氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法
2024-02-05 00:37:15
專利名稱：氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，具體的說，是涉及動物源性食品和水產品中的氯黴素殘留的高選擇性分離、純化、富集的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法。
背景技術：
氯黴素(chloramphenicol，簡稱CAP)是1947年首次從委內瑞拉鏈絲菌(Streptomyces Venezuela)的培養液中分離得到的廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制作用。然而，由於其苯環上帶硝基，其分解半衰期較長而且具有嚴重的毒副作用，對於氯黴素殘留，存在多種檢測方法，目前，發達國家對其檢出限的要求越來越嚴格，歐盟由原來的10μg/kg降至0.1μg/kg，美國FDA規定的檢出限也由原來的5μg/kg降為0.3μg/kg，且目前更為靈敏的方法，可使檢出限達0.1μg/kg。因此，動物源性食品和水產品中的氯黴素殘留已成為我國擴大農產品國際貿易的主要障礙。
目前，在氯黴素殘留的檢測中，樣品的前處理過程是非常重要的，固相萃取技術是一種比液液萃取更好、更快速、更簡便的分離技術，但是傳統的固相萃取其目標物與吸附劑之間的作用力是非特異性的，限制了固相萃取技術的進一步發展，因此，新型高選擇性識別能力填料基質的開發研製是非常重要的。而分子印跡聚合物具有與模板分子相匹配的結合位點與空穴，對模板分子具有專一的識別能力，同時具有抗惡劣環境能力、高穩定性和長的使用壽命等優點。
經對現有技術的文獻檢索發現，Mena等在《Anal Bioanal Chem》(生物分析化學)2003，376，18-25上發表的「Molecularly imprinted polymers foron-line clean-up and preconcentration of chloramphenicol prior to itsvoltammetric determination」(利用氯黴素分子印跡聚合物進行伏安法檢測前的在線淨化和前富集)中提出應用分子印記聚合物萃取小柱與伏安法相結合，可使氯黴素殘留的富集因子達到500；具體採用本體聚合法製備的分子印跡聚合物裝配萃取小柱，經上樣、洗脫等步驟後，通過伏安法進行分析。其不足之處在於存在分子印跡聚合物顆粒大小不均一、顆粒形狀不規則等缺點，對痕量氯黴素的富集效果較差。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，使其能夠簡單、快速、高效測定動物源性食品和水產品中氯黴素(CAP)殘留量的選擇性純化和富集，可直接用於對氯黴素的特異選擇性分離、高效富集。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備，包括以下步驟(1)將模板分子氯黴素、功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，按模板分子∶功能單體∶交聯劑摩爾比＝1∶2～8∶25，通過懸浮聚合而成氯黴素分子印跡聚合物微球；(2)稱量氯黴素分子印跡聚合物微球0.050～0.200g，填充於1ml-6ml聚丙烯固相萃取小柱內。填料的頂端和底端分別裝上20μm孔徑的聚乙烯篩板；採用甲醇∶異丙醇＝2∶1(v/v)作為裝柱勻漿液體，抽真空狀態下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，最後蓋緊篩板。
所述的氯黴素分子印跡聚合物微球，其製備步驟如下1)將模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為1∶2～8∶25；稀釋劑和交聯劑的總體積與水的體積比為1∶6～14；將聚乙烯醇1788至於水中，80℃攪拌30min至其全部溶解；聚乙烯醇1788(PVA1788)的濃度為3～6％；將功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和模板分子氯黴素溶解在稀釋劑中，超聲作用5～10min ；將交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、引發劑(AIBN)和稀釋劑混合，超聲作用5～10min；將上述三種溶液混合，在60～75℃恆溫350～450rpm恆速攪拌20～24h；2)反應結束後，將上述反應製備的分子印跡聚合物微球在80℃水中攪拌60min，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水洗滌3次，再用甲醇洗滌3次，丙酮洗滌2次，每次15min，最後通過索氏萃取進一步除去模板分子；3)將除去模板分子的聚合物真空乾燥(50℃)，得到氯黴素分子印跡聚合物微球(平均孔徑約為40～120μm)。
所述的稀釋劑，為辛醇∶氯仿體積比＝5∶1的混合溶劑；所述的引發劑，為偶氮二異丁腈。
本發明上述方法製備的氯黴素分子印跡固相萃取小柱，應用於檢測食品中氯黴素殘留量的樣品溶液的選擇性純化、富集，具體步驟如下(1)固相萃取小柱裝填好後，首先用10ml丙酮、10ml甲醇衝洗；(2)加入樣品溶液1ml；(3)用1ml 40％甲醇淋洗3次；(4)用0.5～1.5ml甲醇洗脫1次。
本發明製得的氯黴素分子印跡聚合物微球是一種具有固定孔穴大小、形狀和有確定排列功能基團的高分子交聯聚合物，對氯黴素分子的立體結構具有動態「記憶」功能。本發明採用其製備的氯黴素分子印跡固相萃取小柱，可應用於測定動物源性食品和水產品中氯黴素殘留量的樣品溶液的選擇性純化、富集，較普通的液-液萃取法、C18固相萃取法更為簡單、快速、效率更高。
具體實施例方式
結合本發明的內容提供以下實施例實施例1.
(一)氯黴素分子印跡聚合物微球的製備(1)、模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為1∶2；稀釋劑和交聯劑的總體積與水的體積比為1∶6；聚乙烯醇1788(PVA1788)的濃度為3％；將0.8ml功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯黴素溶解在稀釋劑中，超聲作用5min；將5ml交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引發劑(AIBN)和15ml稀釋劑(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超聲作用5～10min；將上述三種溶液混合，在60℃恆溫350rpm恆速攪拌20h；(2)、將上述反應製備的分子印跡聚合物微球在80℃水中攪拌60min，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水洗滌3次，再用20ml甲醇洗滌3次，20ml丙酮洗滌2次，每次15min，最後通過索氏萃取進一步除去模板分子；(3)、將除去模板分子的聚合物，真空乾燥(50℃)，得到氯黴素分子印跡聚合物微球(80～100μm)。
(二)氯黴素固相萃取小柱的製備首先用5ml甲醇衝洗柱內壁，然後稱取0.050g的MIPs(甲醇∶異丙醇＝2∶1v/v)裝柱(1ml固相萃取小柱)，裝填高度約為1cm，填料的頂端和底端分別裝有20μm孔徑的聚乙烯篩板；採用甲醇∶異丙醇＝2∶1(v/v)作為裝柱勻漿液體，抽真空狀態下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，然後蓋緊篩板。
(三)氯黴素分子印跡固相萃取小柱應用於檢測食品中氯黴素殘留量的樣品溶液的選擇性純化、富集，具體步驟如下固相萃取小柱裝填好後，首先用10ml丙酮、10ml甲醇衝洗；然後加入樣品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脫1次。
(四)固相萃取小柱性能分析評價(1)、用3ml甲醇潤洗柱子，並保持2min，然後用3ml磷酸緩衝液上樣溶液(每次1ml)潤洗柱子，除去殘留的液體，保持溼潤，上樣前勿讓填料流幹；(2)、上樣，取1ml上樣溶液；上樣溶液有氯黴素標準品及其類似物(土黴素、鏈黴素以及四環素)；其中氯黴素標準溶液配製0.016g氯黴素溶於5.0mL甲醇中配製一系列濃度梯度(0.01，0.05，0.5，2.5，5，25μg/ml)的氯黴素標準溶液，採用磷酸緩衝液稀釋；流速為0.20ml/min，真空泵抽真空以除去柱中殘留的液體(＜1min)。收集流出液體，0.22μm濾膜過濾後上樣；(3)、淋洗，3×1ml淋洗液(40％甲醇)淋洗，流速＜1min/ml；(4)、洗脫，首先加入0.25ml甲醇靜止2min，然後加入0.25ml甲醇抽真空洗脫，收集洗脫液體，加入1.5ml磷酸緩衝液，0.22μm濾膜過濾後上樣，HPLC分析。
以上試劑均為分析純，購自美國sigma公司；其他試劑甲醇、丙酮(分析純，購自中國國藥集團)其發明效果為，該固相萃取小柱對氯黴素具有專一選擇性，對氯黴素標準樣品的回收率為85.6％，對其它類似物無特異性吸附。
實施例2.
(一)氯黴素分子印跡聚合物微球的製備(1)、將模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為1∶4；稀釋劑和交聯劑的總體積與水的體積比為1∶8；聚乙烯醇1788(PVA1788)的濃度為4％；將0.8ml功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯黴素溶解在稀釋劑中，超聲作用5～10min；將5ml交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引發劑(AIBN)和15ml稀釋劑(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超聲作用5～10min；將上述三種溶液混合，在65℃恆溫400rpm恆速攪拌22h；(2)、將上述反應製備的分子印跡聚合物微球在80℃水中攪拌60min，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水洗滌3次，再用20ml甲醇洗滌3次，20ml丙酮洗滌2次，每次15min，最後通過索氏萃取進一步除去模板分子；(3)、將除去模板分子的聚合物，真空乾燥(50℃)，得到氯黴素分子印跡聚合物微球(80～100μm)；(二)氯黴素固相萃取小柱的製備首先用5ml甲醇衝洗柱內壁，然後稱取0.200g的MIPs(甲醇∶異丙醇＝2∶1v/v)裝柱(6ml固相萃取小柱)，裝填高度約為1cm，填料的頂端和底端分別裝有20μm孔徑的聚乙烯篩板；採用甲醇∶異丙醇＝2∶1(v/v)作為裝柱勻漿液體，抽真空狀態下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，然後蓋緊篩板。
(三)氯黴素分子印跡固相萃取小柱應用於檢測食品中氯黴素殘留量的樣品溶液的選擇性純化、富集，具體步驟如下固相萃取小柱裝填好後，首先用10ml丙酮、10ml甲醇衝洗；然後加入樣品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脫1次。
其發明效果，該固相萃取小柱對氯黴素具有專一選擇性，對氯黴素標準樣品的回收率為82.6％，對其它類似物無特異性吸附。
實施例3(一)氯黴素分子印跡聚合物微球的製備(1)、將模板分子、功能單體和交聯劑的摩爾比為8∶25；稀釋劑和交聯劑的總體積與水的體積比為114；聚乙烯醇1788(PVA1788)的濃度為6％；將0.8ml功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯(DAM)和1mmol模板分子氯黴素溶解在稀釋劑中，超聲作用10min；將5ml交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、120mg引發劑(AIBN)和15ml稀釋劑(辛醇10ml、氯仿5ml)混合，超聲作用10min；將上述三種溶液混合，在75℃恆溫450rpm恆速攪拌24h；(2)、將上述反應製備的分子印跡聚合物微球在80℃水中攪拌60min，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水洗滌3次，再用20ml甲醇洗滌3次，20ml丙酮洗滌2次，每次15min，最後通過索氏萃取進一步除去模板分子；(3)、將除去模板分子的聚合物，真空乾燥(50℃)，得到氯黴素分子印跡聚合物微球(60～80μm)；(二)氯黴素固相萃取小柱的製備首先用5ml甲醇衝洗柱內壁，然後稱取0.300g的MIPs(甲醇∶異丙醇＝2∶1v/v)裝柱(6ml固相萃取小柱)，裝填高度約為1cm，填料的頂端和底端分別裝有20μm孔徑的聚乙烯篩板；採用甲醇∶異丙醇＝2∶1(v/v)作為裝柱勻漿液體，抽真空狀態下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，然後蓋緊篩板。
(三)氯黴素分子印跡固相萃取小柱應用於檢測食品中氯黴素殘留量的樣品溶液的選擇性純化、富集，具體步驟如下固相萃取小柱裝填好後，首先用10ml丙酮、10ml甲醇衝洗；然後加入樣品溶液1ml；用1ml 40％甲醇淋洗3次；用0.5～1.5ml甲醇洗脫1次。
其發明效果，該固相萃取小柱對氯黴素具有專一選擇性，對氯黴素標準樣品的回收率為85.6％，對其它類似物無特異性吸附。
權利要求
1.一種氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將模板分子氯黴素、功能單體甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯和交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子∶功能單體∶交聯劑摩爾比＝1∶2～8∶25，通過懸浮聚合而成氯黴素分子印跡聚合物微球；(2)稱量氯黴素分子印跡聚合物微球，填充於聚丙烯固相萃取小柱內，填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板；採用甲醇∶異丙醇體積比＝2∶1作為裝柱勻漿液體，抽真空狀態下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，最後蓋緊篩板。
2.根據權利要求1所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，稱量氯黴素分子印跡聚合物微球0.050～0.200g，填充於1ml-6ml聚丙烯固相萃取小柱內。
3.根據權利要求1所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，所述的聚乙烯篩板，其孔徑為20μm。
4.根據權利要求1所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，所述的氯黴素分子印跡聚合物微球，其製備步驟如下1)模板分子、功能單體和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩爾比為1∶2～8∶25；稀釋劑和乙二醇二甲基丙烯酸酯的總體積與水的體積比為1∶6～14；將聚乙烯醇1788至於水中，攪拌至其全部溶解；將功能單體和模板分子溶解在稀釋劑中，超聲作用；將乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發劑和稀釋劑混合，超聲作用；將上述三種溶液混合，恆溫恆速攪拌；2)反應結束後，將上述反應製備的分子印跡聚合物微球在水中攪拌，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水、甲醇、丙酮依次洗滌，最後通過索氏萃取進一步除去模板分子；3)將除去模板分子的聚合物真空乾燥，得到氯黴素分子印跡聚合物微球。
5.根據權利要求4所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，步驟中，所述的稀釋劑，為辛醇∶氯仿體積比＝5∶1的混合溶劑；所述的引發劑，為偶氮二異丁腈。
6.根據權利要求4所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，步步驟1)中，聚乙烯醇1788的濃度為3～6％，80℃攪拌30min至其在水中全部溶解。
7.根據權利要求4所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，步驟1)中，超聲作用時間均為5～10min；恆溫恆速攪拌是指在60～70℃恆溫350～400rpm恆速攪拌20～24h。
8.根據權利要求4所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，步驟2)中，分子印跡聚合物微球在80℃水中攪拌60min，然後降溫過濾，過濾後用雙蒸水洗滌3次，再用甲醇洗滌3次，丙酮洗滌2次，每次15min。
9.根據權利要求4所述的氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，其特徵是，步驟3)中，真空乾燥溫度為50℃，得到平均孔徑為40～120μm氯黴素分子印跡聚合物微球。
全文摘要
一種氯黴素分子印跡固相萃取小柱的製備方法，屬於生物工程技術領域。本發明將模板分子氯黴素、功能單體甲基丙烯酸N，N－二乙基氨基乙酯和交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子功能單體交聯劑摩爾比＝1∶2～8∶25，通過懸浮聚合而成氯黴素分子印跡聚合物微球；再稱量氯黴素分子印跡聚合物微球，填充於聚丙烯固相萃取小柱內，製得氯黴素分子印跡固相萃取小柱。本發明製得的氯黴素分子印跡固相萃取小柱用於檢測食品中氯黴素殘留的樣品溶液的選擇性純化、富集。本發明較普通液－液萃取法、C18固相萃取法具有更為簡單、快速，淨化效率更高等特點。
文檔編號B01J20/281GK1811409SQ20061002390
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月16日 優先權日2006年2月16日
發明者張大兵, 武愛波, 史西志, 李榮秀 申請人:上海交通大學