一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法
2024-01-28 09:32:15
專利名稱：一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法
技術領域：
本發明涉及應用基因工程手段對人酸性成纖維細胞生長因子進行N末端改造。
背景技術：
創傷修復是一個基本的醫學問題，數千年來，無數的醫學專家為尋找快捷、完美、簡便的方法作出了不懈的努力，然而直到80年代末，傳統的創傷修複方法仍然停留在清創術、縫合術等被動等待機件修復的治療措施上。
90年代以來，隨著分子生物學，基因工程克隆技術的飛速發展，對創傷修復的研究也出現了根本的突破。研究提示，機體受損傷時，損傷部位周圍的組織或細胞會以自分泌或旁分泌的方式釋放出多種能夠促進癒合的內源性細胞因子，如aFGF、bFGF、EGF、PDGF等，這些細胞因子在體內儘管含量甚微，但對創傷修復則起著舉足輕重的作用。
酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)是具有多種生物效應的多肽調節因子，也是人體內分布最為廣泛的生長因子之一，其廣泛存在於中框及外周神經系統組織中，含量較其他組織都多，主要對中胚層和神經外胚層來源的多種細胞有營養和促分裂分化作用，是新一代治療創面癒合和難治性潰瘍等疾病突破性產品，臨床療效十分顯著。
酸性成纖維生長因子具有廣泛的靶細胞，包括成纖維細胞、上皮細胞、神經原細胞等。由於人酸性成纖維生長因子的自然來源十分有限；應用基因工程手段進行基因克隆、重組表達和商效的純化，是目前眾多細胞因子在基礎研究和臨床應用上的重要手段。
人酸性成纖維生長因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)是具有多種生物功能的蛋白。天然成熟人酸性成纖維生長因子由140個胺基酸組成，分子量為16KD。
發明內容
本發明應用基因工程重組手段對人人酸性成纖維生長因子進行N末端改造的方法在其N末端加上Met和一個非極性胺基酸，比如Ala或Val。
具體實施例方式
實例說明I一.重組人酸性成纖維生長因子衍生物表達系統的構建和測序選用大腸桿菌表達質粒pTrc99A(Pharmacia)作為構建的載體，此載體含有人酸性成纖維生長因子的cDNA序列，以及增加的Met和Ala的編碼鹼基。
其中人酸性成纖維細胞生長因子cDNA序列用RT-PCR獲得，經過DNA的酶切操作裝載在大腸桿菌表達質粒pTrc99A的NcoI和BamHI位點。經ABI全自動基因測序後得到插入的人酸性成纖維生長因子的基因序列以及相對應的胺基酸序列，結果分析與設計的完全一致。
二.重組A+2人酸性成纖維生長因子衍生物的重組表達和製備A+2人酸性成纖維生長因子基因的pTrc99A轉化大腸桿菌JM109，在含100ug/ml氨苄青黴素的LB培養基中搖瓶過夜(37~C，200rpm)，再按1∶30接種含有100蝗gJml氨苄青黴素的LB培養基中，37~C培養3小時後，加入0.5mM IPTG誘導4小時。收集菌體經SDS-PAGE電泳分析，發現人酸性成纖維生長因子(16kd)以可溶性表達為主，表達量佔菌體總蛋白的20％以上。
用1000ml發酵液，離心收集菌體約15克，用50mM磷酸緩衝液(pH70)含1％Triton溶液混懸菌體，在室溫下破菌20分鐘，破菌液經超聲波處理至無粘稠後離心去沉澱。上清經SP-sepharose Fast Flow離子交換層析和Heparin sepharose4B進行親和層析純化，最終產物的純度超過98％，熱原含量每mg蛋白低於10EU內毒素。
三.重組人酸性成纖維生長因子衍生物的理化性質和生物活性本方法製備的重組人酸性成纖維生長因子衍生物分子量為16KD，等電點大於10.0，紫外最大吸收峰為281nm，溴化氰肽圖分析含有二個甲硫氨酸。胺基酸約6，組成分析與理論值一致，由142個胺基酸組成。N末端測序證實與預期一致。
用依賴於人酸性成纖維生長因子的3T3細胞株的MTT方法測活，參照Sigma人酸性成纖維生長因子，測得本方法製備的重組人酸性成纖維生長因子衍生物的比活性是2.5X106U/mg與Sigma人酸性成纖維生長因子的比活性完全一致。
實例說明II一.重組人酸性成纖維生長因子衍生物融合表達系統的構建和測序選用大腸桿菌表達質粒pTrc99A(Pharmacia)作為構建的載體，此載體含有人酸性成纖維生長因子的cDNA序列，以及增加的Met和Ala的編碼鹼基。其中人酸性成纖維細胞生長因子cDNA序列用RT-PCR獲得，經過DNA的酶切操作裝載在大腸桿菌表達質粒pTrc99A的NcoI和BamHI位點。經ABI全自動基因測序後得到插入的人酸性成纖維生長因子的基因序列以及相對應的胺基酸序列，結果分析與設計的完全一致。
二.重組人酸性成纖維生長因子衍生物的重組表達和製備含A+2人酸性成纖維生長因子基因的pTrc99A轉化大腸桿菌JM109，在含100ug/ml氨苄青黴素的LB培養基中搖瓶過夜(37~C，200rpm)，再按1∶30接種含有100蝗gJml氨苄青黴素的LB培養基中，37~C培養3小時後，加入0.5mM IPTG誘導4小時。收集菌體經SDS-PAGE電泳分析，發現人酸性成纖維生長因子(16kd)以可溶性表達為主，表達量佔菌體總蛋白的20％以上。
用1000ml發酵液，離心收集菌體約15克，用50mM磷酸緩衝液(pH70)含1％Triton溶液混懸菌體，在室溫下破菌20分鐘，破菌液經超聲波處理至無粘稠後離心去沉澱。上清經SP-sepharose Fast Flow離子交換層析和Heparin sepharose4B進行親和層析純化，最終產物的純度超過98％，熱原含量每mg蛋白低於10EU內毒素。
三.重組人酸性成纖維生長因子衍生物的理化性質和生物活性本方法製備的重組人酸性成纖維生長因子分子量為16KD，等電點約為6，紫外最大吸收峰為280nm。胺基酸組成分析與理論設計值一致，由142個胺基酸組成，N末端測序與設計的重組人酸性成纖維生長因子N末端序列完全一致。
用依賴於人酸性成纖維生長因子的3T3細胞株的MTT方法測活，參照Sigma人酸性成纖維生長因子，測得本方法製備的重組人酸性成纖維生長因子衍生物的比活性是2.5X106U/mg與Sigma人酸性成纖維生長因子的比活性完全一致。
權利要求
1.一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述A+2人酸性成纖維生長因子衍生物，是在天然人人酸性成纖維生長因子N末端增加1個Met和一個非極性胺基酸的衍生物。
2.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述增加的第一個胺基酸主要為Ala和Val。
3.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述缺失和替換是應用基因工程技術的方法。
4.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述A+2人酸性成纖維生長因子衍生物可以是重組形式和人工合成形式。
5.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述重組形式適用於原核和真核表達體系，以及轉基因動植物體系來完成。
6.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述人工合成形式適用於蛋白多肽的自動合成和手工非自動合成方法來完成。
7.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述A+2人酸性成纖維生長因子衍生物具有人酸性成纖維生長因子相應的生物學功效。
8.根據權利要求1所述一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述A+2人酸性成纖維生長因子衍生物具有治療和預防疾病的功效，主要指創傷、難癒合或慢性潰瘍和神經損傷等。
9.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述生物功效和藥用功效具有藥物和非藥物價值。
10.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述藥物價值指各種劑型的藥品。
11.根據權利要求1所述的一種應用重組技術對生長因子進行改造的方法，其特徵是，所述非藥物價值指各種形式的商業產品。
全文摘要
本發明涉及一種應用基因工程重組手段對人人酸性成纖維細胞生長因子進行N末端改造的方法在其N末端加上Met和一個非極性胺基酸，比如Ala或Val。經本發明改造的重組人酸性成纖維細胞生長因子與人酸性成纖維細胞生長因子，在構建和測序以及理化性質和生物活性完全一致。
文檔編號C07K14/50GK1485341SQ0213095
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月23日 優先權日2002年9月23日
發明者李貴玲, 彭紅衛, 趙斌 申請人:武漢格瑞生物工程有限公司