一種小鏈黴菌及其在達託黴素製備中的應用的製作方法

2024-01-26 03:21:15

專利名稱：一種小鏈黴菌及其在達託黴素製備中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型微生物及其用途和應用，尤其涉及一種小鏈黴菌及其在製備 達託黴素中的應用。
背景技術：
達託黴素是一類稱為環酯肽類新抗生素家族的第一個產品。它是從小鏈黴菌 (Streptomyces parvus)發酵液當中提取得到。它不僅具有新穎的化學結構，且其作用模式 也與任一已獲準抗生素不同。達託黴素能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，由此迅速殺死 革蘭陽性菌。達託黴素除能作用於大多數臨床相關革蘭陽性菌外，更重要的是在體外對已 呈甲氧西林(methicillin)、萬古黴素和利奈唑胺等耐藥性分離菌株仍具強力活性。達託黴素為發酵產物，通過發酵培養得到的發酵濾液，再通過一系列純化工藝如 色譜層析、脫色、結晶和重結晶等可最終獲得達託黴素。一般達託黴素產生菌，生產能力不 穩定，產量較低，發酵副產物較多，雜質較多，導致後提取工作較為複雜，大大地增加了後序 的提純難度，難以獲得高純度的最終產物，從而無法產業化生產。

發明內容
本發明的目的是針對上述問題，提供一種發酵單位高、能穩定生產、產量多且副產 物少的達託黴素產生菌。一種小鏈黴菌SW0702，分類命名為小鏈黴菌(Sti^ptomyces parvus SW0702)，由 中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO :M2010136，保藏日期為2010年6月4曰。小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株的菌落特徵基內菌絲髮育良好，菌絲細長 分枝，直徑為0. 8 0. 9 μ m ；氣生菌絲生長良好，孢子絲著生在氣生菌絲體上，孢子絲直、柔 曲，孢子呈橢圓形或卵圓形，表面光滑，直徑為0. 65 0. 95 X 0. 95 2. 6 μ m,成熟孢子鏈孢 子個數在20個以上。蔗糖硝酸鹽瓊脂氣絲淺黃色至粉紅色。根據微生物形態學及國外相關資料的描述，結合小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的 菌株的各種培養特徵和形態特徵，該小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株應屬於小鏈黴菌 屬，定名為 Streptomyces parvus SW0702。本發明的另一個目的是提供該菌種在製備達託黴素中的應用。小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株可應用於發酵製備達託黴素。該製備方法包 括下列步驟a.發酵菌株採用小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株；b.菌株培養按常規方法製備的斜面茄子瓶，挖取斜面菌苔接入搖瓶種子培養得 搖瓶種子液；將搖瓶種子液接種於搖瓶發酵培養基中或種子罐中培養；將種子罐培養液接 種於發酵罐培養基培養，收集發酵液；優選在發酵培養過程中進行補料。c.發酵產物提取色譜層析、脫色、結晶和重結晶。
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其中所述的步驟b為按常規方法製備的斜面，挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入 搖瓶種子培養基，150 250rpm，培養16 32小時，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐 培養基體積0. 1 5%的接種量接種於種子罐，80 120rpm，培養16 32h ；將種子罐培養 液按發酵培養基體積5 15%的量接種於發酵罐培養基，120 200rpm，發酵培養130 240小時，收集發酵液；其中培養溫度均為28 32°C。其中步驟b中的補料在發酵的整個過程中是很重要。具體補料工藝根據發酵液實 際情況從PH、菌濃、碳氮源消耗、溶氧及菌絲鏡檢情況等幾方面來考慮，補料可採用連續流 加或間歇補料的方式。其中發酵培養過程中的補料，也即發酵罐補料視不同的具體發酵情況有多種，主 要有以下幾種不同的方法，1、待菌絲生長良好後，開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，根據菌 絲鏡檢情況和發酵單位情況調整補料量，所補的量為0. lml/L 0. 6ml/L發酵液.h ；或者2、待菌絲生長良好後，開始流加補8%癸酸氨，流速1. 0 3. 0ml/L/h，控制發酵時 溶氧不低於10%。具體地說就是在培養一定時間(此時發酵液較粘稠，菌絲生長旺盛，菌濃 20%以上)開始補料流加癸酸氨，當癸酸氨加入一定量後菌絲開始自溶，菌濃下降，培養液 變稀，溶氧上升，這時可以適當降低轉速、通氣量。或者3、在發酵過程中pH第一次升到7. 0 8. 5時開始補，所補的為癸酸與油酸甲酯以 體積比1 1的混合物料(為了簡便後序的描述，將癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混 合物料簡稱為前體)，所補的量為0. 03 0. 2ml/L發酵液.h ；在發酵進行到35 45小時 左右一直到結束，所補的量為0. 10 0. 55ml/L發酵液· h ；為了進一步地提高發酵單位，還可以在補料操作中增加菜油的補料，具體為當發 酵至70 78小時，暫時停止前體的補入，一次性補入第一次菜油，補量以體積計為發酵罐 體積的0. 5 1. 7%，空氣流量適當減少，約減少10 20%，在第一次菜油補料結束後4 8小時再重新開始補前體，補料量為0. 10 0. 55ml/L發酵液.h ；在第一次補菜油後24 40小時，暫停補前體，改補菜油(第二次)，一次性補入，補料量以體積計為發酵罐體積的 0. 5 1. 5%左右，空氣流量繼續適當減少，約減少10 20%。第二次菜油補料結束後4 8小時，恢復前體的補入。在發酵罐第二次補菜油後24小時，還可以再次暫停前體的補入，而再補一次菜油 (第三次)，補量以體積計為發酵罐體積的0. 5 1. 2%，之後再恢復前體的補入。在整個發 酵罐補料過程中，菜油的總補量以體積計為發酵罐體積的1. 5 4. 4%。或者4、待菌絲生長良好後開始補前體，根據菌絲鏡檢情況和發酵單位情況調整補料 量，菌絲生長粗壯，量多，發酵單位逐步產生並開始上升，所補的量為0. lml/L 0. 4ml/L發 酵液.h，當培養基中的還原糖降低至以下，開始補葡萄糖，以保持還原糖的濃度，濃度 維持在左右。在補料過程中，油酸甲脂和癸酸兩者按1 1體積混合，通過膜過濾除菌後用於補 料。由於癸酸有很強的腐蝕性，補料用的管道質量一定要好。防止癸酸補料不正常，導致發酵異常。另外，氣溫低於20°C以下，癸酸很容易凝固，造成補料管道堵塞，因此對管道要進行 保溫，保持管道通暢。本發明還公開了培養基按重量體積比計，搖瓶培養過程中的碳源為1.0 9. 5%，優選1. 5 9. 2%，最優選為8. 0 9. 0%;氮源為0. 4 3. 8%，優選1. 0 3. 5%， 最優選為2. 0 2. 8%;無機鹽為0. 2 2. 5%，優選0. 4 2. 0%，最優選0. 5 1. 3%;其 餘為水；種子罐培養過程中的碳源為1. 0 9. 5 %，優選1. 3 9. 2 %，最優選為7. 0 9.0% ；氮源為0. 8 3. 8 %，優選1. 5 3. 3 %，最優選為2. 0 3. 0 % ；無機鹽為0. 2 2.5%，優選0.4 2.0%，最優選0.5 1.3% ；其餘為水；其中碳源選自麥芽糊精、澱粉、澱粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、麥 芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優選麥芽糊精、澱粉水解糖、糖蜜、甘 油、葡萄糖、麥芽汁、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；最優選麥芽糊精、澱粉水解糖、糖 蜜、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾種。其中氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶大豆蛋 白、肉腖、尿素、硫酸銨鐵、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中一種或幾種；優選黃 豆餅粉、玉米蛋白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸銨鐵、酵母粉、生豆粉、 硝酸鹽、味精中一種或幾種；最優選生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三者的混合，或者植物性 蛋白腖、胰酶大豆蛋白兩者的混合。其中無機鹽選自K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一種或幾種；優選 K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3 中 的一種或幾種；最優選Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一種或兩種。其中，發酵培養過程中，按重量體積比計，碳源為1. 5 15%，優選2. 5 13%，最 優選5 11% ；氮源為0. 5 7.0%，優選0.7 5%，最優選0.7 3% ；無機鹽為0. 1 2. 0%，優選0.3 1.6%，最優選0.5 1.3%;胺基酸0 1.5%，優選0.2 1.2%，最優 選0.3 0.9% ；其餘為水；發酵培養過程中的培養基物料選擇如下碳源選自麥芽糊精、澱粉、可溶性澱粉、澱粉水解糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘 油、菜油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優選麥 芽糊精、可溶性澱粉、澱粉水解糖、甘蔗糖蜜、甘油、菜油、葡萄糖、麥芽汁、土豆糊精、燕麥片 中的一種或幾種，最優選麥芽糊精、可溶性澱粉、甘蔗糖蜜、葡萄糖、菜油、土豆糊精中的一 種或幾種。氮源選自黃豆餅粉、黃豆粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶大豆 蛋白、肉腖、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中的一種或幾種； 優選黃豆餅粉、黃豆粉、玉米蛋白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸亞鐵 銨、酵母粉、生豆粉、硝酸鹽、味精中一種或幾種；最優選為同時選擇黃豆粉、KNO3、穀氨酸鈉 三種物料同時選用蛋白腖、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉四種物料。無機鹽選自K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(SO4)2. 6H20、NaN03、KN03、MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、CH3COONa, CaCO3 中的一種或幾種；優選 Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、FeSO4. 7Η20、CH3COONa, CaCO3 中的一種或幾種；最優選 Fe(NH4)2(SO4)2. 6Η20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一種或多種。經發酵完成放罐後，對發酵產物進行提取，通過樹脂吸附並解吸，再進行色譜層析 和純化後可以獲得純度達98%以上的達託黴素。本發明所公開的小鏈黴菌CCTCC N0.M2010136是目前用於生產的一種高單位的達 託黴素產生菌，發酵性能優良，可用於大規模生產。發酵過程是達託黴素生產的重要環節， 其發酵水平與工藝優劣直接相關，本發明提供的發酵工藝經過搖瓶和10噸發酵罐中進行 試驗，其生產能力穩定。經檢測，用本發明提供的菌種及發酵培養方法製備的達託黴素單位 可高達3100 μ g/ml或以上，從而為後續的工業化生產提供了良好的基礎。同時本發明的發 酵副產物相對較少，並降低了後提取的難度，提取和純化的工藝相對簡單，大大提高了收率 和純度，在工業化生產上更具優勢。菌株保藏情況保藏於武漢中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號為 CCTCCNO :M2010136，分類命名為小鏈黴菌SW0702 (Sti^ptomyces parvusSW0702)，保藏日期 為2010年6月4日。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及 技術參數理解為對本發明的限制。實施例1 小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的培養特徵將小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株接種於高氏一號、葡萄糖天門冬素等用於 觀察形態特徵的培養基。28°C培養一定的時間5、8、10天，觀察並進行描述。表1、小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的菌株在各種培養基上的菌落特徵(見表1) 實施例2 生理生化特徵及碳源利用生理生化性質採用小鏈黴菌分類中的標準方法。小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136的生理生化反應為該菌明膠液化緩慢，鮮黃色素。 牛奶不凝固，迅速腖化。澱粉水解。纖維素不生長。硝酸鹽還原弱，不產生類黑色素。利 用Biolog自動微生物鑑定系統考察小鏈黴菌對95種不同碳源的代謝情況將菌株接種 於BUG+B平板培養基，37°C恆溫培養16h，用無菌棉籤將平板上的菌體洗下，與接種液(GN/ GP-IF+T)混合，製成菌懸液，用濁度計調整至20%T。用8孔電動加液器將菌懸液分別加在 Biolog GP2微孔的各孔中，每孔150uL。將微孔鑑定板放在37°C培養箱中，分別在培養6h、 24h和48h後將其置於Biolog讀數儀上讀取結果。經Biolog讀數儀分析代謝指紋，小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136可較強利用其中22 種碳源，對其它73種碳源利用能力較弱或不能利用。系統給出48h鑑定結果見表2。表2小鏈黴菌CCTCC NO :M2010136對Biolog GP2板上95種碳源的利用能力 說明+，能利用碳源；-，不能利用碳源；B 利用碳源能力較弱實施例3 達託黴素的生產發酵培養1.種子菌種培養及保存固體培養基葡萄糖0. 5g，酵母膏0. 3g，麥芽汁0. 3g，CaC030. 3g，瓊脂1. 8g，加水100ml,pH7.0培養菌株接種於固體培養基斜面上，30°C培養7 10天。固體培養結束後，斜面放置4 10°C冷藏備用。2.搖瓶種子培養培養基甘油20g，可溶性澱粉80g，酵母粉6g，生豆粉20g，胰酶大豆蛋白20g， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 IOg,加水 2000ml，pH 7· 0接種量挖取斜面菌苔塊接入2L搖瓶種子培養基中培養30°C，24h搖床轉速250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現象且菌濃為11%左右，將2L搖瓶種子培養液，接入以 下種子罐中。3.種子罐種子培養培養基甘油4kg，酵母粉1. 2kg，黃豆餅粉1. 6kg，NaNO3 0. 4kg，消泡劑0. 2kg， pH7. 0裝量1000L種子罐內裝培養基400L, 121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養30°C，28h4.發酵培養培養基可溶性澱粉100kg，葡萄糖50kg，硝酸鉀30kg，黃豆粉100kg，穀氨酸鈉 20kg，五水硫酸亞鐵 0. 25kg，菜油 100kg, CaCO3 10kg, pH 7. 0裝量10噸發酵罐內裝培養基5噸接種量400L的種子液培養UOrpm，30°C，140h5.發酵補料在發酵培養過程中pH第一次升到7. 0左右時開始補前體，補料量為0. 03ml/L發酵液.h，即每小時補150ml前體；在發酵進行到35小時左右一直到結束，補料 的量為0. 55ml/L發酵液.h，即每小時補2750ml前體。按照上述發酵條件和工藝，在10噸發酵罐進行3批發酵試驗，發酵單位分別為 3780 μ g/ml、3250 μ g/ml 禾口 3420 μ g/ml。實施例4 達託黴素的生產發酵培養1.搖瓶種子培養培養基葡萄糖100g，糖蜜40g，甘油20g，植物性蛋白腖14g，玉米漿36g，KNO3 26g，加水 2000ml, ρΗ7· 0培養:30°C,24h, 250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現象且菌濃約13%左右，將2L搖瓶種子培養液，接入以 下種子罐中。2.種子罐種子培養種子罐培養甘油26kg，葡萄糖50kg酵母粉14. 2kg，生豆粉5. 2kg、胰酶大豆蛋白 4kg, Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 0. 6kg，消泡劑 0. 16kg，ρΗ7· 0裝量2000L種子罐內裝培養基800L, 121°C滅菌30min。
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接種量2L搖瓶種子液培養30°C，32h3.發酵罐培養發酵培養基葡萄糖44kg，甘蔗糖蜜31kg，黃豆粉182kg，蛋白腖165kg，乙酸鈉 48kg，硫酸亞鐵銨3kg，加水5噸，ρΗ7· 2裝量10噸發酵罐內裝培養基6噸接種量800L的種子液培養120rpm，30°C，190h4.發酵補料在發酵培養過程中pH第一次升到7. 5左右時開始補前體；前體的量為0. 08ml/L 發酵液.h ；在發酵進行到38小時左右一直到結束，前體的量為0. 45ml/L發酵液.h。但在 發酵至70小時左右，暫停前體的補入而一次性補入菜油，菜油的補量以體積計為發酵罐體 積的0. 5%左右即30kg，空氣流量適當減少10 20%;菜油補料結束後4小時繼續補前體， 補料量為0. 10ml/L發酵液.h ；在補菜油後24小時，再次暫停補前體而改補菜油，一次性補 入，補料量以體積計為發酵罐體積的1. 5%左右即90kg，空氣流量繼續適當減少10 15%; 然後接著按前面所述的補前體，0. 45ml/L發酵液.h 一直到發酵結束。放罐所得發酵液效價為3100 μ g/ml。按照上述發酵條件和工藝，若在第二次補菜油後24小時，第三次補菜油，補量以 體積計為發酵罐體積的1. 0%左右即60kg，然後接著按前面所述的補前體，即以0. 25ml/L 發酵液.h—直到發酵結束。放罐時，發酵單位為3200 μ g/ml。實施例5 達託黴素的中試發酵培養1.搖瓶種子培養培養基麥芽糊精20g，植物性蛋白腖40g，K2HPO4IOg, pH自然，加水2000ml培養 300C，培養:30°C, 25h, 250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現象且菌濃約為9%左右，將2L搖瓶種子培養液，接入以 下種子罐中。2.種子罐種子培養培養基葡萄糖1.7kg，土豆糊精4. 5kg，甘蔗糖蜜730g，黃豆餅粉2. 6kg， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 1. 2kg，消泡劑 100g，ρΗ7· 0裝量300L種子罐內裝培養基100L，121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養30°C，27h3.發酵罐培養發酵培養基葡萄糖45kg，麥芽糊精65kg，酵母粉3. 5kg，Fe (NH4) 2 (SO4) 2x6H20 1.5kg，消泡劑 2kg，pH 7.0裝量2噸發酵罐內裝培養基1噸接種量100L的種子液培養120rpm，30°C，160h
4、發酵補料在發酵過程中pH第一次升到8. 5左右時開始補前體，補料的量為0. 2ml/L發酵 液.h ；在發酵進行到45小時左右一直到結束，補料的量為0. 10ml/L發酵液.h。同時監測還原糖的濃度，小於0. 9%時開始補入50%的葡萄糖2L，繼續監測還原 糖的濃度，使之維持在左右。放罐所得發酵液效價為3200μ g/ml。實施例6 達託黴素的生產發酵培養1、搖瓶種子培養搖瓶種子培養基糊精180g，胰酶大豆蛋白8g，NaNO3 1. 0g，加2000ml水，240rpm， 30°C, 24 28h。2、種子罐培養種子罐培養基葡萄糖9kg，土豆糊精36kg，甘蔗糖蜜9kg/L，黃豆餅粉9kg， Fe (NH4) (SO) 2. 6H203kg,消泡劑 300g，pH 值 7. 2培養過程pH值流加氨水來控制，pH值控制在6. 5 7. 0之間。裝量1000L種子罐內裝培養基600L，121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養30°C，30h3、發酵罐培養發酵罐培養基葡萄糖20kg，土豆糊精42kg，糖蜜28kg/L，酵母粉38kg， Fe (NH4)2SO4. 6H20 4kg，，消毒前加入少量高溫澱粉酶，一般3u/g，可以液化即可。裝量10噸發酵罐內裝培養基6噸接種量600L的種子液培養120rpm，156 164h培養溫度30士 1°C，罐壓0. 03 0. 05MPa，空氣流量1 lvvm，攪拌轉速80 140rpm,發酵過程用濃氨水調節pH不低於6. 5，發酵過程中溶氧不低於20 %，4、發酵補料在培養28hr左右(此時發酵液較粘稠，菌絲生長旺盛，菌容20%以上)開始補料 流加癸酸氨(8%以癸酸重量計算)流速1.5 2.0ml/L/h至發酵結束。當癸酸加入一定量 後菌絲開始自溶，溶氧上升，可以適當降低轉速、通氣。放罐時，發酵單位為3100 μ g/ml。以上所述的實施中所獲得的發酵液單位高，雜質少，發酵液經過濾取濾液，通過樹 脂吸附並解吸，再進行色譜層析和純化，即可獲得純度在98%以上的達託黴素。
權利要求
一種菌株，分類命名為小鏈黴菌SW0702(Streptomyces parvus SW0702)，由武漢中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM2010136，保藏日期為2010年6月4日。
2.如權利要求1所述小鏈黴菌的CCTCCNO :M2010136的菌株在發酵製備達託黴素中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於該製備方法包括下列步驟a.發酵菌株採用小鏈黴菌CCTCCNO :M2010136的菌株；b.菌株培養按常規方法製備的斜面，挖取斜面菌苔接入搖瓶種子罐培養得搖瓶種子 液；將搖瓶種子液接種於種子罐中培養；將種子罐培養液接種於發酵罐培養基培養，收集 發酵液；其特徵在於在發酵培養過程中進行補料，c.發酵產物提取樹脂吸附並解吸，色譜層析和純化，結晶； 優選在所述的步驟b發酵培養過程中進行補料。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於其所述的步驟b為按常規方法製備的斜面， 挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入搖瓶種子培養基，150 250rpm，培養16 32小時，得 搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養基體積0. 1 5%的接種量接種於種子罐，80 120rpm，培養16 32h ；將種子罐培養液按發酵培養基體積5 15%的量接種於發酵罐培 養基，120 200rpm，發酵培養130 240小時，收集發酵液；其中培養溫度均為28 32°C。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵是所述的步驟b中的發酵培養過程中的補料為1)、待菌絲生長良好後開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，所補的量為 0. lml/L 0. 6ml/L 發酵液.h ；或2)、待菌絲生長良好後開始流加補8%癸酸氨，流速1.0 3. 0ml/L/h ； 或3)、在發酵過程中pH第一次升到7.0 8.5時開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1 的混合物料，所補的量為0. 03 0. 2ml/L發酵液.h ；在發酵進行到35 45小時左右一直 到結束，所補的量為0. 10 0. 55ml/L發酵液.h ；其中在發酵至70 78小時，暫停癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料補料，一 次性補入菜油，所補菜油以體積計為發酵罐體積的0. 5 1. 7%，空氣流量減少10 20%; 菜油補料結束後4 8小時繼續依前方法補癸酸與油酸甲酯以體積比11的混合物料; 在補菜油後24 40小時，暫停補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，再次一次性 補入菜油，所補菜油量以體積計為發酵罐體積的0. 5 1. 5%左右，空氣流量繼續減少10 20%，菜油補料結束後4 8小時繼續依前方法補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合 物料； 或4)、待菌絲生長良好後開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，所補的量為 0. lml/L 0. 4ml/L發酵液.h，當培養基中的還原糖降低至以下，開始補葡萄糖，以保持 還原糖的濃度在1%。
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7.如權利要求6所述的應用，其特徵是所述的3)中的發酵培養過程補料在第二次補菜 油後24小時，暫停癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料的補入，再補一次菜油，一次性補入，補量以體積計為發酵罐體積的0. 5 1. 2%，菜油補料結束後4 8小時繼續依前 方法補癸酸與油酸甲酯以體積比11的混合物料。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特徵是所述的菜油的總補量以體積計為發酵罐體 積的1. 5 4. 4%。
9.如權利要求3所述的應用，其特徵是所述的步驟b中的培養基為按重量體積比計， 搖瓶罐培養過程中的碳源為1. 0 9. 5 %，氮源為0. 4 3. 8 %，無機鹽為0. 2 2. 5 %，種子 罐培養過程中的碳源為1. 0 9. 5%，氮源為0. 8 3. 8%，無機鹽為0. 2 2. 5%，其餘為 水；其中碳源選自麥芽糊精、澱粉、澱粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、 土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋 白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶大豆蛋白、肉腖、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生 豆粉、硝酸鹽、味精中的幾種；無機鹽選自K2HP04、NaCl, Fe (NH4)2(SO4)2. 6H20、NaNO3 > KNO3 > MgSO4. 7H20、FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一種或幾種；發酵培養過程中，碳源為1.5 15%，氮源為0.5 7.0%，無機鹽為0. 1 2.0%氨 基酸0 1. 5%，其餘為水；其中碳源選自麥芽糊精、澱粉、可溶性澱粉、澱粉水解糖、甘蔗糖 蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘油、菜油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中 的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白腖、植物性蛋白腖、胰酶 大豆蛋白、肉腖、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中的幾種；無 機鹽選自 K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(S04)2· 6H20、NaN03、KNO3、MgSO4. 7H20、FeS04. 7H20、CH3COONa、 CaCO3中的一種或幾種。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵是所述的其特徵是所述的步驟b中的培養基為 按重量體積比計，搖瓶培養過程中的碳源為8. 0 9. 0%，氮源為2. 0 2. 8%，無機鹽為0. 5 1. 3%， 種子罐培養過程中的碳源為7. 0 9. 0%，氮源為2. 0 3. 0%，無機鹽為0. 5 1. 3%，其 餘為水；其中碳源選自澱粉水解糖、糖蜜、麥芽糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾 種；所述的氮源為生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三種或植物性蛋白腖、胰酶大豆蛋白二種； 無機鹽選自Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一種或幾種；發酵培養過程中，碳源為5 11%，氮源為0. 7 3%，無機鹽為0. 5 1. 3%，胺基酸 0.3 0.9%，其餘為水；其中碳源選自甘蔗糖蜜、可溶性澱粉、麥芽糊精、葡萄糖、菜油、土 豆糊精中的一種或幾種；所述的氮源為黃豆粉、KN03、穀氨酸鈉三種或蛋白腖、尿素、硫酸亞 鐵銨、酵母粉四種；無機鹽選自 Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一種 或幾種。
全文摘要
本發明公開了一種小鏈黴菌及其在達託黴素製備中的應用，該菌株由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM2010136，保藏日期為2010年6月4日。本發明製備達託黴素的方法為a.採用小鏈黴菌CCTCC NOM2010136為發酵菌株；b.菌株培養斜面菌苔接入搖瓶種子罐培養得搖瓶種子液；將搖瓶種子液接種於種子罐中培養；將種子罐培養液接種於發酵罐培養基培養，收集發酵液；發酵培養過程中進行補料，c.發酵產物提取。本發明提供的發酵工藝經過中試和10噸發酵罐中進行試驗，其生產能力穩，發酵單位高且發酵副產物相對較少，大大地降低了後提取的難度，適宜於工業化大生產。
文檔編號C12R1/465GK101899410SQ201010225330
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者朱健, 李豔, 王蓓, 許永鋒, 陳曉霞, 高興蓉 申請人:杭州華東醫藥集團生物工程研究所有限公司