顯示了所導入的基因提供了非生物脅迫耐受性。
圖17顯示了pMON42916的質粒圖。
圖18顯示了pMON73983的質粒圖。
圖19顯示了pMON73984的質粒圖。
具體實施方案詳述本發明提供了一種對生物和非生物脅迫具有增強的耐受性的植物。由於在所述植物的細胞中表達了冷休克蛋白(csp)，所提供的植物具有增強的脅迫耐受性。本發明提供了幾個實施方案的例子，並預計其他實施方案應能在本發明中起作用。
提供了下列定義和方法以便更好地定義本發明並指導本領域普通技術人員實踐本發明。除非另作說明，術語將依照本領域普通技術人員之慣例進行理解。例如，分子生物學和分子遺傳學的常用術語的定義可見於Lewin，Genes VII，Oxford University Press and CellPress，New York，2000；Buchanan，等，Biochemistry and MolecularBiology of Plants，Courier Companies，USA，2000；Lodish，等，Molecular Cell Biology，W.H.Freeman and Co.，New York，2000。遺傳學的常用術語可見於在前的參考文獻和Lynch，等，Genetics andAnalysis of Quantitative Traits，Sinauer and Associates，Sunderland，MA，1998；Hartwell，等，GeneticsFrom Genes toGenomes，McOraw-Hill Companies，Boston，MA，2000；Hartl，等，GeneticsAnalysis of Genes and Genomes，Jones and BartlettPublishers，Sudbury，MA；Strachan，等，Human MolecularGenetics，JohnWiley and Sons，New York，1999。
使用了37CFR§1.822所示的DNA鹼基命名法。使用了標準的單字母和三字母胺基酸殘基命名法。
許多農學性狀能影響「產量」。例如，這些性狀可包括，不限於，株高、莢數、植物上莢位置、節間數量、莢裂傾角、粒度、根瘤和固氮作用效率、營養素同化作用效率、生物和非生物脅迫抗性、碳同化、植物結構、倒伏抗性、種子發芽率、幼苗活力以及幼株性狀。例如，這些性狀也可包括，不限於，發芽率(包括在脅迫條件下的發芽)、任一或所有植物部位的生長率(包括在脅迫條件下的生長率)、穗數量、每一穗的種子數量、種子粒度、種子成分(澱粉、油、蛋白質)、種子飽滿特性。可用多種方法來測定產量，這些方法可包括容重、種子重量、每株植物種子數量、每株植物種子重量、每單位面積種子數量或重量(即每英畝種子數量或種子重量)、每英畝蒲式耳數、每英畝公噸數、每英畝美噸數、每公頃公斤數。在一個實施方案中，本發明植物表現了增強的性狀，即為產量之一要素。
「核酸(序列)」或「多核苷酸(序列)」指基因組或合成來源的單鏈或雙鏈DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，即分別為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基的多聚體，讀碼從5』(上遊)末端到3』(下遊)末端。所述核酸可為正義或互補(反義)鏈。
「天然的」指天然存在的(「野生型「)核酸序列。
「異源」序列指來源於外源或外來物種的序列，或者如果是相同來源的，則為來自其原型修飾的序列。例如，天然啟動子可用來使相同或不同物種中的異源基因發生轉錄。
植物「部位」包括植物的所有部位或部分，包括，但不限於，根、苗、葉、莖、花粉、種子、花、雄蕊、雌蕊、菌蕾、胚、花瓣、花絲、心皮(包括柱頭、子房和花柱)、細胞或上述的任何部分。
「繁殖體」包括減數分裂和有絲分裂的所有產物，包括但不限於，種子和能繁殖為新植物的植物部位。例如，繁殖體包括苗、根或其他能生長為完整植物的植物部位。繁殖體也包括嫁接體，在此植物的一部分嫁接到不同植物(甚至是不同種的植物)的另一部分上以產生活的生物體。繁殖體也包括通過克隆、通過聚集減數分裂產物或使減數分裂產物聚集形成胚或受精卵(天然地或人為幹預的)所產生的所有植物和種子。
「分離的」核酸序列是基本上分離或純化的，不含其天然存在的生物體細胞中通常與之相關的其他核酸序列，即其他的染色體或DNA。該術語包括生物化學純化的核酸，使得基本上除去汙染的核酸和其他細胞組分。該術語也包括重組核酸和化學合成的核酸。
在此使用的「同一性」或「同一的」，當涉及在蛋白質或核酸之間比較時，指98％或更高的同一性。
如果第一核酸或蛋白質序列顯示「基本上同一」或「基本上相似」於參照核酸序列或蛋白質，當與其他核酸(或其互補鏈)或蛋白質進行最優比對(在比較窗口內具有總和小於參照序列的20％的適當的核苷酸或胺基酸插入或缺失)時，在至少20個核苷酸或胺基酸位置、優選至少50個核苷酸或胺基酸位置、更優選至少100個核苷酸或胺基酸位置、以及最優選在全長的第一核酸或蛋白質的比較窗口內有至少約60％核苷酸序列相等，更好為70％，優選至少約80％相等，更優選至少約85％相等，以及最優選至少約90％相等。用於比對比較窗口的最優比對可通過局部同源性算法來執行，優選通過使用計算機執行這些算法(可見於，例如，Wisconsin遺傳學軟體包7.0版，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)。所述參照核酸可以是全長分子或更長分子的一部分。換句話說，如果在嚴格條件下互相雜交，則兩個核酸是基本上同一的。合適的雜交條件可根據經驗來確定，或如果已知的話，可基於例如探針相對的G+C含量以及在探針和靶序列之間錯配數量來估計。可通過改變例如雜交溫度或鹽濃度而自由地調整雜交條件(Sambrook等.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，1989)。
當序列是如此排列使得第一核酸序列影響第二核酸序列的功能時，第一核酸序列是與第二核酸序列「可操縱地連接」。優選地，所述兩個序列是單個連續核酸分子的一部分，更優選是相鄰的。例如，如果在細胞中該啟動子調節或介導該基因的轉錄，則其與該基因是可操縱地連接。例如，當所述終止子導致RNA聚合酶在該終止子處或附近終止含有所述基因的轉錄產物時，轉錄終止區域(終止子)與該基因是可操縱地連接。例如，增強子通常並不與其所作用的啟動子相毗連，但是一般位於同一個核酸分子中。
通過人工組合兩種不同的分離的序列片斷製備得到「重組」核酸或DNA、或RNA分子，如，通過化學合成或通過基因工程技術操作分離的核酸片斷。用於核酸操作的技術眾所周知(參見，如.，Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。例如，在Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981中討論了核酸化學合成所使用的方法，例如，可在商用寡核苷酸自動合成儀上進行核酸的化學合成。
基因「表達」指基因轉錄產生相應的mRNA以及該mRNA翻譯生成相應的基因產物，即肽、多肽或蛋白。基因表達受調控元件控制或調節，所述調控元件包括諸如啟動子的5』調控元件。
術語「重組DNA構建體」、「重組載體」、「表達載體」或「表達盒」指任何來源的，具有基因組整合或自主複製能力的所有介質，例如質粒、粘粒、病毒、BAC(細菌人工染色體)、自主複製序列、噬菌體、線狀或環狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，其包含DNA分子，其中一個或多個DNA序列業以功能上可操作的方式連接。
「互補」指核酸序列通過鹼基配對的天然結合。如果僅有一些核酸配對是互補的，則兩個單鏈分子間的互補可以是部分的；或者如果所有的鹼基對都是互補的，則上述單鏈分子間的互補是完全的。互補度影響了雜交和擴增反應的效率和強度。
「同源性」指核酸或胺基酸序列之間相似性水平，用核苷酸或胺基酸同一性或相似性詞句，分別為序列相似性或同一性。同源性、同系物以及同源的也指在不同核酸或蛋白質之間具有相似功能性的概念。同系物包括定向進化同源和平行進化同源的基因。同系物可依所使用的基因編碼序列來確定，以一種或多種下列方式披露在此或見於合適的資料庫(例如NCBI或其他資料庫)。對於蛋白質序列而言，序列應當使用算法進行比較(例如參見涉及「同一性」和「基本上同一」部分的內容)。對於核苷酸序列而言，一個DNA分子的序列可與已知或推定同源的序列以大致相同的方式進行比較。在分子(DNA、RNA或蛋白質分子)任何完整的實質(25個核苷酸或胺基酸，更優選50個核苷酸或胺基酸，更優選100個核苷酸或胺基酸，或最優選較短序列的全長)區域上，同系物具有至少20％、更優選30％、更優選40％、更優選50％、更優選60％、更優選70％、更優選80％、更優選88％、更優選92％、最優選95％的同一性。
或者，如果具有相似功能的兩條序列，或其中一條或兩條序列的互補序列，在嚴謹條件下互相雜交，則兩條序列，或編碼或可編碼胺基酸序列的DNA或RNA是同源的，或是同系物，或編碼同源序列。因此，如果要確定兩條蛋白質序列是否是同系物，則這兩條序列都要進行在此描述的計算機作業，並創建所有可能的能編碼蛋白質的核酸序列的簡併密碼序列，確定它們是否能在嚴謹條件下雜交。促使DNA雜交的合適的嚴謹條件，例如，在約45℃下在6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在50℃下用2.0xSSC洗滌，為本領域技術人員所熟知，或可見於Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可從在50℃下約2.0xSSC的低嚴謹性到在50℃下約0.2xSSC的高嚴謹性中選擇。此外，洗滌步驟的溫度可從在約22℃的室溫下的低嚴謹條件遞增到約65℃的高嚴謹條件。溫度和鹽濃度都可以改變，或當溫度和鹽濃度中的一個變量改變時，另一個保持不變。在一個優選的實施方案中，編碼本發明所述蛋白的核酸在高嚴謹條件下可與一個或多個核酸分子或其互補分子或兩者的片段特異性雜交，例如在約65℃下在約2.0xSSC中。可通過本領域技術人員所熟知的多種方法檢測探針與靶DNA分子的雜交，這些方法包括，但不限於，螢光標記、放射性標記、基於抗體的標記和化學發光標記。
「冷休克蛋白」(Csp(s)或CSP(s))是具有與大腸桿菌CspA蛋白(SEQ ID NO1)或枯草桿菌CspB蛋白(SEQ ID NO2)大於40％同一性的蛋白，或者，冷休克蛋白可通過使用在文獻中所確定的保守結構域來發現。例如，在大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB全長範圍中，在此使用的冷休克蛋白與大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB具有40％同一性，更優選50％同一性，更優選60％同一性，更優選70％同一性，更優選80％同一性，更優選90％同一性，更優選95％同一性。可利用幾個資料庫，提供給本領域技術人員來確定是否新的或現有的蛋白包含冷休克結構域或是否為冷休克蛋白，包括從Genbank到用來提供確定蛋白相互關係和/或發現相關蛋白的蛋白質資料庫。在此包括於該定義中的是所有已知的冷休克蛋白，包括但不限於來自大腸桿菌的CspA，CspB，CspC，CspD，CspE，CspF，CspG，CspH和CspI(美國專利6,610,533)。
所述保守的冷休克結構域示於SEQ NO3([FY]-G-F-I-x(6，7)-[DER]-LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY])(Prosite基序PS00352；Bucher和Bairoch，(In)ISMB-94；Proceedings 2ndInternational Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology，Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.，編.，Menlo Park，1994；Hofmann等，Nucleic Acids Res.27215，1999)中。或者，可使用Sprint資料庫(一種相關的蛋白指紋圖譜資料庫)(Attwood等.，Nucleic Acids Res.282000；Attwood，等.，Nucleic Acids Research，30(1)，出版中，2002)來發現冷休克蛋白。或者，可使用基於描述的矩陣或Pfam來發現冷休克蛋白。Pfam是一種多重序列比對和包含許多常見蛋白結構域的隱馬爾可夫模型的大集合(Bateman等，Nucleic Acids Research 28263，2000)。在寫操作下(2001年11月；Pfam第6版)，有3071個家族。包括冷休克蛋白，為PF00313。物種樹顯示了在Pfam資料庫中所確定的冷休克蛋白的歸類。
在此使用的「冷休克蛋白」也包括，但不限於，在使用冷休克蛋白作為使用NCBI的「Blink」(Blast Link)函數的資料庫的詢問序列的搜索中所發現的任何蛋白。「Blink」是一種快速搜索函數，用於尋找具有相似序列的蛋白質。該「冷休克蛋白」或「冷休克結構域」的定義除用於上述的那些之外，並不能代替所述的定義。冷休克蛋白或含有冷休克結構域的蛋白包括，但不限於，在公用和專用資料庫中所有目前已知的蛋白，以及還要去發現的足以相似於所宣稱的蛋白(例如，大腸桿菌CspA和枯草桿菌CspB)的那些，其在BlastLink(2001年11月1日)所普遍使用的標準blast搜索設定值下被「命中」。在寫操作時，Blast 2正運行，且Blast Link(「Blink」)運行預設參數進行蛋白質-蛋白質blast搜索。在寫操作時，我們認為Blink使用的預設設定值如下運行BLOSUM62矩陣，使用「nr」資料庫，選擇CD搜索，作為是基於統計學的組合，具有選作為「低複雜性」的複雜性，期望值為10，具有3的字長，缺口罰分是存在11和延伸1。表I所列的顯示了使用這些標準設定值對大腸桿菌CspA最初的200個命中，但我們並不限制我們的權利要求在這最初的200個命中中。本領域技術人員應注意在這些相當嚴格的標準下，發現了167個細菌來源的蛋白，但也發現了28個多細胞動物蛋白和5個植物蛋白。這些蛋白包括來源廣泛的與CspA同源的蛋白，發明人預計其在本發明中將發揮作用。該表決不是包括一切的列表，預計其他蛋白將在本發明中發揮作用。
表20.依據與大腸桿菌CspA相似性所發現的一些冷休克蛋白和含有冷休克結構域的蛋白。該列表是使用NCBI標準的Blast Link設定值所編輯的。顯示了每個蛋白的Genbank ID和名稱。注釋由於蛋白命名的方式，一些蛋白和序列將具有幾個登錄項，如蛋白、cDNAs、等位基因等。Genbank ID可被認為是每一登錄項的特定標識符。登錄項以與詢問序列比較得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
枯草桿菌(B.subtilis)CspB是一種在對冷休克響應中累積的蛋白(Willimsky，等，Journal of Bacteriology 1746326(1992))。其與來自大腸桿菌的CspA具有同源性(見表I)並含有單鏈核酸結合域(Lopez，等，The Journal of Biological Chemistry 27615511(2001))。在NCBI(Blink)中使用相同的基本Blast搜索，下列蛋白被指定為「命中」。在此所示的命中數量限制在200，但許多其他蛋白預計可在本發明中起作用。
表21.用枯草桿菌CspB搜索所發現的一些冷休克蛋白和含有冷休克結構域的蛋白。該列表是使用NCBI標準的Blast Link(Blink)設定值所編輯的。顯示了每個蛋白的Genbank ID和名稱。注釋由於蛋白命名的方式，一些蛋白和序列將具有幾個登錄項，如蛋白、cDNAs、等位基因等。Genbank ID可被認為是每一登錄項的特定標識符。登錄項以與詢問序列比較得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
當溫度降低或施加其他脅迫時，CSP是一組在數量上可能或沒有增加的蛋白。事實上，就冷休克蛋白而言，在最好的研究生物大腸桿菌中，當其他蛋白為冷所誘導時。一些冷休克蛋白是組成型表達的，還有一些蛋白似乎特異於特定的脅迫和/或生長條件或階段。該評論見於Yamanaka，等.，Molecular Microbiology，27247(1998)。在該評論中，Yamanaka和同事詳述了大腸桿菌中9個冷休克蛋白(CspA-CspI)是如何表達的。CspA、CspB和CspG是冷誘導的。CspD在細胞周期靜止期和在飢餓期間被誘導。CspC和E涉及細胞分裂。
CspA是來自大腸桿菌(E.coli)的主要冷休克蛋白(SEQ IDNO1)。CspA也稱作主要冷休克蛋白7.4。CspA在對冷休克響應中高度誘導(Goldstein，等.，Proceedings of the National Academy ofScience(USA)87283(1990))。在某些減慢生長環境中，核糖體不活躍是因為RNA或DNA二級結構形成之故，在其天然生物體中可作為增加CSPs合成的信號。在體外環境中CSPs與ssDNA和RNA結合(Phadtare，等.，Molecular Microbiology 331004(1999))。在翻譯過程中CSPs被認為以相對非特異性的方式與RNA結合併阻止二級結構形成，穩定了RNA(這種功能有時稱為RNA蛋白伴侶)。然後，該核糖體能容易地取代該CSPs並在線狀RNA模板上啟動翻譯。我們相信本發明可涉及這些蛋白質的單鏈核酸結合功能，該功能能來自任何一種冷休克蛋白或含有冷休克結構域的蛋白，其包括，例如，原核生物冷休克蛋白、含有真核生物Y-框的基因、某些富甘氨酸蛋白(GRP)以及含有冷休克結構域的其他蛋白。這些蛋白包括，但不限於，在圖4，Trends in Biochemical Science，23(8)289(1998)(論文包括的，在此引入作為參考)中所示的那些。該圖清楚地顯示了這些蛋白之間的進化關係。這些蛋白很可能在現代細菌和真核細胞趨異之前起源，且已假定這些蛋白質在單細胞演化出現之時，即35億年前就已存在了。如實施例我們選擇將兩種蛋白質轉化入植物，如上述引證的圖所示，這些蛋白質較許多其真核生物對應物而言，彼此之間更加趨異。我們預計這些蛋白質的異位表達能在各種脅迫條件下，包括冷、旱、鹽脅迫、熱、冷休克後存活、真菌感染、病毒感染、微生物感染和冷發芽，改善對生物和非生物脅迫的耐受性，包括但不限於植物生長、活力、產量和健康。
在脅迫下植物生長率增加的另一種可能解釋是通過CSP表達所激發的病原體相關性分子圖式(PAMP)。在該模型中，植物將出現PAMP響應，其將激發植物響應，有些類似於系統性獲得抗性(SAR)(更類似於生物脅迫所產生的SAR)，如同植物在脅迫施加前就對之「有所準備」一樣。對於該模型運轉而言，CSP存在時植物應發出信號，最近業已通過將植物受體與CSP結合提供了該機制(Felix，等，Journalof Biological Chemistry 278(8)6201-8(2003))。該機制意味著任何與激發PAMP型響應受體結合的基因將在本發明中起作用。PAMP型響應通常用於生物脅迫的研究，一般通過外源給予的試劑激發。在此，我們能激發對CSP轉基因所產生的CSP的PAMP型響應。通過基因槍或農桿菌介導的轉化，該轉基因轉化入植物細胞作為重組DNA構建體的一部分。其在植物中又能引起系統性獲得抗性型響應，增強了對非生物脅迫的抗性。該響應能引入到單子葉植物和雙子葉植物中，包括但不限於玉米、大豆、小麥，稻、擬南芥、低芥酸菜子和棉花。如果上述PAMP法是CSPs為代表的模型，則預計該CSP可以提供生物脅迫和非生物脅迫保護。這些機制並不意在限制，且其中一種或兩種，或其他種種，可能與所出現的表型相關。
MF2，一種來自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)的Csp樣蛋白，據稱在植物中能提供某些抗病毒感染的保護。美國專利6,528,480顯示了通過使用含有該蛋白的提取物摩擦植物葉片並用病毒感染該植物所產生的對生物脅迫的耐受性。在該專利中它們預計能，但並沒有產生轉基因植物。
「相同種非轉化植物」意在包括於與轉化植物相同種的所有植物之內。在一個實施方案中，所述非轉化植物和轉化植物是相同種和品系的。在另一個實施方案中，所述植物與轉化植物有可能相同。
「冷休克結構域」(CSD)是一種與冷休克蛋白同源的蛋白序列。對於本發明來說，包含冷休克結構域的蛋白是一種「冷休克蛋白」。在大腸桿菌CspA或枯草桿菌CspB與含有冷休克結構域的蛋白的冷休克結構域之間，觀察到大於40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％的胺基酸同一性(Wistow，Nature 344823(1990)；Yamanaka，等.，Mol.Micro.，27247，具體參見Yamanaka參考文獻的圖1B；Graumann，等.TIBS 23286)。
在此使用的「酵母」通常指Saccharomyces cerevissiae但也包括慄酒裂殖酵母(Schizosacchoramyces pombe)和其他品種(例如，來自畢赤酵母屬的)。「玉米」指Zea Mays以及可由其培育的所有種和變種。「小麥」指所有的Triticum aestivum品種，包括但不限於春小麥、冬小麥和所有可選擇的小麥品種。「小麥」包括任何其他的小麥品種，包括但不限於硬質小麥(Triticum durum)、斯佩爾特小麥(Triticum spelta)、雙粒小麥(Triticum dicoccum)和野生二粒小麥(Triticum monococcum)。「小麥」也包括可由上述任一小麥品種培育的所有種和所述雜交種(包括黑小麥、一種小麥和黑麥的雜種)的後代。「大豆」指Glycine max或Glycine soja以及可由其培育的所有種或變種。「稻」指Oryza sativa以及可由其培育的所有種或變種。「大麥」指Hordeum vulgare以及可由其培育的所有種和變種。「燕麥」指Avena sativa以及可由其培育的所有種和變種。「低芥酸菜子」是近來賦予遺傳修飾的油菜籽植物、油籽油菜(Brassica napus L.)和蕪箐油菜(B.campestris L)所產生的種子、油和食品的新創名，在此低芥酸菜子包括所有油菜籽植物以及可用其育種的生物。在此使用的大腸桿菌(E.coli和Escherichia coli)包括大腸桿菌種生物及其所有菌株；即E.coli K12。在此使用的大腸桿菌(E.coli和Escherichia coli)也可包括能與任何大腸桿菌菌株接合的所有生物，當一者為F+或Hfr菌株，而另一者不是時。枯草桿菌(B.subtilis和Bacillus subtilis)指所有芽孢桿菌屬枯草桿菌種生物。在此使用的根癌農桿菌(Agrobacterium tumifaciens)包括所有該種的菌株和型。「草坪草」包括所有曾經栽培過或能栽培產生草皮的草種及品系，所述草皮包括但不限於草坪、用於比賽(即美式足球、棒球或英式足球)的場地、和高爾夫球場的所有區域(即開球區域、球道、果嶺、障礙區等)。「棉花」指所Gossypium屬植物以及可由其培育的所有植物。
在此所指的「耐熱性」作為植物在熱環境或較熱溫度下生長能力的量度，所述熱環境或較熱溫度對相同種植物的生長、活力、產量、大小起不利影響。耐熱植物在熱脅迫環境下較相同種的非耐熱植物生長得更好。
「耐鹽性」指某些植物在滲透脅迫或由水和土壤中的鹽類或離子所產生的脅迫下生長的能力。例如，當澆水液體或載體的培養基含有對相同種不同植物生長起不利作用的水和離子的混合物時，與相同種和/或變種植物相比，具有增加的生長率的植物據此應有耐鹽性。某些轉化植物較相同種和品系的非轉化植物對於這些類型的情況具有更強的耐受性。
所有在此使用數值應受術語「約」所修飾，約意味著該數值可以改變，在任一方向上，至多10％且仍保持相同的含義。例如，1M溶液應包括所有這種類型的溶液，小於等於1.1M但大於等於0.9M。例如，百分數也可被修飾，10％包括包括從9％至11％的所有百分數。形容詞「正好」所限定的術語並不受術語「約」所限定。
「富甘氨酸蛋白」定義為一種真核細胞中的蛋白，即含有冷休克結構域的蛋白，或者與之基本上同一，或是其同系物。
「冷休克後存活」定義為植物在置於低於該種植物生長階段正常溫度的溫度之後持續生長一段有效時間的能力。應當指出某些植物，甚至是那些相同種的，經選擇在冷環境下能生長。玉米的Wigor純系能耐受冷環境且當置於那些環境中時，較美國市售的大多數商用品系具有明顯更高的成活率。Wigor在波蘭作為商品出售。因此，對於轉基因植物而言低溫耐受性應當在相同的相關階段的相同品系的植物以及相同種類植物的範圍內比較，以獲取有意義的科學數據。接著，應馬上對植物進行打分，或在休克後幾天或幾周測定它們的生活力、生長率和其他表型。
「乾旱」或「生長水分受限」定義為一段乾燥的時期，特別是當其延長時，能損害農作物或妨礙它們順利生長。此外，相同種的不同植物，以及那些相同種的不同品系，對乾旱、乾燥和/或缺水可具有不同的耐受性。在實驗室中，乾旱可通過較對照植物給予植物95％或更少的水分來模擬，並尋找在活力、生長、大小、根長和種種其他生理和物理量度上的差異。乾旱也可通過在田地中給某些植物澆水，而不其他植物澆水來模擬，並比較它們的生長速率，特別是水分嚴重受限地方植物的生長。
非生物脅迫耐受性包括但不限於，增加的產量、生長、生物量、健康或其他指示脅迫耐受性的量度，其包括但不限於熱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫(包括在發芽過程中的冷脅迫)、水分脅迫(包括但不限於旱脅迫)、氮脅迫(包括高氮和低氮)。
生物脅迫耐受性包括，但不限於，增加的產量、生長、生物量、健康、或其他指示脅迫耐受性的量度，其包括但不限於植物的真菌感染、細菌感染、和病毒感染。
某些作為本發明一部分披露的基因序列是細菌來源的，例如，某些原核生物冷休克蛋白。本領域技術人員公知未修飾的細菌基因有時在轉基因植物中表達很低。植物密碼子用法較諸如細菌的單細胞生物更類似於人類和其他高等生物。一些報告已披露用於改善植物中重組基因表達的方法。這些報告披露了多種方法，基於植物密碼子頻率表，改善密碼子第3位鹼基偏愛，使用不含可疑的多腺苷酸化或富含A/T區域或內含子剪接共有序列的重組序列，用於人工改造編碼序列以提供能更有效翻譯的序列。雖然這些用於合成基因構建的方法值得注意，但是本發明人打算根據Brown等(美國專利號5,689,052 1997，其全文在此引入作為參考)和/或上述引用的方法以及其他方法，生產冷休克蛋白或含有冷休克結構域蛋白的合成基因。因此，本發明提供了一種用於製備在植物中表達所需蛋白產物的合成植物基因的方法。簡言之，根據Brown等的方法，減少編碼所需蛋白多核苷酸序列中稀有或半稀有單子葉植物密碼子的頻率並用更偏愛的單子葉植物密碼子取代。基於在單子葉植物中六單體單元的出現頻率，也就是最稀有的284，484和664六單體單元的出現頻率，通過分析連續的六核苷酸片斷中編碼序列並改變該序列修飾的多核苷酸序列編碼的所需多肽，在單子葉植物中增加的累積是產生偏愛密碼子頻率增加的結果。此外，Brown等披露了通過應用減少稀有密碼子頻率的方法來增加重組基因的表達，使用了減少核苷酸序列中多腺苷酸化信號和內含子剪接位點出現，去除核苷酸序列中自補序列並用非自補核苷酸取代上述序列，且保持編碼該多肽的結構基因，並減少核苷酸序列中5』-CG-3』二核苷酸配對出現的頻率的方法。對於期望多肽中存在的大多數胺基酸而言，這些步驟順序執行，所具有的累積效應導致了在核苷酸序列中含有對於單子葉植物優先利用的更偏愛的單子葉植物密碼子。特別是所有在此提及的蛋白預計要被製成如上所討論的合成基因，或使用類似的方法，這些蛋白包括但不限於大腸桿菌CspA和枯草桿菌CspB。
在此描述的工作具有確定的加強植物表達冷休克蛋白和含有冷休克結構域蛋白的方法，當在摻入易感植物細胞核、質體或葉綠體基因組後異位表達時，其可賦予對許多植物脅迫的抗性，可包括但不限於冷、熱、旱、鹽和其他脅迫，或脅迫相關表型(冷發芽、冷休克後存活和其他非生物脅迫)。美國專利5,500,365(在此特別引入作為參考)描述了一種用於合成植物基因以優化該合成基因編碼蛋白表達水平的方法。該方法涉及修飾外源轉基因的結構基因序列使得它們更加「類似於植物」並因此更有可能被翻譯並通過植物、單子葉植物或雙子葉植物來表達。但是，在單子葉植物中更適宜使用美國專利5,689,052中所披露的方法，其用於增強轉基因的表達。
在開發本發明的核酸構建體中，該構建體的多種成分或其片斷通常被插入到適宜的克隆載體中，如能在諸如大腸桿菌的細菌宿主中複製的質粒。在文獻中業已描述了存在的多種載體，其中有許多是市場上可買到的。在每次克隆後，具有所需插入物的克隆載體可被分離並進行進一步的操作，例如限制酶切消化、插入新片斷或核苷酸、連接、缺失、突變、切除等，以適合期望序列的成分。一旦完成該構建體，接著根據宿主細胞轉化的方法可將其轉移到合適載體中用於進一步操作。
本發明的雙鏈DNA分子包括，例如，通過任何適合的方法可插入植物基因組表達盒中的冷休克蛋白。適合的植物轉化載體包括來自於根癌農桿菌Ti質粒的那些，以及披露於，如Herrera-Estrella等，(1983)，Bevan(1984)，Klee等，(1985)和EPO公開號120,516的那些。除了來自於農桿菌的Ti或毛根誘導(Ri)質粒的植物轉化載體，替代的方法可用於將本發明的DNA構建體插入到植物細胞中。這樣的方法可包括，但不限於，例如通過使用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學藥品、通過微粒轟擊遞送游離DNA以及使用病毒或花粉進行轉化。
適合於使用電穿孔將編碼冷休克蛋白或含有冷休克結構域蛋白的基因導入單子葉植物的質粒表達載體可由如下所組成在植物中起作用的啟動子；提供剪接位點利於基因表達的內含子，例如Hsp70內含子(PCT公開號WO 93/19189)；以及諸如胭脂鹼合酶3』序列(NOS 3』)的3』多腺苷酸化序列。該表達盒可裝配為適合於大量DNA生產的高拷貝複製體。
一種用於植物轉化的Ti質粒盒載體是pMON-17227。該載體描述於PCT公開號WO 92/04449中並含有編碼賦予草甘膦抗性的酶(命名為CP4)的基因，對於許多植物而言，該基因是一種極好的選擇標記。如該文所述，該基因被融合到擬南芥EPSPS葉綠體轉運肽(CTP2)上並從FMV啟動子表達。當獲得含有景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶基因或cDNA的足夠量細胞(或原生質體)時，該細胞(或原生質體)再生為全植物。用於再生步驟方法的選擇並不是關鍵的，對於來自豆科(苜蓿、大豆、三葉草等)，傘形科(胡蘿蔔、芹菜、歐洲防風草)，十字花科(甘藍、蘿蔔、低芥酸菜子/油菜籽等)，葫蘆科(甜瓜和黃瓜)，禾本科(小麥、大麥、稻、玉米等)，茄科(馬鈴薯、菸草、番茄、胡椒)，各種花作物，例如向日葵，以及產堅果樹木，例如杏樹、腰果樹、胡桃樹和美洲山核桃樹的宿主具有合適的實驗方案可供使用。
可通過本發明實踐用於表達冷休克蛋白的植物包括，但不限於，刺槐、紫花苜蓿、小茴香、蘋果、杏、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類植物、甜菜、黑莓、越桔、莖椰菜、抱子甘藍、捲心菜、低芥酸菜子、羅馬甜瓜、胡蘿蔔、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、蕪荽、柑橘類植物、克萊門氏小柑橘、咖啡樹、玉米、棉花、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、寬葉萵苣、桉樹、茴香、無花果、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物、番木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、柏、輻射松、紅菊苣、蘿蔔、懸鉤子、稻、黑麥、高粱美國長葉松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、白薯、楓香、紅桔、茶樹菸草、番茄、草皮、藤本植物、西瓜、小麥、薯蕷、綠皮密生西葫蘆、或任何一種其他植物。
「啟動子」指結合RNA聚合酶(以及經常是其他轉錄因子)並啟動下遊DNA序列轉錄的DNA序列。當與其他組織相比時，在某些組織中啟動子通常提供增強的或減弱的表達。選擇啟動子，具體來說選擇當植物承受非生物脅迫時能增加表達的啟動子在本發明中應該特別有用。
在本領域中已觀察到某些脅迫響應對植物具有類似的作用，且對一種脅迫的抗性可提供對另一種脅迫的抗性。例如，從對脫水和低溫響應之間的關係可以看出這點(Shinozaki，等.，Current Opinionsin Plant Biology 3(3)217，2000)。許多其他論文表明了在不同的非生物脅迫之間具有一般的相互關係，並指出對於一種脅迫的耐受性能導致產生對一些其他非生物脅迫更強的耐受性(Pernas，等.，FEBS Lett 467(2-3)206，2000；Knight，Int Rev Cytol 195269，2000；Didierjean，等.，Planta 1991，1996；Jeong，等.，MolCells12185，2001)。
在包含於T-DNA的植物表達元件外DNA區段中所含有的表達盒和調節元件通常存在於許多質粒DNA骨架中，並起質粒維持元件之用，這些元件包括，但不限於，具細菌壯觀黴素/鏈黴素抗性的aad(Spc/Str)基因，提供複製起點用於在大腸桿菌中保持的pBR322 ori(ori322)，用於接合轉移入根癌農桿菌細胞的bom位點，以及含有來自RK2質粒複製起點的0.75kb oriV DNA區段。此外，那些為轉化植物所設計的質粒通常含有為起插入元件作用的農桿菌蛋白內源性DNA整合所需的元件。這些元件包括邊緣區(borders)(右邊緣區(RB)和左邊緣區(LB))。
在此使用的重組DNA技術實驗室規程是那些為本領域熟知且通常使用的。標準技術用於克隆，DNA和RNA分離、擴增和純化。一般的酶促反應包括根據產品說明書所述使用DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等。這些技術和多種其他技術通常根據Sambrook等.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)所述的來執行。
所有在本說明書中引證的出版物和公布的專利文獻在此引入作為參考，如同每一篇單獨的出版物或專利申請明確且單獨地被表明引入作為參考一樣。
下列所包括的實施例用於舉例說明本發明的實施方案。本領域技術人員應當理解在實施例中所披露的技術隨後代表的是本發明人所發現的能在本發明實踐中起很好作用的技術。但是，考慮到本發明所公開的內容，本領域技術人員應當意識到可對所披露的具體實施方案進行許多修改，仍能獲得同樣或相似的結果，而不背離本發明的精神和範圍，因此所有在附圖和實施例中所列或所示的內容被認為是例證性的，並不意在限制。
實施例實施例1.
pMON57396(圖1)是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似於大腸桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO56)的組成型表達。為克隆該大腸桿菌CspA基因，基於來自隸屬於國立衛生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspA序列信息(GenbankM30139，GI409136)，設計兩條基因特異性引物MF1和MF2。MF1序列是AGGTAATACACCATGGCCGGTAA(SEQ IDNO66)，其在CspA翻譯起始位點處退火併在5』末端引入NcoI位點，MF2序列是TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT(SEQ IDNO67)，其在CspA最後密碼子處退火併在該引物末端引入EcoRI位點。進行PCR分離大腸桿菌CspA。具體來說，裂解大腸桿菌DH5α細胞，少量裂解液作為模板擴增CspA基因，使用MF1和MF2引物、Taq聚合酶和來Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的dNTP。熱循環條件如下94℃，1分鐘，接著94℃，16秒；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘的30個循環。用凝膠電泳純化所擴增的CspA DNA，用NcoI和EcoRI消化並連接入雙元載體pMON23450(圖2)，該載體事先已用NcoI和EcoRI消化而被線性化。使用T4連接酶進行連接，並根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之後程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用於質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。轉化的細胞在合適的選擇培養基上進行平板培養(Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Press，1989)，並在幾小時或幾天後對菌落劃線。質粒製備自單個菌落並測定完整插入序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)和測序得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上遊(5』)側接CaMV e35S啟動子和在下遊(3』)側接附加表位(Flag，其編碼寡肽DYKDDDK(SEQ ID NO68)，SIGMA，St Louis)時，該構建體中的大腸桿菌CspA從而在C-末端加上Flag附加表位，並可通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。上述克隆產生了一種編碼類似於SEQID NO55的蛋白的質粒。所產生的質粒稱為pMON57396。
實施例2.
pMON57397(圖2)是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似於大腸桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO57)的組成型表達。為構建pMON57397，用限制性內切酶XhoI和SalI消化其C-末端加有Flag附加表位的含有大腸桿菌CspA基因的雙元載體pMON57396(見上述實施例)，以去除載體中這些位點並釋放出FLAG附加表位(該FLAG附加表位編碼寡肽DYKDDDK，SIGMA，St Louis)。接著純化並重新連接線性化的質粒。使用T4連接酶進行連接，並根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之後程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用於質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。轉化的細胞在合適的選擇培養基上進行平板培養(Sambrook等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)並在幾小時或幾天後對菌落劃線。質粒製備自單個菌落並測定完整插入序列。上述克隆產生了一種編碼類似於SEQ ID NO57的蛋白的質粒。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜以確保XhoI和SalI位點不存在(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)以及測序而得到確認。在該構建體中大腸桿菌CspA基因在C-末端沒有標記物，並通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄。
實施例3.
pMON57398(圖4)是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似於枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO59)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspB基因，基於來自隸屬於國立衛生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspB序列信息(GenbankU58859，gi1336655)，設計兩條基因特異性引物MF3和MF4。MF3序列是AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG(SEQ IDNO69)，其在CspB翻譯起始位點處退火併在5』末端引入NcoI位點，MF4序列TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT(SEQ IDNO70)，其在CspB最後密碼子處退火併在該引物末端引入EcoRI位點。進行PCR分離枯草桿菌CspB。枯草桿菌細胞獲得自CarolinaBiological Supply(Burlington，NC)，裂解細胞並將少量裂解液作為模板擴增CspB基因，使用MF3和MF4引物、Taq聚合酶和來自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的dNTPs。熱循環條件如下94℃，1分鐘，接著94℃，16秒；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘的30個循環。用凝膠電泳純化所擴增的CspB DNA，用NcoI和EcoRI消化並連接入雙元載體pMON23450(圖5)，該載體事先已用NcoI和EcoRI消化而被線性化。使用T4連接酶進行連接，並根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之後程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用於質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。將轉化的細胞在合適的選擇培養基上進行平板培養(Sambrook等.，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)並在一天後對菌落劃線。質粒製備自單個菌落並測定完整插入序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman和Co.，New York)和測序得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上遊(5』)側接CaMV e35S啟動子和在下遊(3』)側接附加表位(Flag，其編碼寡肽DYKDDDK(SEQ ID NO68)，SIGMA，St Louis)時，該構建體中枯草桿菌CspB樣基因從而在C-末端加上Flag附加表位，並可通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。該克隆產生了一種質粒，其具有插入所述質粒中的編碼類似於SEQ ID NO59的蛋白的序列。
實施例4.
pMON57399(圖6)是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似於枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO61)的組成型表達。為構建pMON57399，用限制性內切酶XhoI和SalI消化在其C-末端加有Flag附加表位的含有枯草桿菌CspB基因的雙元載體pMON57398(見上述實施例)，以除去載體中這些位點並釋放出FLAG附加表位(該FLAG附加表位編碼寡肽DYKDDDK，SIGMA，St Louis)。接著純化並重新連接線性化的質粒。使用T4連接酶進行連接，並根據廠商(BRL/Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的建議進行之後程序。將連接混合物轉化入大腸桿菌細胞中用於質粒增殖(Sambrook等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)。將轉化的細胞在合適的選擇培養基上進行平板培養(Sambrook等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1989)並在幾小時或幾天後對菌落劃線。質粒製備自單個菌落並測定完整插入序列。該克隆產生了一種質粒，具有插入到所述質粒中的編碼類似於SEQ ID NO61的蛋白的序列。
所產生的質粒也通過限制性內切酶譜以確保XhoI和SalI位點不存在(例如，參見Griffiths，等，An Introduction to Genetic Analysis，第6版，pp449-451，ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co.，New York)以及測序而得到確認。當載體中所選擇的NcoI-EcoRI克隆位點在上遊(5』)N-末端側接CaMV e35S啟動子時，該構建體中的枯草桿菌CspB基因在C-末端沒有標記物，並通過CaMV e35S啟動子啟動轉錄轉化擬南芥。所述質粒被轉化入根癌農桿菌。
實施例5.
可以用任何一種可獲得的方法轉化擬南芥植物。例如，可以使用In planta轉化法通過真空滲入轉化擬南芥植物(參見，Bechtold等.，In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration ofadult Arabidopsis thaliana plants.CR Acad.Sci.Paris Sciences de lavie/life sciences 3161194-1199(1993))。該實施例說明了擬南芥植物是怎樣被轉化的。
親本株材料和生長條件準備2.5英寸裝有土壤的盆，並用篩網覆蓋，確保土壤沒有壓得太緊以及篩網與土壤表面接觸(其保證了發芽的幼苗將能穿過篩孔生長)。播種種子並用發芽罩(germination dome)覆蓋。春化處理種子3-4天。在20-22℃、70％溼度、16小時光照/8小時黑暗條件下培育植物。每周澆水兩次，並施予低於1/2X(廠商推薦強度的一半)的Peters 20-20-20肥料(來自Hummert International，Earth City，MO)。每隔一周(以廠商推薦的全強度)添加微量營養物(Hummert′sDyna-穀物可溶性微量元素)一次。約1-2周後，除去罩並讓盆中植物減少到每盆一株或兩株。當其發育時，修剪初生芽(primary bolt)，以促進更多再生芽(secondary bolt)產生。在5-7天中，該植物準備就緒可用於滲入。
農桿菌製備(小規模和大規模培養)在LB平板上對農桿菌菌株ABI劃線，該培養基含有壯觀黴素100mg/L、鏈黴素100mg/L、氯黴素25mg/L和卡那黴素50mg/L(稱為SSCK)。在滲入前兩天，將一環的農桿菌置於含有10mlLB/SSCK的試管中並放在振蕩器上，在黑暗中於28℃下培養過夜。第二天，將農桿菌以1∶50在400ml YEP/SSCK中稀釋並放在振蕩器上，在28℃下培養16-20小時。(附註我們發現當LB用於第一次過夜培養及YEP用於大規模過夜培養時，轉化率明顯更高)。
滲入將其注入500ml離心瓶並在3500rpm下旋轉20-25分鐘，收穫農桿菌細胞。倒出上清液。乾燥沉澱物，然後重懸於25ml滲入培養基(MS基礎鹽0.5％、Gamborg氏B-5維生素1％、蔗糖5％、MES0.5g/L，pH 5.7)中，該培養基含有0.44nM苯甲酸嘌呤(BAP)(10μl的1.0mg/L DMSO母液)和來自Lehle Seeds(Round Rock，TX)的0.02％Vac-In-Stuff(Silwet L-77)。BAP和Silwet L-77在滲入日新鮮添加。添加200μl Silwet L-77和20μl BAP(0.5mg/L母液)。使用滲入培養基作為眾所周知的空白，獲取1∶10稀釋的農桿菌懸液的OD600。計算400ml農桿菌懸液/滲入培養基，OD600＝0.6，用於真空滲入所需的體積。
方程式
將重懸的培養物置於真空水提取器的Rubbermaid容器中。翻轉含有植物的盆以滲入溶液中，以致整個植物都浸入，包括蓮座叢，但不要讓太多的土壤被浸沒。在浸入前用水浸泡植物至少30分鐘(阻止土壤吸收農桿菌懸液)。
抽真空到約23-27英寸汞柱，持續10分鐘。快速進氣。在短時間內排出盆中水分，將盆側放在帶襯裡的布墊上，用罩子蓋住布墊以保持溼度，並放回到生長箱中。第二天，揭開盆上的罩子，使盆直立，並移開布墊。連續5天不給植物澆水。直立5天後，給植物澆水並在如前所述的相同條件下繼續生長。(被滲入的葉片可退化，但植物應存活直至開花完成)。
種子收穫和滅菌在滲入約2周後，通過使用Lehle Aracons(Lehle Seeds，RoundRock，TX)使植物一個一個單獨地形成錐體。在所有種子成熟結果後(滲入後約4周)，從水中移出植物並將全部種子弄乾。約2周後通過收割錐體下的枝條收穫種子。使用篩子清潔種子，截留長角果和枝條物，讓種子通過。將種子置於信封或15ml試管中。
滅菌前將期望數量的種子轉移到15ml錐形試管中。鬆開錐形試管蓋並將試管側置於真空乾燥器中，在乾燥器中放有容納400mlClorox漂白劑(Clorox Company，Oakland，CA)和4ml鹽酸的燒杯(在通風櫥中將HCl添加到Clorox中)。抽真空到剛好密封該乾燥器，關閉抽氣機16小時(即，使得該乾燥器仍處於真空但並不總是直接抽真空)。滅菌後，打開真空乾燥器將容有種子的試管置於無菌通風櫥中(鬆開蓋子使得氣體仍能釋放)。
將種子撒播(「灑」)在選擇平板上，該平板含有MS基礎鹽4.3g/L、Gamborg氏B-5(500X)2.0g/L、蔗糖10g/L、MES0.5g/L和8g/L Phytagar(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)、羧苄青黴素250mg/L、頭孢噻肟100mg/L。選擇水平為卡那黴素60mg/L、草甘膦60pM或Bialaphos 10mg/L。
首先，取出極少量的種子檢查汙染物。如果有汙染物，對種子重新滅菌多於約4小時，再次檢查汙染物。通常不需要第二次滅菌，但有時種子沾有真菌汙染物，需重複滅菌。(滅菌持續時間一般短於16小時，因為滅菌超過24小時會明顯降低發芽率)。用石蠟膜封住平板並置於冷藏室中施以春化處理約2-4天。在種子春化處理後，置於裝有冷白色燈泡的percival中。
轉移到土壤在約26℃下和16/8光周期5-10天後，可以看見轉化體成為綠色植物。再1-2周後，植物將有至少一組真葉。將植物轉移到土壤，蓋上發芽罩，並移至具有常規擬南芥生長條件的生長箱中。保持覆蓋直至出現明顯的新生長(通常5-7天)。
實施例6.
為了比較野生型非轉基因和CspA或CspB轉基因擬南芥植物的生長，使之在無菌培養皿中垂直生長野生型或轉基因種子使用如下方法進行液體滅菌●在70％乙醇中溫育5分鐘後進行渦旋混合●在30％Chlorox(6.15％次氯酸鈉)+0.01％Triton X-100中溫育5分鐘後進行渦旋混合●無菌水連續洗滌5次種子被置於100×15mm方形的塑料培養皿上(BectonDickinson-Falcon # 35-1112)，每一培養皿含有40ml瓊脂培養基，製備如下用氫氧化銨調節含常量營養元素、微量營養元素和維生素的0.5X Murashige和Skoog培養基(Sigma #M5519)pH至5.8，添加1％Phytagel(Sigma #P8169)，作為固體載體。
在半個培養皿上撒播10粒野生型擬南芥種子，距邊緣約1cm並均勻分布。使用管尖消毒的Gilson P-200移液器進行該步驟。10粒CspA或CspB轉基因擬南芥種子同樣地撒播在培養皿的另一半，均勻分布。用記號筆標記平板以指示哪一半含有轉基因種子。
培養皿於4℃下在黑暗中放置3天以層積種子，然後置於Percival恆溫箱(AR-36L型)中，於8℃下在24小時120微愛因斯坦/平方米的恆光下持續6周。溫育結束時，比較CspA和CspB和野生型蓮座型葉叢大小，發現CspA和CspB較大。該結果見圖16。見於第一、第二和最後一張平板照片，在此使用了上述測定法。在圖16中，第三張照片(CspB+Flag，pMON57399)顯示了平板中植物經受了類似於如下所述的冷休克試驗。
轉基因擬南芥種子冷休克幼苗活力評估水平平板測定法。
介紹這是一種用於評估已發芽轉基因擬南芥種子在水平培養皿瓊脂培養基上從常溫轉換到低溫時持續生長能力的方法。簡而言之，對來自對照植物和試驗轉基因植物的種子滅菌、層積、並撒播在培養皿上任何一半的6×8網格中。在水平位置處於常溫下溫育平板一周，然後移至急冷溫度下再溫育兩周，保持平板水平位置。採用數字照相術記錄幼苗的株冠面積並用成像軟體進行定量。測試幼苗總株冠面積與對照幼苗總株冠面積的比值可作為定量參數來比較轉基因測交品系中各種目的基因低溫耐受性潛力。
材料下列所用的主要常規設備可獲得自標準生物技術實驗室(高壓滅菌器、天平、層流罩超淨臺等)-擬南芥種子在本實驗方案中使用Arabidopsis thaliana cv。
-培養皿Falcon #35-1112(100mm方形×15mm深)-培養基Sigma M5519＝Murashige Skoog基礎培養基-Phytagel(Sigma #P-8169)-1-升玻璃瓶，對其中瓊脂培養基高壓滅菌並用於澆鑄平板。我們使用帶有橙色螺旋蓋的康寧(Corning)玻璃瓶。
-磁力攪拌器和磁性攪拌棒-可使用50ml塑料移液管的電動移液管管理器。
-用於照曬種子的具有塑料放大鏡的小螢光燈盒-P1000 Gilson移液器(或等價物)和消毒管尖-P200 Gilson移液器(或等價物)和消毒管尖-70％滅菌乙醇-30％Chlorox漂白劑+0.1％Tween 20-無菌去離子水-無菌微離心管和試管架-4℃冷藏室，低溫試驗箱或電冰箱，優選黑暗的-具有約150μE/m2/秒光源的22℃Percival植物生長箱或等價物。
-具有約150μE/m2/秒光源的8℃ Percival植物生長箱或等價物。
-半透性外科用膠帶3M微孔膠帶(3M#1530-1)-黑色(Sharpie)標記筆-Glassine天平稱量紙(VWR#12578-165)-計算器-筆記本-IBM兼容機-Image-Pro Plus軟體，4.1.0.0版-微軟Excel軟體實驗方案1-將貯藏在試管或信封中的種子等分置於滅菌的微量離心管中，2-用黑色記號筆(sharpie)標記試管以記住種子身份，3-通過用下列溶液連續洗滌並保持下列時間對試管中種子進行表面滅菌。注意，在洗滌過程中翻轉試管至少兩次以確保溶液與種子表面良好接觸。種子將落到試管底部，形成柔軟沉澱a.70％滅菌乙醇，持續3-5分鐘，b.30％Chlorox漂白劑+0.1％Tween 20，持續3-5分鐘，c.無菌過濾的去離子水，持續30秒，d.重複c四次以上並在最後一次，留下約0.5ml無菌水覆在種子沉澱上。
1-將微量離心管於4℃下在黑暗中放置3天以層積種子，使得平板培養的種子發芽更加一致。2-通過在玻璃瓶中製備1升試樣量的0.5X Murashige和Skoog培養基，用氫氧化銨調節pH至5.8，然後添加10克Phytagel，來製備平板。當調節pH時使用磁力攪拌器並與phytagel混合均勻，然後對液體高壓滅菌，設定(緩慢排氣)45分鐘。
3-在層流罩超淨臺中澆鑄平板，使用帶50ml滅菌移液管的電動移液管管理器將40ml培養基釋放到每個平板後，立刻用蓋子蓋住平板。
4-在層流罩超淨臺中用鼓風機讓平板冷卻至少2小時，結束後於4℃下貯藏在帶日期的塑膠袋中。
5-標記平板並撒播種子1-用半透性微孔膠帶捆住平板的四邊，標記日期並將平板置於Percival培養箱中，設定在22℃和約100μE/m2的16小時白天光周期。將平板水平放置，僅放一層並溫育7天。用數位照相機為每個平板拍照並將數據儲存在光碟上。
2-將平板轉移到Percival培養箱中，設定在8℃和約100μE/m2的24小時白天光周期。將平板水平放置，僅放一層並再溫育最多3周。用數位照相機為每個平板拍照並將數據儲存在光碟上。
3-每2-3天觀察平板一次，觀察與對照相比的測試種質生長狀況並不時對種質有代表性的常規性狀進行數碼照相。在8℃下溫育時間應小於2周(最多3周)。那些長得較長表現出差異的種質要在較低種子密度下進行平板培養以避免在進行數碼照相時過度擁擠。
4-使用數位照相機拍照和Image-Pro Plus軟體測量蓮座型葉子叢株冠面積。計算對照和測試群體的平均幼苗株冠面積，在分析中排除沒有發芽的種子。在溫度變化後，計算對照幼苗和測試幼苗的平均幼苗株冠面積的比值，對照和測試幼苗組的標準偏差和標準誤差。如果在測試幼苗和對照幼苗之間存在統計學差異，則結果就為可靠。在筆記本上記錄結果。
5-對於轉基因植物材料來說，將平板和幼苗丟棄在合適的處理容器中(帶透明塑料垃圾袋的灰色垃圾箱)。
實施例7.
依照廠商的實驗方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)將CspA和CspB基因的PCR產物連接入載體pCR-TOPO 2.1。將pCR-TOPO 2.1衍生物的NcoI/EcoRI片段亞克隆入pMON48421(圖7)，通過相同的限制性內切酶線性化。將含有35S啟動子、Csp基因和e9終止子的pMON48421衍生物的NotI片段在NotI位點亞克隆入pMON42916(圖17)，用於分別構建含有CspA和CspB基因的pMON56609(圖8)和pMON56610(圖9)。採用已知方法將所述質粒轉化到根癌農桿菌中。預計pMON56609含有編碼類似於SEQ ID NO7的蛋白的核苷酸序列。預計pMON56610含有編碼類似於SEQ ID NO9的蛋白的核苷酸序列。
實施例8.
農桿菌製備在含有卡那黴素50mg/L和潮黴素50mg/L(稱為LB/KH)的LB平板上對農桿菌菌株EHA105劃線。在共培養前兩天，將一環的農桿菌轉移到含10ml LB/KH的試管中，並於28℃黑暗中在振蕩器上溫育24小時。將該培養物在20ml LB/KH中稀釋到1∶100，並於28℃黑暗中在振蕩器上溫育過夜。第二天取1ml 1∶2稀釋的培養物置於比色杯中，用LB/KH作空白對照測定OD600。計算用於共培養的5ml O.D 1.0農桿菌懸液所需體積。
方程式 取所需體積的農桿菌培養物置於40ml離心管中，在7000rpm下離心7分鐘。除去上清液並乾燥沉澱物。將沉澱物重懸於5ml含有20mg/L乙醯丁香酮的共培養培養基(CC MEDIA-MS基礎鹽、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、硫胺素HCl 0.5mg/L、L-脯氨酸115mg/L、2，4-D 2mg/L)中。
稻胚轉化收穫溫室生長的Nipponbare和Taipai 309稻品種的穗(panicles)。通過將遂浸在50％商用漂白劑中10分鐘接著在無菌蒸餾水中漂洗進行滅菌。用70％乙醇處理穗3分鐘。然後從穗上剝離種子並一個一個地脫殼，接著轉移到含有0.1％tween 20溶液的falcon塑料試管中。接著在層流罩超淨臺中用70％乙醇處理種子。然後用無菌水漂洗種子。接著用50％漂白劑處理45分鐘。在無菌蒸餾水中漂洗種子5分鐘。最後用0.1％氯化汞處理種子5分鐘。再用無菌蒸餾水洗滌種子8分鐘。
在層流罩超淨臺中，在無菌條件下從無菌種子上切離胚，並放置在固體共培養培養基(含有2g/L phytagel的CC MEDIA)中。將50μL一滴的農桿菌懸液滴在滅菌的培養皿上。將10個胚轉移到每滴懸液中。進行15分鐘的感染。用滅菌移液管尖移去農桿菌懸液。轉移感染的胚到新鮮的固體CC MEDIA平板上並在黑暗中培養2天。在第3天用500mg/L頭孢噻肟洗滌胚。然後在滅菌濾紙上乾燥胚並置於延遲(Delay)培養基(MS基礎鹽、硫胺素HCl 1mg/L、穀氨醯胺500mg/L、氯化鎂750mg/L、乾酪素水解物100mg/L、蔗糖20mg/L、2，4-D 2mg/L、Pichloram 2.2mg/L、頭孢噻肟250mg/L)中。將胚在延遲培養基上於黑暗中培養7天。在該期間形成愈傷組織。轉移愈傷組織到選擇培養基(含有50mg/L潮黴素的延遲培養基)中並在黑暗中培養10天。之後將該愈傷組織在新鮮的選擇培養基中進行繼代培養。又10天後，轉移愈傷組織到再生培養基(MS基礎鹽、蔗糖30mg/L、激動素2mg/L、NAA-0.2mg/L、頭孢噻肟250mg/L、潮黴素25mg/L)中並在黑暗中培養7天。然後將愈傷組織轉移到新鮮的再生培養基中並移至30℃16小時光周期下。轉移愈傷組織發育的苗到生根培養基(半強度MS基礎鹽、蔗糖15g/L、頭孢噻肟250mg/L、潮黴素25mg/L)中。將生根的苗轉移到含水的測試用試管中並置於霧室中鍛鍊(hardening)。
挑選陽性植物。例如，可使用類似於實施例12-14和26-29所描述的那些方法來進行。包括所描述的用於產生轉基因植物後代的育種方法。
實施例9.
三葉期冷休克響應-CspB和CspA稻轉基因植物植物體製備發芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，並在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌溼濾紙上於30℃溫度和60％RH下發芽，使用了種子發芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗確定將發芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅砂壤土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到試驗結束。
CspB-R2植物分析實驗方案在100微摩/mt2/秒光照和70％RH下，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受10℃冷脅迫4天(Percival生長室)。在脅迫處理後，在溫室中讓植物恢復10天並在第10天對存活的植物進行生長觀察，記錄影像證據。每種品系每次處理具有10次重複且它們是完全隨機的。
結果在用於冷脅迫耐受性測試的8個不同品系中，與野生型相比，6個品系具有明顯更高的低溫耐受性。與野生型相比，包括R2-226-6-9-3、R2-226-29-1-1、R2-257-20-2-1、R2-238-1-1-3、R2-230-4-4-2和R2-257-3-1-3的品系通過表現高恢復和低縮小率的生長(對於無脅迫的對照)，顯示了高的低溫耐受性(表-1，平板-1)。品系R2-230-4-42，具有非常好的性能，其具有100％存活率並在恢復過程中保持良好的生長(表1)。
表1.CspB R2轉基因品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
(索引WT＝野生型)CspB-R3植物分析實驗方案在1000微摩/mt2/秒光照下，讓三葉期幼苗暴露於8℃冷脅迫1天(Percival生長室)。隨後，在28℃溫室中讓幼苗恢復15天並在恢復結束時記錄植物高度。
結果8個不同品系用於測試冷脅迫耐受性，與野生型(非轉基因)植物相比所有8個品系都顯示了改善的耐受性。這些結果證實了顯示改善低溫耐受性的R2分析數據(表2)。
表2CspB R3轉基因品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R2植物分析實驗方案在1000微摩/mt2/秒光照和70％RH的生長室中，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受10℃冷脅迫3天。在脅迫處理後，在溫室中讓植物恢復15天並在第15天記錄生長觀察。每一數值是12次觀察的平均值，且該實驗是根據如下完全隨機化(CRD)實驗設計來實施的。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的低溫耐受性。在該實驗中，與無脅迫的植物相比，在冷處理的對照植物(WT)中植物高度減少了約50％。而在冷處理的具有CspA基因的不同獨立品系轉基因植物中，植物高度減少在4.5％-22.50％之間(除了一種品系生長減少47.09％外)。這些結果表明CspA改善了稻的低溫耐受性(表3)。
表3CspA R2轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R3植物分析實驗I實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露於10℃冷脅迫3天。隨後，在28℃溫室中讓幼苗恢復30天並在恢復結束時記錄植物高度和幼苗存活率(在該實驗中，每一轉基因品系重複8次而野生型重複10次)。
結果經受了冷脅迫的6個轉基因品系在冷脅迫下較野生型表現更好。通過顯示改善的低溫耐受性，這些結果進一步證實了R2分析數據(表4)。
表4CspA R3轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察結果
注釋僅對存活植物記錄植物高度，以上給出了它們的平均值。
實驗II實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露於10℃冷脅迫1天。隨後，在28℃溫室中讓幼苗恢復30天並在恢復結束時記錄植物高度和幼苗存活率(在該實驗中，每一轉基因品系重複8次而野生型重複10次)。
結果經受了冷脅迫的5個轉基因品系在冷脅迫下較野生型表現更好。通過顯示改善的低溫耐受性，這些結果進一步證實了R2分析數據(表5)。
表5CspA R3轉基因稻品系三葉期冷脅迫恢復生長觀察值結果
三葉期熱脅迫響應植物體製備發芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，並徹底洗滌(在去離子水中約10分鐘)以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌溼濾紙上於30℃溫度和60％RH下發芽，使用了種子發芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗的確定將發芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。一周施用肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)一次直到試驗結束。
CspA-R2植物分析實驗方案在70％RH下，讓三葉期稻幼苗(12天的)經受50℃熱脅迫3天。在脅迫處理後，在溫室中讓植物恢復15天並在第15天記錄生長觀察值。每一數值是12次觀察的平均值。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的耐熱性。在該實驗中，與無脅迫的植物相比，在熱處理的對照植物(WT)中植物高度減少了超過50％。而在熱處理的帶有CspA基因的不同獨立品系轉基因植物中，植物高度減少在9.5％-35％之間。這些結果表明CspA改善了稻的耐熱性(表6)。
表6CspA R2轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
CspB-R3植物分析實驗方案將三葉期幼苗暴露於53℃熱脅迫2小時，隨後在28℃溫室中讓幼苗恢復15天並在恢復結束時記錄植物高度。
結果與野生型相比，在測試的8個轉基因品系中有7個品系在熱脅迫測試下表現更好。這些結果表明CspB改善了稻的熱耐性(表7)。
表7CspB R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
CspA-R3植物分析實驗I實驗方案將三葉期幼苗暴露於53℃熱脅迫3小時，隨後在28℃溫室中讓幼苗恢復30天並在恢復結束時記錄植物高度。
結果通過顯示改善的耐熱性，這些結果證實了R2分析數據(表8)。
表8CspA R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果
實驗II實驗方案在1000微摩光照下，讓三葉期幼苗暴露於50℃熱脅迫1小時，隨後在28℃溫室中讓幼苗恢復30天並在恢復結束時記錄植物高度。
結果通過顯示改善的耐熱性，這些結果證實了R2分析數據(表9)。
表9CspA R3轉基因稻品系三葉期植物熱脅迫恢復生長觀察結果。
水分脅迫響應植物體製備發芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，並在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌溼濾紙上於30℃溫度和60％RH下發芽，使用了種子發芽器(Serwell Instruments Inc.)。
CspB-R2植物分析實驗方案將發芽幼苗(3天的)轉移到兩種不同水平的水分脅迫中，該水分脅迫是在含蛭石的PVC盆中建立的，是依據田間持水量(FC)來測定的。FC-100％是飽和狀態(即100g蛭石需要350ml水)(Sharp等.，1988，Plant physiol.8750-57)。通過添加所需量的水，在含蛭石的PVC盆中建立不同水平的水分脅迫(即50％FC和25％FC)。在整個實驗過程中，通過每天添加由於蒸發所失去的水分量，保持不同脅迫水平中的水分狀態不變。在800微摩/mt2/秒光強度和60％RH的溫室中，讓幼苗在水分脅迫條件下生長15天。在生長的第15天，採用拍照記錄根和苗。每一品系每次處理重複10次，且它們是完全隨機化的。
通過採用如下公式計算生長減少的百分率。
結果對4個不同的CspB轉基因品系進行水分脅迫耐受性的分析。與野生型植物相比，在脅迫過程中所有測試的CspB轉基因品系都顯示出明顯更高的生長。上述轉基因品系包括R2-257-15-1-1、R2-238-1-1-3、R2-257-3-1-6和R2-226-6-9-3，與無脅迫的對照相比在根和苗生長中顯示最小的百分數減少(FC-100％)。在這些品系的根和苗生長中減少的範圍在11-25％之間。而野生型植物在生長中顯示最大的減少，其接近50％。這些結果表明CspA改善了稻的水分脅迫耐受性(表-10和表-11)。
表10cspB轉基因品系和野生型在水分脅迫結束時根和苗生長的比較
(索引WT＝野生型，R∶S＝根與苗比值)
表11cspB轉基因品系和野生型根和苗生長減少率的比較。
CspA-R2植物分析a.植物體製備發芽用0.01％氯化汞處理3分鐘對種子滅菌，並在milique水中徹底洗滌10分鐘以除去痕量的氯化汞。在milique水中浸泡3小時使滅菌種子吸漲。吸漲的種子在滅菌溼濾紙上於30℃溫度和60％RH下發芽，使用了種子發芽器(Serwell Instruments Inc.)。
三葉期幼苗的確定將發芽3天的幼苗轉移到溫室中的portrays(52.5mm(長)×26mm(深)×5.2mm(直徑))中，該溫室具有800微摩/mt2/秒的光強度和60％RH。在含有紅砂壤土的portrays中幼苗一直生長到三葉期(約12天)。將肥料溶液(N-75PPM，P-32PPM，K-32PPM，Zn-8PPM，Mo-2PPM，Cu-0.04PPM，B-0.4PPM和Fe-3.00PPM)噴灑到幼苗表面，一周一次直到試驗結束。
實驗方案在800微摩/mt2/秒光照和60％RH的溫室中，讓一個月大的幼苗經受水分脅迫3天。通過停止灌溉強加水分脅迫。在3天結束時，植物開始顯示出萎蔫症狀。通過用水灌溉植物減輕該脅迫，24小時後記錄植物顯示萎蔫症狀百分率的觀察值。在每次處理中每一品系保持最少12株植物。
結果與野生型相比，在所測試的7個獨立的CspA轉基因品系中有6個品系顯示改善的水分脅迫耐受性。在灌溉後66％的對照植物沒有從萎蔫中恢復，而在不同獨立品系的CspA轉基因植物之間，在灌溉後有5％-43％的植物顯示萎蔫症狀(除一個品系的植物顯示85％的萎蔫之外)。這些結果表明在稻中CspA改善了水分脅迫耐受性(表12)。
表12CspA R2轉基因稻品系的水分脅迫響應。
鹽脅迫響應CspB-R3植物分析實驗方案通過將發芽的幼苗(48小時的)轉移到帶有含200mMNaCl蛭石的PVC盆中生長10天，讓它們經受鹽分脅迫。在脅迫10天後，通過將幼苗轉移到含水蛭石的新盆中，讓它們恢復15天。在恢復結束時記錄諸如植物高度的生長觀察值。該實驗在完全隨機設計(CRD)後在溫室中進行，每次處理保持8次重複。
結果7個CspB轉基因品系和野生型植物經受了200mM NaCl脅迫。在該條件下，與野生型相比，5個轉基因品系表現更好。這些結果表明CspB改善了稻植物對鹽脅迫的耐受性(表13)。
表13CspA R2轉基因稻品系鹽脅迫恢復生長觀察結果
R3水分脅迫測定通過將它們轉移到含有蛭石的盆中，讓來自cspA的4個獨立轉基因品系(1，2，3，4)和野生型(Nipponbare 5號)的發芽的幼苗(3天的)經受水分脅迫。保持3種水平的水分狀態，它們是100％田間持水量(FC-100＝3.72毫升水/克蛭石)、25％田間持水量(FC25＝0.93毫升水/克蛭石)、15％田間持水量(FC15＝0.558毫升/克蛭石)。在800微摩./mt2/秒.光強度和60％RH的溫室中，幼苗在不同的水分狀態中生長30天。在整個實驗過程中，通過每天添加由於蒸發所失去的水分量，保持不同脅迫水平中的水分狀態不變。在第30天時，通過添加水分使其水平到FC100並保持15天，讓植物恢復。在實驗過程中，記錄諸如在脅迫(ES)結束時植物高度(pl.ht.)和根(R)苗(S)長度以及在恢復結束時乾重的生長觀察值。
每一品系每次處理重複10次，並且它們是完全隨機的。
表14恢復結束時平均苗和根長度(cm)
表15恢復結束時平均苗和根乾重(mg)
表16脅迫結束時平均苗長度
實施例10.
cspA構建pMON73607(圖10)
1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322載體以打開主鏈並切下CspA基因。通過凝膠純化分離主鏈片段。
2.從pMON56609(圖8)載體PCR擴增大腸桿菌cspA基因。使用PCR引物在基因的5』末端留下NcoI位點並在3』末端創建SwaI和ApaI位點。
3.連接PCR片段和pMON61322(圖11)主鏈。轉化入文庫效率(library efficiency)DH5α細胞。篩選的菌落使用ApaI和NcoIc來鑑定具有插入物的克隆。
4.對載體測序以證實cspA基因和質粒其他選定區域的保真性。
cspB構建pMON73608(圖12)1.用NcoI和ApaI酶切pMON61322載體以打開主鏈並切下HVA1基因。通過凝膠純化分離主鏈片段。
2.從pMON56610載體PCR擴增枯草桿菌cspB基因。使用PCR引物在基因5』末端留下NcoI位點並在3』末端創建SwaI和ApaI位點。
3.連接PCR片段和pMON61322主鏈。轉化入文庫效率DH5細胞。篩選的菌落使用ApaI和NcoIc來鑑定具有插入物的克隆。
4.對載體測序以證實Csp B基因和質粒其他選定區域的保真性。
實施例11.玉米植物轉化通過本領域公知方法可轉化玉米植物，例如，參見本文中實施例20-25。
實施例12.
可採用下列方法分析轉基因植物的拷貝數。
從嫩葉中收集葉組織，儘可能從靠近底部和葉的一側收集。將試樣置於96孔板中凍幹過夜。通過在每個孔中放置3個3mm金屬球並使用Mega研磨機在1200rpm下振動2分鐘均質組織。使用含有β-巰基乙醇、緩衝到pH 8的Tris、EDTA、NaCl和十二烷基硫酸鈉的標準緩衝液提取DNA。先用乙酸鉀再用氯仿進行提取，並用異丙醇進行沉澱。接著離心，用乙醇溶液洗滌並乾燥，在進一步分析前將DNA重懸於Tris-EDTA緩衝液中。
用多種限制性內切酶消化DNA並通過非變性瓊脂糖凝膠電泳分離片段。用NaOH溶液變性DNA。在含NaCl的Tris緩衝液中中和凝膠並通過毛細管作用轉印在尼龍濾膜上。在添加合適的探針前，將尼龍濾膜在含鮭魚精子DNA緩衝溶液中預雜交，該探針可以是放射性或DIG標記的。雜交後，洗滌印跡並通過對放射自顯影膠片曝光或用抗DIG抗體綴合物和合適的底物檢測DIG來檢測。
實施例13.
我們使用cspA和cspB的全長開放閱讀框在大腸桿菌中表達，使用了容許合成並純化His-標記的抗原的載體(Novagen，MerckKgaA，Darmstadt，Germany的分支機構)。使用了供應商，例如Strategic Biosolutions的產品，純化的抗原可用於產生多克隆抗體。所產生的抗體可用來測試表達CSP蛋白的植物。
實施例14.
轉基因玉米品系改良。在諸如玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)、玉米種質C(CORN OF GERMPLASM C)和玉米種質D(CORN OF GERMPLASM D)的種質中產原代轉化體生。原代轉化體自交並與相同的近交基因型非轉基因植物回交。將來自自交植物的種子在田地裡種植並通過Taqman接合性測定法測定以鑑定推定的純合選擇物，推定的雜合選擇物和負選擇物。將推定的雜合選擇物與多種合適的測交植物雜交，如玉米種質B(CORNOF GERMPLASM B)和玉米種質D(CORN OF GERMPLASM D)。收穫雜交的種子，手工脫殼，並通過選擇進行分組。其他育種方法也可採用，例如，參見本文實施例29。
實施例15.
對幼苗進行處理，限制可獲得水分至最適度以下水平使得處理產生可測的表型響應。例如，該處理可採取在若干天內限制水分量導致進行性水分虧缺的形式，或採取通過溶液培養滲透脅迫幼苗產生急性缺水的形式，或採用鹽處理。對該處理具有改善的表型響應的轉基因陽性植物可被篩選。測定的表型響應可包括在處理期間或在處理後恢復期間苗生長率或乾重累積、萎蔫或萎蔫恢復、以及根生長率和乾重累積。對于田間有效性試驗那些具有改善的響應將得到提升。篩選將需要許多在小盆中生長的轉基因陽性和轉基因陰性植物，這些植物在諸如生長室或溫室的可控環境中生長。被篩選的植物數量受與所應用的處理和所測表型相關的變量支配。
實施例16.
田間生長的植物可經限制可獲得水分至最適度以下水平的處理，使得可處理產生可測的表型響應。例如，該處理可採取在植物的後期生長和早期生殖發育期間，在若干天內限制植物可獲得水分量導致進行性水分虧缺的形式。在該處理中相對於轉基因陰性植物，篩選具有改善表型響應的轉基因陽性植物。測定的表型響應可包括在處理期間苗生長率、葉萎蔫、穀物產量以及諸如穀粒數量和千粒重的穗產量組分。對於第一年產量試驗那些具有改善響應的事件將得到提升。篩選可在具有可控灌溉的兩塊旱地區域的標準種植密度下進行。被篩選的植物數量受與所應用的處理和所測表型相關的變量支配。
實施例17.
一些所描述的基因將被克隆轉化入植物中，並以一種類似於如下的方法(實施例17-30)產生表型。例如，核苷酸和編碼SEQ IDNOS4-53的核苷酸。
構建目的載體使用本領域技術人員公知的方法構建GATEWAYTM目的(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)植物表達載體(pMON65154，圖13)。表達載體的元件概述於表17中。包含細菌複製功能的質粒pMON65154主鏈和來自於質粒pSK-的在大腸桿菌中表達的氨苄青黴素抗性基因。pMON64154中植物表達元件是本領域技術人員可以獲得的，表17中提供了每一元件的參考文獻。所有在表17中引用的位置指每一元件在圖13所披露的質粒圖中的鹼基對坐標。一般來說，pMON65154包含含有可操縱地連接編碼新黴素磷酸轉移酶II(nptII)基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子的選擇標記表達盒。該選擇標記表達盒3』區包含根癌農桿菌胭脂鹼合酶基因(nos)3』區和在其之後的馬鈴薯蛋白酶抑制因子II(pinII)基因3』區。質粒pMON65154還包含一個植物表達盒，使用GATEWAYTM克隆方法可以插入目的基因。該GATEWAYTM克隆盒5』側接有稻肌動蛋白1啟動子、外顯子和內含子的，3』側接有馬鈴薯pinII基因3』區。使用GATEWAYTM方法，用目的基因取代該克隆盒。包含目的基因的載體pMON65154及其衍生物在通過諸如微粒轟擊的直接DNA遞送的植物轉化方法中是特別有用的。本領域技術人員使用本領域公知方法可以構建具有相似特徵的表達載體。此外，本領域技術人員應當理解其他啟動子和3』區可用於表達目的基因，並可以使用其他選擇標記。
表17.
質粒pMON65154的元件
構建一種用於農桿菌介導的植物轉化方法的分離的質粒載體(pMON72472，圖14)。該質粒pRG76包括pMON65154中的目的基因植物表達盒、GATEWAYTM克隆盒和植物選擇標記表達盒。此外來自農桿菌的左和右T-DNA邊緣區被添加到該質粒上。右邊緣區位於稻肌動蛋白1啟動子的5』，左邊緣區位於pinII 3』序列的3』，該pinII 3』序列位於nptII基因的3』。此外，pMON65164的pSK-主鏈被質粒主鏈所取代以便於該質粒在大腸桿菌和農桿菌中複製。該主鏈包含多種宿主來源的在農桿菌中起DNA複製作用的oriV、pBR322來源的在大腸桿菌中起DNA複製作用的rop序列和用於在大腸桿菌和農桿菌中選擇所存在質粒的壯觀黴素/鏈黴素抗性基因。
表18中描述了存在於質粒載體pRG81中的元件。
表18.質粒載體pRG81的遺傳元件
實施例18.
編碼序列在插入諸如pMON65154(圖13)的GATEWAYTM目的植物表達載體之前通過PCR進行擴增。所有編碼序列皆可獲得自克隆的全長序列或DNA序列信息，使來自cDNA文庫期望序列的擴增得以進行。為了除去大部分的5』和3』非翻譯區，根據起始和終止密碼子處或其附近序列，設計PCR擴增引物。為了能通過重組入GATEWAYTM載體(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)進行克隆，PCR產物末尾帶有attB1和attB2序列。
兩種方法用於產生attB側翼的PCR擴增的目的序列。這兩種方法詳述於GATEWAYTM克隆技術使用說明書中(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。在第一種方法中，使用包含attB和模板特異性序列的一組引物。引物序列如下attB1正向引物5』GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN模板特異性序列3』(SEQ ID NO71)attB2反向引物5』GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN模板特異性序列3』(SEQ ID NO72)或者，attB接頭PCR用於製備attB側翼PCR產物。attB1接頭PCR使用兩組引物，即基因特異性引物和裝配attB序列的引物。設計所需DNA序列引物，包括attB1或attB2序列5』末端的12個鹼基對。使用的引物如下attB1基因特異性正向引物5』CCTGCAGGACCATG正向基因特異性引物3』(SEQ IDNO73)attB2基因特異性反向引物5』CCTGCAGGCTCGAGCTA反向基因特異性引物3』(SEQ IDNO74)第二組引物是attB接頭引物，具有如下序列attB1頭正向引物5』GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3』(SEQ ID NO75)attB2接頭反向引物
5』GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA3』(SEQ ID NO76)依照Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)所描述的方法，通過PCR擴增attB1和attB2側翼序列。如上所述從凝膠中純化並回收attB側翼PCR產物。
在某些情況下，使用GATEWAYTM技術，自PCR回收attB側翼序列，但不插入到供體載體(Donor Vector)中。當GATEWAYTM重組入供體載體失敗時，使用連接酶的常規克隆方法用於將DNA序列插入到中間載體(Entry Vector)(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中。中間載體的選擇取決於該載體中限制性內切酶位點和所需插入序列的相容性。用經選擇的限制性內切酶消化中間載體以除去ccdB基因，脫磷酸並通過凝膠純化。所選擇的限制性內切酶取決於所使用的中間載體和期望插入的序列。例如，使用EcoRI或其他諸如EcoRV和XmaI或NcoI和XhoI的限制性內切酶組合從pENTR11(圖15)中除去ccdB基因。其他限制性內切酶可與其他中間載體一起使用，用於GATEWAYTM方法中。為使用限制性內切酶消化中間載體，在期望PCR產物上產生合適的粘性末端是必需的。可通過多種本領域技術人員公知的方法產生粘性末端，例如限制性內切酶消化、接頭連接或在PCR過程中添加限制酶切位點。
在某些情況下，在PCR片段和中間載體上不可能產生合適的粘性末端。或者，要通過限制性內切酶消化cDNA克隆指導產生合適的粘性末端。但是，有可能產生平末端連接的PCR片段和中間載體。使用該方法，用限制性內切酶酶切中間載體以除去ccdB基因。用T4DNA聚合酶使得凝膠純化的線性中間載體平末端化。本領域技術人員知道其他製備平末端的DNA分子的方法，例如使用Klenow DNA聚合酶的方法。通過與T4 DNA聚合酶或其他合適的聚合酶、T4多核苷酸激酶以及磷酸酶溫育，PCR產物平末端化且較好地脫磷酸化。使用本領域公知方法進行中間載體和PCR產物的平末端連接。將連接產物轉化入大腸桿菌和質粒，分析單個菌落中插入DNA的存在和在中間載體中相對於attL位點的期望方向。選擇帶有緊接於開放閱讀框氨基末端的attL1序列的克隆。
更適宜地，當使用GATEWAYTM方法，attB側翼PCR產物不能插入質粒中時，使用克隆PCR產物的TA法(Marchuk等.，1991)。該TA法利用了Taq聚合酶末端轉移酶活性。使用在此所述的方法，用限制性內切酶酶切中間載體並產生平末端化。該平末端化線性中間載體與dTTP和Taq聚合酶溫育，在每條DNA鏈的3』末端添加一個胸腺嘧啶殘基。由於Taq聚合酶嗜好dATP，因此大多數產生的PCR產物通常在3』末端添加有一個腺苷。因此，中間載體和PCR產物具有互補的單鹼基3』突出物。在本領域技術人員公知的條件下連接後，將質粒轉化入大腸桿菌。從單個菌落中分離質粒並進行分析以鑑定在正確方向上具有期望插入物的質粒。或者，將末尾帶有attB位點的PCR產物TA克隆入商用TA克隆載體中，例如pGEM-TEASY(Promega Corporation，Madison，WI)。
在導入植物前，對所有PCR擴增產物測序。對通過GATEWAYTM法產生的目的表達載體中的PCR插入物測序，以證實所插入的序列編碼期望的胺基酸序列。如果使用連接法產生中間載體，則在使用GATEWAYTM技術產生目的表達載體前對中間載體中插入序列進行測序。點突變並不影響胺基酸編碼序列，即沉默突變是可接受的。
實施例19.構建表達載體GATEWAYTM克隆法(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)用於構建玉米轉化中使用的表達載體。該GATEWAYTM法詳盡描述於GATEWAYTM克隆技術使用說明書(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中。使用GATEWAYTM系統有利於編碼基因在植物表達載體中的高通量克隆。如上所述，通過PCR產生帶attB1和attB2側翼序列的基因序列。取決於所重組的序列，將attB1和attB2置於編碼序列的5』和3』，產生正義或反義表達載體。一種植物表達載體，pMON65154(圖13)，其中任一編碼序列都可在正義或反義方向插入，如實施例1所述得到構建，並在GATEWAYTM克隆方法中用作為目的載體。
兩種任取其一的方法用於在植物表達載體中插入PCR擴增的編碼序列。在第一種方法中，包含5』和3』末端attB1和attB2側翼序列的目的編碼序列的PCR產物與供體載體(pDONR201TM，InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)在BP CLONASETM存在下溫育。GATEWAYTM中間克隆物產生自該反應並轉化入大腸桿菌。從中間克隆物分離質粒DNA。為證實PCR反應的保真性，可對來自中間載體的插入編碼序列進行測序。將分離自大腸桿菌菌落中間克隆物的質粒DNA與線性化的目的載體溫育，優選pMON65154，在LRCLONASETM存在下產生包含目的編碼序列的植物表達載體。將來自LR CLONASETM反應的DNA轉化入大腸桿菌。分離來自目的表達載體的質粒DNA並測序以確定正確方向和該植物表達載體中的序列。在第二種產生植物表達載體的方法中，如上所述，將帶attB1和attB2側翼序列的PCR產物與供體載體(pDONR201TM，Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)及BP CLONASETM溫育。溫育後，等分量的反應混合物進一步與線性化的目的載體及LR CLONASETM溫育。將所產生的DNA轉化入大腸桿菌，並使用本領域公知的PCR或DNA印跡分析技術選擇含有目的編碼序列的植物表達載體。Invitrogen Life Technologies(GATEWAYTM克隆技術使用說明書)描述了這兩種產生包含目的編碼序列的植物表達載體的方法。
或者，使用限制性內切酶和連接酶產生中間載體。中間載體可獲得自EInvitrogen Life Technlogies(Carlsbad，CA)。每種中間載體，如pENTR1A、pENTR2B、pENTR3C、pENTR4和pENTR11，具有獨特的克隆和表達特性。pENTR11優先用於本發明的實踐中。本領域技術人員應當意識到其他中間載體也能使用。在使用限制性內切酶和連接酶將期望序列插入一種中間載體之前，在ccdB基因的每一側上需要對中間載體進行限制酶切消化。取決於在要被插入中間載體的DNA序列上所存在的限制酶切位點，使用多種不同組合的限制性內切酶。優選的中間載體是脫磷酸化的，以及在限制酶切消化後通過凝膠純化的。使用本領域技術人員公知的分子生物學常規方法將期望DNA序列插入中間載體。TA克隆(美國專利號5,827,657)是一種將PCR片段克隆入中間載體的優選方法。
載體(稱為pMON和5數字編號)以及其中包含使用GATEWAYTM克隆方法產生的編碼序列是，例如，SEQ ID NOS4-28。預計使用本文所述的方法，本發明的某些編碼序列可以克隆入植物表達載體。
實施例20.
在溫室中種植玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)植物。當胚長1.5-2.0mm時，從植物上收穫穗，通常在授粉後10-15天，最經常在授粉後11-12天。通過噴灑或將穗浸泡在80％乙醇中對穗進行表面滅菌，隨後風乾。或者，通過浸沒在含10％SDS的50％CLOROXTM中20分鐘對穗進行表面滅菌，然後用無菌水漂洗3次。
使用本領域技術人員公知的方法分離每粒種子的未成熟胚。在含有16.9mg/L AgNO3的培養基211(N6鹽、2％蔗糖、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L煙酸、1.0mg/L硫胺素-HCl、0.91g/L L-天冬醯胺、100mg/L肌醇、0.5g/L MES、100mg/L乾酪素水解物、1.6g/L MgCl2、0.69g/LL-脯氨酸、2g/L GELGROTM，pH 5.8)(稱為培養基211V)上培養未成熟胚3-6天，優選在微粒轟擊前培養3-4天。
實施例21.
已知農桿菌介導的玉米細胞和其他單子葉植物轉化的方法(Hiei等.，1997；美國專利號5,591,616；美國專利號5,981,840；公開的歐洲專利申請EP 0 672 752)。雖然多種農桿菌菌株可以使用(見上述參考文獻)，本發明人優先使用菌株ABI。該農桿菌ABI菌株來自菌株A208，一種C58胭脂鹼型菌株，通過在37℃下培養除去其中的Ti質粒，還含有修飾的Ti質粒pMP90RK(Koncz和Schell，1986)。一種根癌農桿菌雙元載體系統(An等.，1998)優選用於轉化玉米。業已描述了可替換的共整合Ti質粒(Rogers等，1988)，可用於轉化玉米。使用電穿孔(Wen-jun和Forde，1989)或三親株雜交(Ditta等.，1980)可將一種包含一或多個目的基因的雙元載體導入無害的(disarmed)農桿菌菌株中。雙元載體可含有選擇標記基因、可篩選的標記基因和/或一種或多種賦予轉化的植物所需表型性狀的基因。一種例證的雙元載體，pMON30113，示於圖4中。其他雙元載體可使用且為本領域技術人員公知。
在玉米細胞共培養前，農桿菌細胞可在28℃下LB(DIFCO)液體培養基中培養，該培養基含有合適的抗生素進行選擇用於修飾的Ti質粒和雙元載體的保持。例如，ABI/pMON30113，可在含50μg/ml卡那黴素的LB培養基中培養進行選擇用於pMP90RK修飾的Ti質粒的保持，以及100μg/ml壯觀黴素進行選擇用於雙元載體pMON30113的保持。在農桿菌菌株宿主中使用合適的選擇試劑來保持質粒，對於本領域技術人員而言是顯而易見的。在玉米細胞接種前，在室溫下於AB培養基(Chilton等.，1974)中培養農桿菌細胞過夜，該培養基含有用於質粒保持的合適的抗生素和200μM乙醯丁香酮。在玉米細胞接種之前即刻，優選通過離心沉澱農桿菌，在含有200μM乙醯丁香酮的MSVI培養基(2.2g/L GIBCO(Carlsbad，CA)MS鹽、2mg/L甘氨酸、0.5g/L煙酸、0.5g/L L-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/L L-脯氨酸、10g/L D-葡萄糖和10g/L蔗糖，pH 5.4)中洗滌，以0.1-1.0×109個細胞/毫升重懸於含200μM乙醯丁香酮的MSPL培養基(2.2g/L GIBCO(Carlsbad，CA)MS鹽、2mg/L甘氨酸、0.5g/L煙酸、0.5g/L L-吡哆醇-HCl、0.1mg/L硫胺素、115g/L L-脯氨酸、26g/L D-葡萄糖、68.5g/L蔗糖，pH 5.4)中。本領域技術人員可用其他培養基替換MSVI和MSPL。
如前所述分離未成熟玉米胚。在切除後0-7天內用農桿菌接種胚，優選在切除後馬上接種。或者，未成熟胚可培養超過7天。例如，如上所述，胚形成的愈傷組織可被誘發並與農桿菌共培養。優選地，切除未成熟玉米胚，浸沒在農桿菌懸液中，如上所述該懸液在MSPL培養基中製備並在室溫下與農桿菌溫育5-20分鐘。
在接種胚被轉移到半強度的含3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1％D-葡萄糖、2％蔗糖、0.115g/L L-脯氨酸、0.5mg/L硫胺素-HCl、200μM乙醯丁香酮和20μM硝酸銀或硫代硫酸銀的MS培養基(Murashige和Skoog，1962)中後。在黑暗中於23℃下將未成熟胚與農桿菌共培養1-3天。本領域技術人員可用其他培養基替換所述的培養基。
將共培養的胚轉移到培養基15AA(462mg/L(NH4)SO4、400mg/L KH2PO4、186mg/L MgSO4-7H2O、166mg/L CaCl2-2H2O、10mg/L MnSO4-H2O、3mg/L H3BO3、2mg/L ZnSO4-7H2O、0.25mg/LNaMoO4-2H2O、0.025mg/L CuSO4-5H2O、0.025mg/L CoCl2-6H2O、0.75mg/L KI、2.83g/L KNO3、0.2mg/L煙酸、0.1mg/L硫胺素-HCl、0.2mg/L吡哆醇-HCl、0.1mg/L D-生物素、0.1mg/L氯化膽鹼、0.1mg/L泛酸鈣、0.05mg/L葉酸、0.05mg/L對氨基苯甲酸、0.05mg/L核黃素、0.015mg/L維生素B12、0.5g/L水解酪蛋白胺基酸、33.5mg/LNa2EDTA、1.38g/L L-脯氨酸、20g/L蔗糖、10g/L D-葡萄糖)或含有1.5mg/L 2，4-D、500mg/L羧苄青黴素、3％蔗糖、1.38g/L L-脯氨酸和20μM硝酸銀或硫代硫酸銀的MS培養基中，並在黑暗中於27℃下無選擇培養0-8天。用於選擇轉化體和植物再生的培養基優選含有500mg/L羧苄青黴素。本領域技術人員可用其他抗生素替換其他控制農桿菌生長的抗生素。其他支持細胞培養的培養基可用作為選擇。在沒有選擇延遲(0天培養)情況下，選擇可以開始於25mg/L巴龍黴素。選擇培養基可包含培養基211(上述的)或培養基211的變體，其中N6鹽置換為MS鹽。兩周後，將胚形成的愈傷組織轉移到含100mg/L巴龍黴素的培養基中，約兩周間隔傳代培養一次。當共培養後選擇延遲時，開始將胚在含50mg/L巴龍黴素的培養基中培養，然後在含100-200mg/L巴龍黴素的培養基中繼續培養胚形成的愈傷組織。本領域技術人員可以在抑制缺少選擇標記基因的細胞生長的巴龍黴素濃度下培養組織，但轉化的愈傷組織所在的濃度是可以增殖的。或者，可以使用其他的選擇標記來鑑定轉化的細胞。相信在25-50mg/L巴龍黴素下初始培養約兩周，接著在50-200mg/L巴龍黴素下培養可導致轉化的愈傷組織恢復。選擇開始6-8周後恢復轉化體。植物再生自如上所述的轉化的胚形成愈傷組織，該愈傷組織在微粒轟擊後用於轉化體恢復。
實施例22.農桿菌介導的玉米愈傷組織轉化該實施例描述了使用農桿菌轉化玉米愈傷組織的方法。該方法作為例證使用了一種nptII選擇標記基因和巴龍黴素選擇劑。本領域技術人員應當意識到其他選擇標記和選擇劑組合可替換使用。
使用本領域技術人員公知的方法從未成熟胚誘導愈傷組織。例如，從諸如玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)基因型的發育的玉米種子上切除下1.5mm-2.0mm未成熟胚，並將胚軸側面朝下在培養基211V上培養，一般在切除後培養8-21天。或者，確定通過本領域技術人員公知的方法可以開始並維持確定的愈傷組織的培養。
依照描述於實施例21的方法製備用於植物組織接種的農桿菌。將50-100塊愈傷組織轉移到含約0.1-1.0×109cfu/ml的15ml農桿菌懸液的60mm ×20mm的培養皿中。一塊愈傷組織通常是在培養第21天產生自未成熟胚的整個愈傷組織或一塊2mm-8mm直徑確定的愈傷組織。愈傷組織在室溫下與農桿菌懸液溫育約30分鐘，接著通過抽吸除去液體。
添加約50μL無菌蒸餾水到60mm×20mm培養皿中的Whatman#1濾紙上。1-5分鐘後，將15-20塊愈傷組織轉移到每張濾紙上，用例如PARAFILM密封培養皿。愈傷組織和農桿菌在黑暗中於23℃下共培養約3天。
從濾紙上將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀和500mg/L羧苄青黴素的培養基211上，在黑暗中於27℃-28℃下培養2-5天C，優選3天。通過將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧苄青黴素和25mg/L巴龍黴素的培養基211上起動選擇。在黑暗中於27℃-28℃下培養培養2周後，將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧苄青黴素和50mg/L巴龍黴素的培養基211(培養基211QRG)中。兩周後愈傷組織在新鮮的培養基211QRG上傳代培養，並在黑暗中於27℃-28℃下進一步培養兩周。然後，將愈傷組織轉移到含20μM硝酸銀、500mg/L羧苄青黴素和75mg/L巴龍黴素的培養基211上。在黑暗中於27℃-28℃下培養2-3周後，鑑定巴龍黴素抗性愈傷組織。本領域技術人員應意識到愈傷組織傳代培養時間間隔是大約的，以更短的時間間隔轉移組織能加速選擇過程，如每周一次勝於兩周一次。
從轉化的愈傷組織再生的植物，轉移到土壤中並如實施例所描述在溫室中生長。在農桿菌介導的轉化後，培養基217(見實施例9)進一步添加500mg/L羧苄青黴素以及培養基127T(見實施例9)進一步添加250mg/L羧苄青黴素。使用表Y中概述的農桿菌介導的轉化來產生包含本發明基因的轉化的玉米植物。
實施例23.微粒轟擊的方法在微粒轟擊前約4小時，將未成熟的胚轉移到培養基211SV(增加蔗糖至12％的培養基211V)上。優選將25個未成熟的胚置於60×15mm培養皿中，排成5×5網格，將胚鱗的胚芽鞘末端以20度角輕輕地壓到培養基中。在轟擊前組織保存在黑暗中。
在微粒轟擊前，製備其上沉澱有所需DNA的金粒懸浮液。將10毫克0.6μrn金粒(BioRad)懸浮在50μL緩衝液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0)中，添加25μL 2.4nM期望DNA溶液到金粒懸浮液中，並輕輕地渦旋約5秒。添加75μL 0.1M亞精胺並輕輕地渦旋溶液約5秒。添加75μL 25％聚乙二醇(3000-4000分子量，American Type Culture Collection)溶液並輕輕地渦旋溶液約5秒。添加75μL 2.5M CaCl2並渦旋溶液5秒。添加CaCl2後，將溶液在室溫下溫育10-15分鐘。隨後將懸浮液在12,000rpm下離心20秒(Sorval MC-12V離心機)，移除上清液。用100％乙醇洗滌金粒/DNA沉澱兩次並重懸在10mL 100％乙醇中。將金粒/DNA製備物貯藏在-20℃下最多兩周。
使用放電粒子加速基因遞送裝置(美國專利號5,015,580)將DNA導入玉米細胞中。通過在薄片上分散310-320μL的金粒/DNA懸浮液，將金粒/DNA懸浮液包覆在Mylar薄片(Du Pont Mylar聚酯軟片，型號SMMC2，一面塗有鋁層，之上兩面都塗有PVDC共聚物，切成18mm的正方形)上。在金粒懸浮液固定1-3分鐘後，除去過量乙醇並風乾薄片。如美國專利號5,015,580所述進行玉米組織的微粒轟擊。在放電粒子遞送裝置中交流電電壓可以改變。對於玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)預培養的未成熟胚的微粒轟擊，優選使用35％-45％的最大電壓。微粒轟擊後，在黑暗中於27℃下培養組織。
實施例24.轉化細胞的選擇基於轉基因新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因的表達，在包含巴龍黴素的培養基上選擇轉化體。DNA遞送24小時後，將組織轉移到含25mg/L巴龍黴素的211V培養基上(培養基211HV)。在黑暗中於27℃下溫育3周後，將組織轉移到含50mg/L巴龍黴素的培養基211上(培養基211G)。3周後，將組織轉移到含75mg/L巴龍黴素的培養基211(培養基211XX)上。在9周的選擇後分離轉化體。表Y披露了使用在此披露的微粒轟擊方法進行轉化體實驗的結果。
實施例25.能育轉基因植物的再生能育轉基因植物產生自轉化的玉米細胞。將轉化的愈傷組織轉移到培養基217(N6鹽、1mg/L硫胺素-HCl、0.5mg/L煙酸、3.52mg/L苯甲酸嘌呤、0.91mg/L L-天冬醯胺一水化物、100mg/L肌醇、0.5g/LMES、1.6g/L MgCl2-6H2O、100mg/L乾酪素水解物、0.69g/L L-脯氨酸、20g/L蔗糖、2g/L GELGROTM，pH 5.8)中在黑暗中於27℃下培養5-7天。體細胞胚成熟和苗再生開始於培養基217上。將組織轉移到培養基127T(MS鹽、0.65mg/L煙酸、0.125mg/L吡哆醇-HCl、0.125mg/L硫胺素-HCl、0.125mg/L泛酸鈣、150mg/L L-天冬醯胺、100mg/L肌醇、10g/L葡萄糖、20g/L L-麥芽糖、100mg/L巴龍黴素、5.5g PHYTAGARTM，pH 5.8)中用於苗發育。培養基127T上的組織在400-600lux光照下於26℃下培養。在轉移到127T培養基後約4-6周，當苗約3英寸高並有根時，將苗轉移到土壤中，優選在3英寸盆中。在生長室中植物於26℃下培養2周，接著在移栽到用於溫室生長的5加侖盆前，在溫室中的霧臺(mist bench)上培養2周。植物在溫室中生長至成熟期並用近交的玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)進行反交授粉。從植物中收集種子並用於進一步的繁殖活動。
實施例26.從植物中分離核酸在幼苗移栽到土壤中後0-2周，從R0植物的葉組織中分離核酸，收集並在96孔收集盒中速凍，從每一植株上收集了大約100毫克的組織並在分析前貯藏在-80℃下。
使用改良的Qiagen Rneasy 96TM試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)從單個組織樣品中分離DNA和RNA。在700μL RneasyTMRTL緩衝液(Qiagen Inc.，Valencia，CA)中使用Bead攪拌器(BiospecProducts，Bartlesville，OK)均質100毫克的冷凍組織。樣品在3200rpm下離心15分鐘，並將全部上清液轉移到Promega WIZARDTM透明平板(Promega Corporation，Madison，WI)的孔中。通過真空過濾透明平板澄清樣品溶液。澄清的上清液用於核酸提取。
對於DNA提取，將70μL澄清的樣品轉移到v-孔PCR平板上，用粘合箔覆蓋，並加熱至95℃，持續8分鐘。在0℃下溫育樣品5分鐘，接著離心3分鐘以除去不溶物。Sephadex G-50凝膠過濾盒(Edge Biosystems，Gaithersburg，MO)在2000rpm下離心2分鐘作為準備。將50μL熱處理的上清液加載到每個孔中，並將盒在2500rpm下離心2分鐘。將額外的20μL TE緩衝液添加到柱流出液中，並在分析前將樣品平板貯藏在-20℃下。
對於RNA提取，將500微升的澄清溶液轉移到清潔的96孔樣品盒中。在每個孔中添加250微升的100％乙醇，並與樣品充分混合。然後將全部約750微升的溶液加載到Promega WIZARDTM過濾單元中Qiagen RneasyTM結合平板的孔中。將500毫升的RW1緩衝液(QiagenInc.，Valencia，CA)添加到每個孔中，並通過真空過濾除去緩衝液。將80微升不含RNA酶的DNA酶(Qiagen Inc.，Valencia，CA)添加到每個孔中，在室溫下溫育15分鐘，通過真空過濾將DNA酶溶液從孔中抽出。將額外的500微升RW1緩衝液(Qiagen Inc.，Valencia，CA)添加到孔中，並通過真空過濾除去該緩衝液。使用500微升的RPE緩衝液2X(Qiagen，Valencia，CA)通過真空過濾對樣品進行進一步的洗滌。將提取平板置於微量滴定板上並在3000rpm下離心3分鐘以除去所有殘留於過濾器中的RPE緩衝液溶液。添加80微升的RNA級水(不含DNA酶)到每個孔中，然後在室溫下溫育2分鐘。將提取平板和微量滴定板在3000rpm下離心3分鐘，並將RNA製備物於-80℃下冷凍貯藏在收集平板中。
實施例27.拷貝數測定使用TAQMAN法測定R0植物中轉基因拷貝數。用來自馬鈴薯pinII基因3』區的序列構建的pMON65154和pRG76GATEWAYTM目的載體，可用於轉基因插入物拷貝數的測定。pinII正向和反向引物如下正向引物5』ccccaccctgcaatgtga 3』(SEQ ID NO77)反向引物5’tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3』(SEQ ID NO78)pinII TAQMAN探針序列是5』cctagacttgtccatcttctggattggcca 3』(SEQ ID NO79)。
該探針在5』末端標記有螢光染料FAM(6-羧基螢光素)，淬滅劑染料TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明)通過接頭連接在該探針的3』末端。TAQMAN探針獲得自Applied Biosystems(FosterCity，CA)。在TAQMAN拷貝數測定中，_SAT，一種單拷貝玉米基因用作為內標。SAT引物如下正向引物5』gcctgccgcagaccaa 3』(SEQ ID NO80)反向引物5』atgcagagctcagcttcatc 3』(SEQ ID NO81)SAT TAQMAN探針序列是5’tccagtacgtgcagtccctcctcc 3』(SEQID NO82)該探針在其5』末端標記有螢光染料VICTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在其3』末端具有淬滅劑染料TAMRA。
依照廠商說明書(Applied Biosystems，Foster City，CA)，進行TAQMANPCR。在每次測定中使用5-100ng DNA。PCR擴增和TAQMAN探針檢測在1X TAQMAN Universal PCR MasterMix(Applied Biosystems，Foster City，CA)中進行，其含有AmpliTaqGoldDNA聚合酶、AmpEraseUNG、含有dUTP的dNTPs、PassiveReference 1和優化的緩衝液。800nM的每種正向和反向pinII引物以及150nM的pinII TAQMAN探針用於TAQMAN測定。200nM的每種Sat正向和反向引物以及150nM的Sat TAQMAN探針用於TAQMAN拷貝數測定。TAQMANPCR在50℃下進行2分鐘，在95℃下進行10分鐘，接著進行在95℃下15秒和在60℃下1分鐘的40個循環。使用ABI Prism 7700序列檢測系統或ABI7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)測定實時TAQMAN探針螢光。依照TAQMANEZ RT-PCR試劑盒使用說明書(Applied Biosystems，Foster City，CA)計算Cγ值。ΔΔCγ值計算為Cγ(內標基因(Sat))-Cγ(轉基因)-Cγ(非轉基因植物中內標基因(Sat))。依照表12中標準拷貝數賦值如下。
表19.用於TAQMAN測定拷貝數的標準
含有本發明基因的植物可以通過TAQMAN法分析拷貝數。通過將TAQMAN和DNA印跡雜交，用DNA印跡分析證實在被分析的約80％的植物中TAQMAN拷貝數測定結果。
實施例28.基因表達測定通過TAQMANRT-PCR測定本發明轉基因的表達，其使用了來自Applied Biosystems(Foster City，CA)的TAQMANEZ RT-PCR試劑盒。測定相對於轉基因標準表達的RNA表達，該轉基因標準是稱為DBT418的轉基因玉米事件，包含可操縱地連接pinII 3』非翻譯區的蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)cryIAI基因。該DBT418事件以可賦予對諸如玉米螟(European Corn Borer)的鱗翅類昆蟲商用水平抗性的水平表達cryIAI基因，並為DEKALB GeneticsCorporation以DEKALBt商標名作為商品出售。用來自馬鈴薯pinII基因3』區的序列構建pMON65154和pRG76GATEWAYTM目的載體，可用於任何插入目的載體的編碼序列轉基因轉錄物水平的測定。之前描述的pinII引物和探針用於TAQMANRT-PCR。泛素融合蛋白(UBI)RNA用作為所有TAQMANRT-PCR測定中的內標。使用的UBI引物如下正向引物5』cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3』(SEQ ID NO83)反向引物5』ccaacaggtgaatgcttgatagg 3』(SEQID NO84)UBI TAQMAN探針序列是5』catgcgccgctttgcttc 3』(SEQ ID NO85)該UBI TAQMAN探針在其5』末端標記有螢光染料VICTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在其3』末端具有淬滅劑染料TAMRA。
依照描述於TAQMANEZ RT-PCR試劑盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA)中的一步法，進行逆轉錄、PCR擴增和TAQMAN探查。在每次測定中使用5-100ng的總RNA。來自DBT418事件體外轉錄的對照RNA被包括作為每個平板上的對照，運轉濃度範圍為0.01pg-10pg。來自DBT418葉和來自非轉基因近交玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)的總RNA分別作為正對照和負對照。在含有3mM乙酸錳，300μM每種dATP，dCTP，dGTP和dUTP，100單位rTthTM(Applied Biosystems，Foster City，CA)DNA聚合酶和25單位AmpErase UNG(Applied Biosytems，FosterCity，CA)的TAQMANEZ緩衝液(50mM N-二羥乙基甘氨酸、115mM乙酸鉀、0.01mM EDTA、60mM Passive Reference 1、8％甘油，pH 8.2，Applied Biosystems，Foster City，CA)中進行RT-PCR。RT-PCR進行如下在50℃下2分鐘，在60℃下30分鐘，在95℃下5分鐘，接著進行在95℃下20秒和在60℃下1分鐘的40個循環，400nM的每種正向和反向引物用來擴增pinII序列，200nMTAQMANpinII探針用來檢測。使用400nM每種正向和反向引物擴增UBI RNA，200nM UBI TAQMAN用來檢測。使用ABI Prism7700序列檢測系統或ABI7900HT序列檢測系統(AppliedBiosystems，Foster City，CA)測定TAQMAN螢光。相對於DBT418中轉基因表達，對本發明轉基因表達定量，並記錄轉基因表達對DBT418表達的比值，即2-(ΔΔC)γ(轉基因)/2-(ΔΔC)γ(DBT418)。
實施例29.植物育種回交可用來改良源植物(starting plant)。回交將來自源植物的特定期望性狀轉移到缺少該性狀的近交種和其他植物中。其可進行如下，例如，通過將優良的近交種(A)(回交親本)與供體近交種(非回交親本)進行第一次雜交，該供體近交種攜帶有對於所討論性狀合適的基因，例如，依照本發明所製備的構建體。在所產生的後代中選擇期望性狀從非回交親本轉移的第一次雜交的後代，然後將所選擇的後代與所述優良的回交親本(A)回交。在5次或更多次回交後產生了對期望性狀的選擇，對於控制要被轉移性狀的基因座而言，該後代是半合子，但對於大多數或幾乎所有的其他基因來說，與類似於所述優良的親本。最後一次回交應當自花授粉以產生對於被轉移基因，即一個或更多個轉化事件，而言是純系繁育的後代。
因此，通過一系列育種操作，所選擇的轉基因可從一種品系轉移到全部不同的品系中，無需進行進一步的重組操作。由於它們具有與任何其他基因相同的典型遺傳學行為且可以一種與其他玉米基因相同的方法通過育種技術進行操作，因此轉基因是有價值。因此，可以產生對於一種或更多種轉基因而言是純合的近交植物。通過雜交不同的近交植物，可以產生大量具有不同轉基因組合的不同雜種。這樣，可以產生具有與雜種密切相關的期望農學性狀(「雜種優勢」)以及通過一種或多種轉基因賦予期望性狀的植物。
期望將本發明的基因滲入到玉米雜種中用於鑑定轉化植物中每種基因所賦予的表型。導入轉基因的宿主基因型，優選玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)，是一種優良的近交種，所以僅需有限次數的育種就可產生高產量的玉米雜種。將再生自愈傷組織的轉化植物與諸如玉米種質A(CORN OF GERMPLASM A)的相同基因型的植物進行雜交。後代自花授粉兩次並鑑定對於轉基因純合的植物。為了產生雜種，將純合的轉基因植物與測交親本雜交。該測交親本是一種屬於與轉基因親本不同的雜種優勢群的近交種，已知其能產生高產量的雜種，例如產生自玉米種質A(CORN OFGERMPLASM A)和玉米種質E(CORN OF GERMPLASM E)或玉米種質B(CORN OF GERMPLASM B)雜交的雜種。
實施例30.評估表現型的方法本發明基因的表達在轉化細胞和植物中產生了各種表型，如在此中所披露的。在愈傷組織轉化和植物再生過程以及在植物和後代中，收集表型數據。收集在轉化的愈傷組織中與外觀形態以及愈傷組織生長相關的表型數據，例如，苗、根、澱粉、類粘蛋白、無胚胎發生、增加的生長率、減少的生長率、死亡。應當預計本領域技術人員可以意識到轉化愈傷組織中的其他表型性狀。
在植物再生和再生植物轉移到土壤的過程中也收集表型數據。表型數據包括諸如正常植物、叢生植物、狹葉、具條紋葉、有結表型、缺綠症、白化體、花色素苷產生、buggy whipped(一種本領域公知的現象，其中大多數新生葉伸長且互相卷繞)或改變的雄花穗、穗或根的性狀。預計本領域技術員能識別轉化植物中其他的表型性狀。
多種表型在植物育種和近交種及雜種植物測定過程中被監測。例如，在R0和R1植物(直接再生自愈傷組織的植物及其直系後代)中，記錄株型(常規形態性狀，例如上述對於幼苗所描述的那些)和產生自上述植物的穀粒的營養組成。營養組成分析可以包括胺基酸組成，蛋白、澱粉和油類的量，蛋白、澱粉和油類的特性，纖維、灰分、礦物質含量可都被測定。預計本領域技術人員可以進行包括穀粒其他組分在內的分析。在R2和R3植物中，觀察花粉釋放日、抽穗日和株型。此外，作R2植物代謝物分布圖。使用本領域技術人員可獲得的方法，可分析植物中50-100種或更多種的代謝物，由此建立了該植物的代謝物指紋圖譜。另外，在田間條件下測定R3植物中葉伸長速度。在包含本發明轉基因的雜種中可以測定多種表型。例如，可以記錄產量、水分、容重、營養組成、葉綠素含量、葉溫、林分、幼苗活力、株高、葉數目、分櫱、支柱根、持綠性(stay green)、莖部倒伏、根部倒伏、植物健康、不結實/增殖力、green snap、有害物抗性(包括疾病、病毒和昆蟲)以及代謝物分布圖。此外，可記錄雜種收穫的穀物的表型性狀，包括穗上每行種子的數量、穗上種子的行數、種子敗育、種子重量、種子大小、種子密度和穀物物理屬性。此外，在雜種或近交種中可以測定諸如光合作用、葉面積、外殼結構、種子乾燥率和節間長的特性。預計可以對表達本發明基因的轉基因植物作出轉錄分布圖。
為測定表達本發明基因的轉基因植物的雜種產量，應當意識到雜種必須在玉米常規種植的地理位置中的多個位置處進行測試，如，愛荷華州、伊利諾斯州或在美國中西部的其他位置。為了鑑定轉基因對於玉米雜種改良的貢獻，預計多於一年的產量測試是需要的。因此，可以在第一年在足夠數量的位置處評估轉基因雜種，以鑑定與非轉基因雜種對應物至少約10％的產量差異。第二年在足夠的位置處進行產量測試，為了能在兩種雜種之間鑑定出4-5％的產量差異，需要足夠多的重複。此外，在第二年的產量測試中，可以在正常的田間條件和脅迫條件下評估雜種，如，在水分或種群密度脅迫條件下。本領域技術人員知道如何去設計產量試驗使得在兩種雜種之間可以檢測到期望精度級別的統計學顯著的產量差異。
實施例31.玉米種子的表面滅菌和吸漲對於每批轉基因而言，通過將約50粒種子放在裝有50ml含0.01％Triton X-100的30％漂白劑(次氯酸鈉溶液＝Chlorox或等價物)溶液的滅菌的500ml Erlenmyer燒瓶中並在定軌搖床上旋轉該燒瓶5分鐘對它們進行表面滅菌。然後，倒掉漂白劑溶液並用約100ml的滅菌去離子水洗滌，再倒掉洗滌用水。重複多於4次的滅菌水洗滌，在種子上留下最後一次洗滌用水。在該水中於室溫下溫育種子24小時，用於在起泡條件下的吸漲(通過0.2μm濾紙)。
I.製備Phytotrays中的培養基製備用於一些Phytotrays的水-瓊脂培養基。我們使用PhytotrayIT(或塑料盒60×30×15cm)，翻轉位置讓該容器中間大的一面在底部，並將較小的一面作為蓋子。通過在45分鐘的液體循環周期中，在去離子水中高壓滅菌0.3％BactoAgar，製備足夠的水-瓊脂培養基，每個Phytotray 100ml。冷卻培養基至其易於操作為止，當其還熔化時，向每個Phytotray中倒入約100ml。
II.玉米冷幼苗活力測定
●當培養基凝固時，將其和滅菌的種子放到層流罩超淨臺中。
●使用滅菌鑷子，挑選20粒健康的，極其一致的種子並將種子放在一個Phytotray中用於該測定，均勻間隔種子使得任一個體稍後能容易地拔除。
●放置種子使得胚一側斜向下插入，且種子正好在瓊脂表面下。在該位置，出現的苗和根能直接伸長而不受限。
●於22℃下在培養基中溫育種子一周，或直到大部分的種子生根並開始從瓊脂顯露出來為止。
●除保留10株生長極其一致的幼苗外，在層流罩超淨臺中拔除所有的幼苗。
●將Phytotrays轉移到低溫植物生長室中，設定在10℃和16小時晝周期並在此溫育2周。
●將Phytotrays移回到22℃下保持一周。
●拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，並測量每3株幼苗的鮮重g，記錄在筆記本上。
適應冷發芽和出苗測定。
與上述相同，但具有如下例外●在I中最後一次水洗滌後，在過夜吸漲步驟中將燒瓶置於10℃。在10℃下也預冷含有凝固培養基的Phytotrays。
●在冷卻的Phytotrays中播種冷吸漲的種子後，將它們直接置於10℃冷室中。
●約5天後，除保留10株胚根具有大約相同長度的生長極其一致的種子外，拔除其他所有的種子。將Phytotrays送回10℃冷室中保持1-2周。拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，並測量每3株幼苗的鮮重，記錄在筆記本上。
●將第二組的Phytotrays轉移到22℃下保持1周。
拔除幼苗，測量每株幼苗的根長和苗長，記錄在筆記本上。
實施例31.構建用於大豆轉化的質粒實施例(用於CspA和B構建體-pMON73983和73984)pMON73983(圖18)是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在大豆中類似於枯草桿菌CspA的蛋白(SEQ ID NO1)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspA基因，基於來自隸屬於國立衛生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫學圖書館(National Library of Medicine)的國家生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的CspA序列信息(Genbank#M30139)，設計兩條基因特異性引物MSA452和MSA453。MSA452的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG(SEQ ID NO86)，其在CspA翻譯起始位點處退火併在5』末端導入StuI和BglII位點，MSA453序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC(SEQ ID NO87)，其在CspA最後密碼子處退火併在該引物末端導入BamHI和EcoRI位點。反向引物MSA453被設計用來匹配Genbank基因序列的3』末端。
使用引物MSA452和MSA453、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57397(圖3)作為模板進行PCR反應。該模板與GenBank序列CspA基因的3』末端不同。擴增的CspB DNA通過凝膠電泳純化並連接到pCR-XL-TOPO載體(Invitrogen)上。按照廠商的實驗方案，將連接反應物轉化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)中。挑選出四個轉化體菌落並使用Qiagen Miniprep試劑盒小量製備DNA。使用M13-特異性正向和反向引物對插入物進行測序。將含有正確序列的克隆命名為pMON73981並用於進一步的亞克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73881DNA以分離CspA基因片段。繼續用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然後通過GeneCleanII試劑盒純化。連接該CspB片段和純化的載體pMON73980並將連接反應物電轉化入大腸桿菌DH10B細胞中。在含壯觀黴素的培養基上挑選轉化體。由轉化體小量製備DNA，使用CaMV35S-啟動子特異性正向引物檢測DNA中插入物的存在。含有該插入物的克隆命名為pMON73983。大量製備DNA並進行一系列的經證實的消化，包括BgIII、EcoRI、PstI、EcoRI+BamHI、StuI+XhoI。這些證實了正確的克隆。
pMON73984是一種雙元載體，用於農桿菌介導的轉化和在擬南芥中類似於枯草桿菌CspB的蛋白(SEQ ID NO2)的組成型表達。為克隆該枯草桿菌CspB基因，基於來自隸屬於國立衛生研究院(National Institutes of Health(NCBI))之國家醫學圖書館(NationalLibrary of Medicine)的國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information)的CspB序列信息(Genbank #X59715)，設計兩條基因特異性引物MSA454和MSA455。MSA454的序列是GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG(SEQ ID NO88)，其在CspB翻譯起始位點處退火併在5』末端導入StuI和BglII位點，MSA455序列是CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG(SEQ ID NO89)，其在CspB最後密碼子處退火併在該引物末端導入BamHI和EcoRI位點。反向引物MSA455被設計用來匹配Genbank基因序列的3』末端。使用引物MSA454和MSA455、高保真Taq聚合酶(BRL)和pMON57399作為模板進行PCR反應。該模板與GenBank序列CspB基因的3』末端不同。擴增的CspB DNA通過凝膠電泳純化並連接到pCR-XL-TOPO載體(Invitrogen)上。按照廠商的實驗方案，將連接反應物轉化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)中。挑選出四個轉化體菌落並使用Qiagen Miniprep試劑盒小量製備DNA。使用M13-特異性正向和反向引物對插入物進行測序。將含有正確序列的克隆命名為pMON73982並用於進一步的亞克隆。
用StuI和BamHI消化PMON73882DNA以分離CspB基因片段。繼續用StuI和BamHI消化pMON73980DNA，然後通過GeneCleanII試劑盒純化。連接該CspB片段和純化的載體pMON73980並將連接反應物電轉化入大腸桿菌DH10B細胞中。在含壯觀黴素的培養基上挑選轉化體。由轉化體小量製備DNA，並使用CaMV35S-啟動子-特異性正向引物檢測DNA中插入物的存在。含有該插入物的克隆命名為pMON73984。大量製備DNA並進行一系列的經證實的消化，包括BglII，EcoRI，PstI，EcoRI+BamHI，StuI+XhoI。這些證實了正確的克隆。大豆植物通過用上述穩定地整合入其基因組中的pMON構建體通過轉化產生。
實施例32.
用來自上述被研究的實施例10和11的DNA構建體轉化玉米植物溫室●對耐旱性進行兩次試驗，一次測試10個cspA事件，另一次測試10個cspB事件。
●對來自每一事件的24株轉基因陽性和24株轉基因陰性雜種幼苗進行測試(所有的種子來自分離的雜種穗)。
●該測試在溫室工作檯上進行。
●該處理包括限制給水和監測每一容有植物盆的總盆重量。每個充滿水的盆重約1000g，限制給水直至每個盆重量到達400g位置，接著在其餘的實驗過程中讓盆維持在該重量。
●在整個試驗過程中，通過測量從盆土壤表面到「最高」葉片的頂端的距離確定株高。從這些測量中，通過比較兩次測量之間的高度來確定LER(葉伸長速度)。
●在一個事件中，在乾旱過程中進行轉基因陰性和轉基因陽性植物之間LER的比較。
●對於所測試的3/10的事件，在試驗過程中對於LER，cspA轉基因植物得到明顯(p＜0.10)改善。
●對於所測試的3/10的事件，在試驗過程中對於LER，cspB轉基因植物得到明顯(p＜0.10)改善。
田間效率●對於在生長的營養階段後期耐旱性使用雜種種子進行3次試驗，一次測試16個cspB事件(CA)，另一次測試21個cspB事件(KS)，還一次測試14個cspA事件(HI)。
●對於CA和HI試驗，苗行(rows)含有約34株植物，分離所存在的轉基因，分別出現6和4次重複。分離的苗行來自於分離的穗。
●對於KS試驗，苗行含有約34株植物；作為轉基因和非轉基因配對的作物行，具有6次重複。
●該處理包括在生長的營養階段後期限制給水約10天(給予少量維持植物生存所必需的水)。10天後，對植物進行良好灌溉直至收穫。
●在整個試驗過程中，測定許多種表型，包括LER、葉綠素(用SPAD儀)和光合作用率。在試驗後，測定的額外表型包括花粉釋放日和抽穗日、以及諸如種子/穗、具有種子的穗、種子重量和產量的穗特徵。
●在一個事件中以及在所有的構建體中，進行轉基因陽性和陰性植物之間的表型比較。
●在CA試驗中，在乾旱處理過程中或之後，cspB作為構建體(在營養性狀的所有事件和重複性狀的「最佳」6個事件中)轉基因陽性植物顯著地(p＜0.10)改善了LER、葉溫和種子/穗。
●在CA試驗中，在乾旱處理過程中或之後，個別事件顯著地(p＜0.10)改善了LER、平均穗長、種子質量/穗、氣孔導度和抽穗日。
●在KS試驗中，cspB作為構建體(在營養性狀的所有事件和重複性狀的「最佳」6個事件中)轉基因陽性植物顯著地(p＜0.10)改善了LER、穗上承載的種子/行、種子/穗、種子/植物、莢重和產量。
●在KS試驗中，個別事件顯著地(p＜0.10)改善了LER、光合作用率、氣孔導度、穗/行和種子/植物。
●在HI試驗中，3個事件顯著地(p＜0.10)改善了LER(在HI中葉綠素含量是唯一測定的其他表型).
CA和KS結果概述cspB-KS生境(site)田間效率結果概述1.田間設計、位置均勻性和種植及取樣的執行都符合能產生信息數據集合的高質量的試驗。
2.限水處理以一種對所有測定表型，特別是LER、葉綠素和光合作用率，產生處理影響的方式執行。
3.影響營養和再生的表型的處理在統計學滿足是實數的且滿足觀察到統計顯著水平的轉基因介導的改良之用。
4.在包含轉基因的植物中，一個或多個事件在統計學上改善了LER、葉綠素、光合作用率、氣孔導度、葉溫、花粉釋放日、抽穗日、開花期抽絲間隔、穗/盆、種子/穗、種子/植物、莢重和估計產量。
5.在幹處理中，對於LER、穗/盆、種子/植物、莢重和估計產量，在溼處理中，對於LER觀察到構建體水平統計學改善p＜0.10。
表20.
cspB-CS生境田間效率結果概述(字形變化)
1.田間設計、位置均勻性和種植及取樣的執行都符合能產生信息數據集合的高質量的試驗。
2.限水處理以一種對所有測定的營養表型，特別是LER、葉綠素和光合作用率，產生處理影響，但不對所有的再生表型產生處理影響的方式執行。
3.影響目的表型(營養)的處理在統計學上滿足是實數的且滿足觀察到統計顯著水平的轉基因介導的改良之用。
4.在包含轉基因的植物中，一個或多個事件在統計學上改善了LER、葉綠素、光合作用率、氣孔導度、葉溫、花粉釋放日、抽穗日、開花期抽絲間隔、穗/盆、種子/穗、平均穗長和種子質量/穗。
5.在幹處理中，對於LER、葉溫和花粉釋放日，在溼處理中，對於ASI觀察到構建體水平統計學改善。
表21.
這些事件中的許多業已隨後被測試用於改善冷發芽效率和幼苗在冷環境下生長，但不被證實是有效的。因此，這些由啟動子驅動的基因不太可能在玉米中起改善冷發芽或幼苗在冷環境下生長的作用，但不同的啟動子(propomters)驅動相同的基因，或不同的冷休克蛋白可以在玉米中起改善這些表型的作用。
序列表110Monsanto Technology120用於增強植物非生物肋迫耐受性的方法及其組合物130Docket number(38-21)51768C16095170PatentIn version 3.2210121170212PRT213大腸桿菌300
301Goldstein，等302大腸桿菌主要冷休克蛋白303Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)304873051306283-2873071990-01-01308M301393091993-10-20313(1)..(70)4001Met Ser Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70210221167212PRT213枯草桿菌300
308X597153091996-03-29313(1)..(67)4002Met Leu Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala65210321128212PRT213人工序列
220
223Prosite基序PS00352220
221MISC_FEATURE222(6)..(6)223Xaa＝6-7個胺基酸(任意胺基酸)220
221MISC_FEATURE222(15)..(15)223Xaa＝任意胺基酸220
221MISC_FEATURE222(17)..(17)223Xaa＝任意胺基酸220
221MISC_FEATURE222(22)..(22)223Xaa＝任意胺基酸4003Phe Tyr Gly Phe Ile Xaa Asp Glu Arg Leu Ile Val Met Phe Xaa His1 5 10 15Xaa Ser Thr Lys Arg Xaa Leu Ile Val Met Phe Tyr20 252104211545212DNA213大豆220
221CDS222(61)..(354)
4004attcggctcg aggaccttag aaagagaagg aaaaaaaaaa cttgtgtttc ttgggaagcc 60atg agc acc acc gag agt caa aga tat aag ggc aca gtg aaa tgg ttc108Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe1 5 10 15aac gag gag aag ggt ttc ggt ttc ata act ccc gaa gat ggt ggc tct156Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser20 25 30gat ctc ttc gtt cac tac agt gcg atc caa acc gac ggc ggc ttc cgc204Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg35 40 45acc ttg tcg gag ggt cag tca gta gag ttc ctc gtc act cag gac gac252Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp50 55 60agc ggg cga gcc gcg gcc gtc aac gtg acg acc acc acg gtt aaa tct300Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser65 70 75 80agt gac agc ggt aac ggg gaa aac tct ggt ggt gat gct gcc aat gtt348Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val85 90 95gag aaa taagtgagaa tgaattattg gagtttcctg aattgcgagt atgatattta 404Glu Lystattgatagt tggacaatat actagtccat tggtatttta tattttatta tattatctct 464ggttattggc atttggttcc aaacttgtaa tacatttatc atgtgtttaa cgtggttatg 524tagtaagttg ttggatgtgt c545210521198212PRT213大豆4005
Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe1 5 10 15Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser20 25 30Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg35 40 45Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp50 55 60Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser65 70 75 80Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val85 90 95Glu Lys2106211255212DNA213人工序列220
223人工序列稍類似於大腸桿菌CspA220
221CDS222(1)..(252)4006atg gcc ggt aaa atg act ggt atc gta aaa tgg ttc aac gct gac aaa48
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15ggc ttc ggc ttc atc act cct gac gat ggc tct aaa gat gtg ttc gta 96Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tct gct atc cag aac gat ggt tac aaa tct ctg gac gaa ggt144His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45cag aaa gtg tcc ttc acc atc gaa agc ggc gct aaa ggc ccg gca gct192Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60ggt aac gta acc agc ctg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata240Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile65 70 75 80agt aag tcg acc tag255Ser Lys Ser Thr210721184212PRT213人工序列220
223合成的構建體4007Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile65 70 75 80Ser Lys Ser Thr2108211246212DNA213人工序列220
223稍類似於枯草桿菌CspB220
221CDS222(1)..(243)4008atg gta gaa ggt aaa gta aaa tgg ttc aac tct gaa aaa ggt ttc gga48Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc atc gaa gta gaa ggt caa gac gat gta ttc gtt cat ttc tct gct96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30att caa ggc gaa ggc ttc aaa act tta gaa gaa ggc caa gct gtt tct144Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45ttt gaa atc gtt gaa gga aac cgc gga cca caa gct gct aac gtt act192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60
aaa gaa gcg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata agt aag tcg240Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser65 70 75 80acc tag246Thr210921181212PRT213人工序列220
223合成的構建體4009Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser65 70 75 80Thr21010
211877212DNA213大腸桿菌220
221CDS222(528)..(743)300
308L284293091994-05-04313(1)..(877)40010agctttaata tagctcatga aaggtaaaca ttggcagctg aagggccacg cagaccattt 60atccggcaaa attccacgcg taatccggtg gtaatttctt ctgcatcgcg gagattgagc 120gctgaaacat gaagctggac atcgatacga ccatcggatg gggtgataag acccttgccg 180cttttgccgt caaaggtttt gacaattcct gtcattttac gggacaaaaa aattccttaa 240tactgataac ttggcgcact atacacacgt tcctgaagaa agctatagtt ttttgatggg 300gttgaagatg gctggatgtc taaaataaac attgcttcat atgttcaact atgcgttaat 360gattgcgtcg gtttgaagaa cagacgatat acgaagtagt ttactaaagc agttctcatt 420tcaggtgtta ttcacttatt ccttctttga gtctctccaa ttaagtacga agtcgtttct 480gttatgcaaa ccatttatgc cgaaaggctc aagttaagga atgtaga atg tca aat536Met Ser Asn1aaa atg act ggt tta gta aaa tgg ttt aac gct gat aaa ggt ttc ggc584Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly5 10 15ttt att tct cct gtt gat ggt agt aaa gat gtg ttt gtg cat ttt tct632Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser20 25 30 35gcg att cag aat gat aat tat cga acc tta ttt gaa ggt caa aag gtt680
Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly Gln Lys Val40 45 50acc ttc tct ata gag agt ggt gct aaa ggt cct gca gca gca aat gtc728Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val55 60 65atc att act gat taa aattcatcgc tcgtctgtat acgataacga agaaggctga783Ile Ile Thr Asp70tgcctgagta gagatacgga cagagtagtg aatattggat ctctttaata aaaagtaagg 843aggtccaata catgaaacaa tggctagcat attt 8772101121171212PRT213大腸桿菌40011Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Ala Asn Val Ile Ile Thr Asp65 7021012
2111601212DNA213大腸桿菌220
221CDS222(243)..(452)300
308D284963091994-02-05313(1)..(1601)40012gatcgagaca tgtttaaaaa tggcttgcca taattaacgt tgtatgtgat aacagatttc 60gggttaaacg aggtacagtt ctgtttatgt gtggcatttt cagtaaagaa gtcctgagta 120aacacgttga cgttgaatac cgcttctctg ccgagcctta tattggtgcc tcatgcagta 180atgtgtcagt tttatctatg ttatgcctgc gggcgaagaa aacaatctaa ggaatttttc 240aa atg gca aag att aaa ggt cag gtt aag tgg ttc aac gag tct aaa 287Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys1 5 10 15ggt ttt ggc ttc att act ccg gct gat ggc agc aaa gat gtg ttc gta335Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tcc gct atc cag ggt aat ggc ttc aaa act ctg gct gaa ggt383His Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly35 40 45cag aac gtt gag ttc gaa att cag gac ggc cag aaa ggt ccg gca gct431Gln Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60gtt aac gta aca gct atc tga tcgaatccac tgatctgaag tgtgaatacg 482Val Asn Val Thr Ala Ile65cttcaatctc gctataaagc ctcgtcgaat gcgaggcttt ttactatgct ttatcttcgc 542
tcctggcgtt cggatatttg cccgccgcgt gattcgcgtt acacttgcgg cctttagtat 602cctgccggag ttgtcatgtc tttttcctgt ccactttgcc atcagcctct ttcgcgtgaa 662aaaaacagct atatctgtcc ccagcgacat cagtttgata tggcgaaaga agggtatgtc 722aatctgctgc ccgttcagca taaacggtct cgtgatccgg gcgacagcgc ggaaatgatg 782caagcacgcc gcgcattctt agatgccgga cattatcagc cgctgcgtga tgcaattgtc 842gcccaactga gggaacggct tgatgataag gccacggcgg tgctggatat tggctgtggt 902gaagggtatt acacacacgc atttgccgat gcgttgcccg aaatcaccac gtttggtctg 962gatgtttcga aggtagcgat aaaagcggcg gcgaaacgct atccgcaggt cactttttgt 1022gtcgcttcca gccaccgttt gccgttttcc gataccagta tggacgccat aatacgtatt 1082tacgcgccgt gtaaagcaga agaattagca cgagtagtga agcccggcgg ctgggtcatt 1142actgccacgc cgggaccgcg acatttgatg gagctgaagg ggctgattta caatgaagta 1202catcttcatg cacctcatgc agaacaactg gaaggtttta cattacagca gagtgcggag 1262ttgtgttatc cgatgcgtct tcgcggtgat gaagccgtcg cattattgca gatgacgccg 1322tttgcctggc gtgcgaagcc agaagtctgg caaacactgg cagcaaaaga agtgttcgac 1382tgccagacgg actttaatat tcacctctgg cagcgttctt attaaccgtg gaagtgcgtc 1442cagaggatct ggacgccgat gccgatcagc accagcccgc cgagaatttc cgcttttttc 1502ccaataattg agccgataaa gcgaccaacc atcatcccta atgttgacat aatcaaggtt 1562gcacaaccaa tggccaatgc ggtcgcgata atgttgacc 16012101321169212PRT213大腸桿菌40013
Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys Gly1 5 10 15Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His20 25 30Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly Gln35 40 45Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala Val50 55 60Asn Val Thr Ala Ile6521014211351212DNA213大腸桿菌220
221CDS222(74)..(298)300
308P242453091992-03-01313(1)..(351)40014ttttgaacag ccccctctct gaccccggtt tattccatct tacttgtata agatttgcga 60aggatgtcga agc atg gaa aag ggt act gtt aag tgg ttc aac aat gcc 109Met Glu Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asn Ala1 5 10aaa ggg ttt ggt ttc atc tgc cct gaa ggc ggc ggc gaa gat att ttc157
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cctgaacttc tttacgaccg tcggagggga taatgaatcc tttgccgctt ttgcgatcaa240aggttttgac aattcctgtc attttacggg acaaacaaat tccttactga aaatactgcg300ctgcactata cggggttaat aaaataaagc cagcgatatt taagaccgcc ggacggctaa360aataaaattt gcttaatctc aattatcatg cgttaatagc tgcgtcggtt tgaaagacag420acagcataca aagtagttta ctaaagcagt tctcattatc aggcattatc cccttctttt480gagtctctct cctgaacact aagtagtttc tgtattaaag ccctgtttgc cgaaaggccc540aaaatgaagg aagtaaaat atg tct aat aaa atg act ggt tta gta aaa tgg 592Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp1 5 10ttt aac gca gat aaa ggt ttt ggc ttt atc act cct gat gat ggc agc 640Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser15 20 25aaa gac gtt ttc gtc cat ttc acc gcc atc cag agc aat gaa ttc cgc 688Lys Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg30 35 40acg ctg aac gaa aat cag aaa gtt gaa ttt tct att gag cag ggg caa 736Thr Leu Asn Glu Asn Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln45 50 55cgt ggc ccc gcg gca gcg aac gtt gtt acg ctc taa ggttgccatt 782Arg Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Val Thr Leu60 65 70attactcaac atctccattt ccgctgtcca tgttgtcatg gttcacagta ccgcacatcg842gcattcgatg tgacggagcg aaaccctttg gcgctaagtg tattttttgt aaatcgacga902tgatcacctt tgataacgtc gcgctgcaaa tacgcactga ccatgcgcgc tggatttcac962aaataatatc aggctcctcg tggagctttt tt 9942101921170
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75 80atttaaga 3012102921183212PRT213集胞藻屬PCC680340029Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr Gln Ala Thr Glu Asp Asp1 5 10 15Val Leu Thr Val Phe Ser Glu Tyr Gly Thr Val Lys Arg Val Gln Leu20 25 30Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu35 40 45Met Ser Ser Asp Lys Glu Glu Asp Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly50 55 60Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Arg Pro Arg65 70 75 80Thr Pro Arg21030211401212DNA213集胞藻屬PCC6803220
221CDS
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Leu Thr Ala Val Phe Ala Glu Tyr Gly Ser Val Lys Arg Val Gln Leu20 25 30Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu35 40 45Leu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Thr Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly50 55 60Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Lys Pro Arg65 70 75 80Glu Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Gly Gly Arg Lys Ser Tyr85 90 95Gly Gly Ser Arg Tyr10021032211951212DNA213擬南芥220
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85 90 95Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly100 105 110Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Cys Tyr Asn Cys Gly Arg Thr Gly His115 120 125Ile Ala Arg Asp Cys Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Arg Tyr130 135 140Ser Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Asp145 150 155 160Ser Gly Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gly Arg Cys Phe Asn Cys Gly Asp165 170 175Glu Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro Asn Lys180 18521036211516212DNA213陸地棉220
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221misc_feature222(388)..(388)223n＝A，G，T，或C40036cggacgcgtg ggttgggatt ttaaagatgg gtgagaatag g atg acc ggc aag gtg56
Met Thr Gly Lys Val1 5aag tgg ttc gat gac caa aag ggt tat ggc ttc ata tcc cct gac gac104Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe Ile Ser Pro Asp Asp10 15 20ggc ggc gac gat ttg ttt gtt cac cag tct tcc atc cgt tcc gag ggt152Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly25 30 35ttc cgt agc ctt gct gat ggt gaa gag gtc gag tac gtt gtc gag tct200Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu Tyr Val Val Glu Ser40 45 50tct gaa ggt cgc ccc aag gct gtt gag gtc act ggc ccc aac ggc aac248Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr Gly Pro Asn Gly Asn55 60 65cct gtt cgt gga tca tct aga tcc gga cgc ggc ggc ggc ggt ggt ggc296Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly70 75 80 85ggt tat ggc ggt gga tcc ggt gga tat ggt gga ggg gga agg aga ggc344Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly90 95 100ggt tat ggt gga gga att gga ggg gga ttt tag ttgcaaaatg ngcatgctta 397Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe105 110aaaatattat aagttgtaag cgtgcatgct aatgcagagt gtggttgact atgacgtatc 457atactgccat actaattaat attattgagt aaaataaaaa acaatgcttt cttgtttcc 51621037211111212PRT213陸地棉40037Met Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe
1 5 10 15Ile Ser Pro Asp Asp Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser20 25 30Ile Arg Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu35 40 45Tyr Val Val Glu Ser Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr50 55 60Gly Pro Asn Gly Asn Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly85 90 95Gly Gly Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe100 105 11021038211792212DNA213大豆220
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15 20 25gaa ctc ttc gtt cac caa tct cag atc aaa tct gac ggt ttc cga agc148Glu Leu Phe Val His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser30 35 40cta gct gaa gga gag tcc gtt gag ttc gct att gaa tct gaa tct gac196Leu Ala Glu Gly Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp45 50 55 60gga cgc gcc aag gct gtt gat gtc act ggc ccc gac ggc gcc agc gtc244Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val65 70 75cag gga acc aga cgc ggc ggt gat ggt ggc cga agc tat ggc ggg gga292Gln Gly Thr Arg Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly80 85 90cga gga ggt ggc tac ggt ggt ggt ggg cga ggc ggt ggt ggc ggg gct340Arg Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala95 100 105tgc tac aac tgc ggt gaa tcg gga cat ctg gct agg gac tgc agc caa388Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln110 115 120gga ggc ggt gga gac agg tac ggc gga ggc ggt ggt ggt ggt ggc agg436Gly Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg125 130 135 140tat gga ggc ggc ggt ggc ggc agg tac ggt ggt ggt gga gga ggt ggt484Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly145 150 155ggc ggc gga gga agc tgc tac agc tgt gga gag tct ggg cat ttc gcc532Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala160 165 170aga gat tgc cca tca agt gct cgt tgaaattact gttatggtgg tttatgttat 586Arg Asp Cys Pro Ser Ser Ala Arg175 180gcggattgtt ttaagttttt actttaacat gttgtaggga ttttaatggt ttctgtcaaa 646
gctgtggctt cttataagta gatgcgtgag atttttcttt tttttggtta tttaaatgaa 706agtttctgtg ttatcgttac aatctgcaaa caaaatctgt ttggacctac attttgctat 766aatgaattgg atgattgtta tcggtt 79221039211180212PRT213大豆40039Met Ser Gly Arg Val Ser Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asp Gln Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Glu Glu Leu Phe Val20 25 30His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser Leu Ala Glu Gly35 40 45Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp Gly Arg Ala Lys50 55 60Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val Gln Gly Thr Arg65 70 75 80Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly85 90 95Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Tyr Asn Cys100 105 110Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln Gly Gly Gly Gly115 120 125
Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly130 135 140Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly145 150 155 160Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro165 170 175Ser Ser Ala Arg180210402111245212DNA213玉米220
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Arg Ser Leu Ala Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly45 50 55 60gac gac ggc cgc act aag gcc gtc gac gtg acc ggc ccc gac gga tcc302Asp Asp Gly Arg Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser65 70 75ttc gtc agg ggc ggc gga ggc gga gga gga ggc ggc ggc ggc tac ggc350Phe Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly80 85 90tcc cgc ggc ggt ggc gga tct ggc ggc ggc ggt cgc agc tac ggt ggt398Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly95 100 105agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc ggc ggc ggg ggc ggt ccc ggc gcg446Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala110 115 120tgc tac aag tgc ggc gag ccc ggc cac atg gca agg gac tgc cct agc494Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser125 130 135 140gcc gac ggc gga ggc ggc tac ggc gga ggc ggc tac gga gga gga ggc542Ala Asp Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly145 150 155ggc ggc ggc ggt ggc tgc ttc aag tgt ggc gag cct ggc cac atg gcc590Gly Gly Gly Gly Gly Cys Phe Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala160 165 170agg gac tgc tcc agc ggc ggc ggc ggc tac ggc ggt ggc ggc ggc ggc638Arg Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly175 180 185ggt gga ggc ggc tgc tac aac tgc ggc cag gcc ggc cac atg gcc agg686Gly Gly Gly Gly Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ala Gly His Met Ala Arg190 195 200gac tgc ccc agc ggt ggc ggc ggt ggc gga ggg agg ttc ggc ggc ggc734Asp Cys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Gly Gly Gly205 210 215 220ggc ggg ggt ggc ggc gac cgc tcc tgc tac aac tgc ggc gag gcc ggc782
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Arg Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ala Gly225 230 235cac atc gcc cgc gac tgc ccc acg tgaggtgtgt ccgcgtccgt ccgtccagcc836His Ile Ala Arg Asp Cys Pro Thr240agatcagatc ggatcgctcc accacctgct ggtctgatgg cgccgccccc ttctagatct 896cgcttaaaaa aacacccccc tctcgctgtg tgtcggagta ccgctttagt tttgccgatc 956cgggcacgag tgcccgctgc ctctttcctc tcatgcgtaa gaggaacccg tccgccgttt 1016tcagatttcg ttcggtccgt agaagaactc tcaagttaag ttaagttatc atggtgtgtg 1076cttggtcgtt gttcgtcgtc gtcgttaagg ttttaagaga tgatttggtc ctgtgttgcc 1136gaggggaagt cgaatctgct tttttctttt tttgtggttt gttccaccag actgaggaag 1196gagatgagat gattattctc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 124521041211244212PRT213玉米40041Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp1 5 10 15Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu20 25 30Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala35 40 45Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg50 55 60
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Asp Cys Pro Thr210422111409212DNA213玉米220
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agc tac ggt ggt agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc gcg ccc gac gcc389Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala110 115 120gct ttc ggc tcc gtc ctc tcc ggc acc gcc ggc gac gcc gcc ccc agc437Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser125 130 135gac cag tgg ttc gtc gac gcg ctc aac gcc ccc gcg ccg cac ccc atc485Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile140 145 150gag cgc gtc cga tcc gag tcc tcc tcg atc gtc tcc gac gtc ccc gac533Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp155 160 165tac ctc ttc agc ctc gac agc ccg tcc gac gac ccc agc ccc ggc ccc581Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro170 175 180 185tcg gcg gct cgc gcc aag tcc gac ccc gcg gag act ccg cac cac cac629Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His190 195 200ggc gac gac gtg ccg cct tcc gct cga cag ata ccg cac gtc gca gga677Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly205 210 215gga gcg tca tcg tgg ccc gcc ccg ccg ccg ccg tac atg gcg cag cct725Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Met Ala Gln Pro220 225 230atg tac tac ttc ccc gtg ccg cca ccg gtc cac tac ctc gac cag tct773Met Tyr Tyr Phe Pro Val Pro Pro Pro Val His Tyr Leu Asp Gln Ser235 240 245gcg cag agt ggc tac atg cct cgc ccg atc tac cac att gtc ggt ggc821Ala Gln Ser Gly Tyr Met Pro Arg Pro Ile Tyr His Ile Val Gly Gly250 255 260 265gga gga agc gag gcg cct ggc gga gat ctt cac gcg gcc ggc gga gtc869Gly Gly Ser Glu Ala Pro Gly Gly Asp Leu His Ala Ala Gly Gly Val270 275 280
tac ggc gtc tcg cac cac atg cag ggg ttc ccg ccg atg atg tac gcg 917Tyr Gly Val Ser His His Met Gln Gly Phe Pro Pro Met Met Tyr Ala285 290 295ccg ccg cgc gcg gtc atc tac aac tac aag tcg gag ggg atg cca tcg 965Pro Pro Arg Ala Val Ile Tyr Asn Tyr Lys Ser Glu Gly Met Pro Ser300 305 310ctg cct ccg gaa ggt ggg gca cac tct tcc taggtgcatc ggctacttca 1015Leu Pro Pro Glu Gly Gly Ala His Ser Ser315 320catctctgaa tcctgattat tgttgcagat gcctaagcta aggagttttg cgtggtaatt 1075tttttatcga ttcgtctaga gtcttgttcg ttgttttgta tagatggagg ggttgatggt 1135gatggataga tattaatgca gttttcgtct agtggaaata tattcgtgaa atgtatatca 1195tactaaatag tatagtattt ggtgtgatta attaatattc tagttaatgt aatgtgggat 1255tcatataatc taggtggttc tggtcttata gaaaccattt ttgggcattt tatatttaca 1315taaactggat gttgggtgaa tgttctaagc agtatgtgct gtgttgaacc tcaatcactt 1375atgagtggtt actaaatttg aatttgatgt cttc 140921043211323212PRT213玉米40043Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp1 5 10 15Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu20 25 30Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala35 40 45
Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg50 55 60Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly65 70 75 80Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly85 90 95Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly100 105 110Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser115 120 125Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala130 135 140Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser145 150 155 160Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser165 170 175Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser180 185 190Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser195 200 205Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala210 215 220
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Phe Ile Ala Pro Asn Asp Gly Ser Ala Asp Leu Phe Val His Tyr Ser20 25 30Glu Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Gln Pro Val35 40 45Glu Phe Glu Val Gly Glu Gly Ala Lys Gly Pro Gln Ala Gln Gln Val50 55 60Arg Ala Leu6521052211384212DNA213穀氨酸棒桿菌220
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ctt gaa act cca cgc agg cgt cca cag cac aaa tac aag cca gaa gag240Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu65 70 75 80ctc aac gga atg atc tct gac ctc atc acg ctt cta gaa agt gga gtg288Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val85 90 95caa cca ggc ctt gcc aaa ggg caa tac ccg gag cac aaa gct gga gcg336Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala100 105 110cag gta gca gaa att ctt cgc gtt gtt gcg aag gag ctt gag tct taa384Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser115 120 12521053211127212PRT213穀氨酸棒桿菌40053Met Pro Val Gly Thr Val Lys Trp Tyr Asp Ala Glu Arg Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Val Ser Asn Pro Gly Gly Glu Asp Cys Phe Val Gly Lys Gln Val20 25 30Leu Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu His Lys Gly Gln Arg Ile Asp Phe35 40 45Asp Phe Ala Ala Gly Arg Lys Gly Pro Gln Ala Leu Arg Ile Lys Ile50 55 60Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu65 70 75 80
Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val85 90 95Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala100 105 110Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser115 120 12521054211249212DNA213人工序列220
223人工序列，稍類似於大腸桿菌CspA40054atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc 60atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga gcgattacaa ggatgatgat240gataagtaa2492105521182212PRT213人工序列220
223大腸桿菌CspA-樣40055Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp65 70 75 80Asp Lys21056211225212DNA213人工序列220
223大腸桿菌CspA-樣40056atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc60atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat 120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa 180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga cctag 2252105721174212PRT213人工序列
220
223大腸桿菌CspA-樣蛋白40057Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Thr65 7021058211240212DNA213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40058atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctg aaa g gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaa ct120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg agcgattaca aggatgatga tgataagtaa240
2105921179212PRT213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40059Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys65 70 7521060211216212DNA213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40060atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180
gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg acctag 2162106121171212PRT213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40061Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala Asn Ser Ser Thr65 7021062211213212DNA213人工序列220
223大腸桿菌CspA-樣40062atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc60
atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat120ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa180ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg tga 2132106321170212PRT213CspA-樣蛋白40063Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 7021064211204212DNA213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40064
atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact120ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct180gctaacgtta ctaaagaagc gtga 2042106521167212PRT213人工序列220
223枯草桿菌CspB-樣40065Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala652106621123212DNA213人工序列
220
223用於PCR的引物40066aggtaataca ccatggccgg taa232106721124212DNA213人工序列220
223用於PCR的引物40067ttaagcagag aattcaggct ggtt24210682117212PRT213人工序列220
223Flag tag for epi tope tagging40068Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys1 52106921123212DNA213人工序列220
223PCR引物40069aggaggaaat tccatggtag aag 23
2107021126212DNA213人工序列220
223PCR引物40070tcaatttatg aattcgcttc tttagt 262107121127212DNA213人工序列220
223PCR引物220
221misc_feature222(27)..(27)223n＝a，c，t，或g40071gggcactttg tacaagaaag ctgggtn272107221128212DNA213人工序列220
223PCR引物220
221misc_feature222(28)..(28)223n＝a，c，t，或g
40072ggggcacttt gtacaagaaa gctgggtn 282107321114212DNA213人工序列220
223PCR引物40073cctgcaggac catg 142107421117212DNA213人工序列220
223PCR引物40074cctgcaggct cgagcta 172107521143212DNA213人工序列220
223PCR引物40075ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 432107621147212DNA
213人工序列220
223PCR引物40076ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cctgcaggct cgagcta 472107721118212DNA213人工序列220
223PCR引物40077ccccaccctg caatgtga 182107821131212DNA213人工序列220
223PCR引物40078tgtgcatcct tttatttcat acattaatta a312107921130212DNA213人工序列220
223PCR引物40079cctagacttg tccatcttct ggattggcca 30
2108021116212DNA213人工序列220
223PCR引物40080gcctgccgca gaccaa 162108121120212DNA213人工序列220
223PCR引物40081atgcagagct cagcttcatc 202108221124212DNA213人工序列220
223PCR引物40082tccagtacgt gcagtccctc ctcc 242108321124212DNA213人工序列220
223PCR引物
40083cgtctacaat cagaaggcgt aatc242108421123212DNA213人工序列220
223PCR引物40084ccaacaggtg aatgcttgat agg 232108521118212DNA213人工序列220
223PCR引物40085catgcgccgc tttgcttc 182108621152212DNA213人工序列220
223PCR引物40086gcgcaggcct agatgtacca tgtccggtaa aatgactggt atcgtaaaat gg 522108721146212DNA
213人工序列220
223PCR引物40087cgcgaattcg gatccttatt acaggctggt tacgttacca gctgcc462108821153212DNA213人工序列220
223PCR引物40088gcgcaggcct agatgtacca tgttagaagg taaagtaaaa tggttcaact ctg532108921151212DNA213人工序列220
223PCR引物40089cgcgaattcg gatccttatt acgcttcttt agtaacgtta gcagcttgtg g 5121090211204212DNA213人工序列220
223對於植物表達的合成密碼子優化的CspB220
221CDS
222(1)..(204)40090atg gtg gag ggc aag gtg aag tgg ttc aac tcc gag aag ggc ttc ggc 48Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15ttc atc gag gtg gag ggt caa gac gat gtg ttc gtc cac ttc tcc gcc 96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30atc cag ggc gaa ggg ttc aag acc ctg gaa gag ggg cag gcc gtc tcc144Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45ttc gag atc gtc gag gga aac cgc ggt ccg cag gcc gcg aac gtc acg192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60aag gaa gcg tga204Lys Glu Ala652109121167212PRT213人工序列220
223合成的構建體40091Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Glu Ala6521092211213212DNA213人工序列220
223編碼CspA的合成密碼子220
221CDS222(1)..(213)40092atg gcc ggc aag atg acc ggc atc gtg aag tgg ttc aac gct gac aag 48Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15ggc ttc ggc ttc atc acg ccg gac gac ggc agc aag gat gtc ttc gtg 96Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30cac ttc tcc gcc atc cag aac gac ggc tac aag tcc ctc gac gag ggc144His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45cag aag gtc agc ttc acc atc gag agc ggc gcc aaa ggc ccg gcc gcc192Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60ggt aac gtc acg tcg ctg tga213Gly Asn Val Thr Ser Leu65 70
2109321170212PRT213人工序列220
223合成的構建體40093Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys1 5 10 15Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val20 25 30His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly35 40 45Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala50 55 60Gly Asn Val Thr Ser Leu65 7021094211201212DNA213蘇雲金芽孢桿菌220
221CDS222(1)..(201)40094atg caa aca ggt aaa gtt aaa tgg ttc aac agc gaa aaa ggt ttc ggt 48Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15ttc atc gaa gtt gaa ggt gga gac gat gta ttc gtt cac ttc tca gct 96Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30atc caa ggt gac gga ttc aaa act tta gaa gaa ggt caa gaa gtt tct144Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45ttc gaa atc gtt gaa ggt aac cgt gga cca caa gct gct aac gtt aca192Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60aaa aac taa201Lys Asn652109521166212PRT213蘇雲金芽孢桿菌40095Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly1 5 10 15Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala20 25 30Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser35 40 45Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr50 55 60Lys Asn6權利要求
1.一種重組DNA分子，其在5』到3』方向包含a)包含在植物中起作用的啟動子的第一DNA多核苷酸，其可操縱地連接到；b)編碼冷休克蛋白的第二DNA多核苷酸，可操縱地連接到；c)起多腺苷酸化序列作用的3』轉錄終止DNA多核苷酸。
2.一種權利要求1的重組DNA分子，其中在所述第一DNA多核苷酸和所述第二DNA多核苷酸之間插入植物DNA內含子。
3.一種權利要求1的重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼包含SEQ ID NO3的胺基酸基序的蛋白。
4.一種權利要求3的重組DNA分子，其中所述第二DNA多核苷酸編碼選自下列的蛋白(a)具有基本上同一於來自革蘭氏陽性細菌冷休克蛋白的胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白，(b)來自枯草桿菌的冷休克蛋白，(c)枯草桿菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，(d)具有基本上同一於SEQ ID NO2的胺基酸序列的蛋白，(e)具有基本上同一於來自革蘭氏陰性細菌冷休克蛋白的胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白，(f)包含來自大腸桿菌冷休克蛋白的蛋白，(g)大腸桿菌冷休克蛋白A(CspA)的同系物，(h)具有基本上同一於SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白，(i)來自根癌農桿菌的冷休克蛋白，和(j)具有基本上同一於SEQ ID NO5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63或65中任一的胺基酸序列的蛋白。
5.一種根據權利要求1的重組DNA分子，其中啟動子選自誘導型啟動子、組成型啟動子、時序調節型啟動子、發育調節型啟動子、組織優選型啟動子、低溫增強型啟動子、低溫特異性啟動子、脅迫增強型啟動子、脅迫特異性啟動子、乾旱誘導型啟動子、缺水誘導型啟動子和組織特異性啟動子。
6.一種已用表達冷休克蛋白的DNA分子轉化的耐非生物脅迫的轉基因植物。
7.一種權利要求6的植物的繁殖體。
8.權利要求6的植物的後代。
9.一種權利要求6的植物，其是一種作物。
10.一種權利要求6的植物，其是一種單子葉植物。
11.一種權利要求6的植物，其是一種雙子葉植物。
12.一種權利要求6的植物，其選自大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麥、燕麥、草坪草、棉花和小麥。
13.一種權利要求6的植物，其具有(a)在將限制相同種未轉化植物生長的低溫條件下更高的生長率，(b)在將限制相同種未轉化植物生長的高溫條件下更高的生長率，(c)在將限制相同種未轉化植物生長的水分條件下更高的生長率，(d)在將限制相同種未轉化植物生長的土壤和/或水中增加的鹽類或離子條件下更高的生長率，(e)在冷休克後較相同種未轉化植物更大百分率的植物存活率，(f)當與相同種未轉化植物相比時增加的產量，或(g)與相同種未轉化植物相比對乾旱的抗性。
14.一種權利要求13的植物的繁殖體，其是種子。
15.一種方法，其中將權利要求14的種子種植在土壤中並使之生長。
16.一種產生轉基因植物的方法，所述方法包括下列步驟a)將權利要求1的重組DNA分子插入到植物細胞的基因組中；b)獲得含有所述重組DNA的轉化植物細胞；c)從所述的植物細胞再生植物；和d)選擇增強的非生物脅迫耐受性或增加的根生長的植物。
17.一種通過權利要求16的方法生產的脅迫耐受植物。
18.一種權利要求16的方法，其中所述非生物脅迫選自耐熱性、耐鹽性、耐旱性和冷休克後存活。
19.一種分離的蛋白，其(a)是至少40％同一於選自SEQ ID NOS5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65的至少一種蛋白，(b)在嚴謹條件下與選自SEQ ID NOs4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，90和92的核酸雜交，(c)具有基本上同一於SEQ ID NOS5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65中任一的胺基酸序列。
20.一種農作物，其包含至少50％的從包含原核冷休克蛋白的繁殖體發育的植物。
全文摘要
通過在植物中導入表達冷休克蛋白例如細菌冷休克蛋白的DNA提供了植物中增強的非生物脅迫耐受性。
文檔編號C07K14/195GK1886514SQ200480035385
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者M·費爾南德斯 申請人:孟山都技術有限公司