一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法及其應用的製作方法
2024-02-24 04:43:15
一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法及其應用，該方法包括以下步驟：（1）將金膜用含有巰基的矽烷溶液處理；（2）將經步驟（1）處理後的金膜用酸溶液處理；（3）將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼於經步驟（2）處理後的金膜上；（4）將經步驟（3）得到的金膜依次的浸漬在四氯化矽（SiCl4）、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中（此過程可循環多次）；（5）將經步驟（4）得到的金基底用酸溶液處理。本發明提供的方法易於在基底上製備三維結構的納米管（柱）陣列，並且管（柱）的尺寸可控，可用作生物晶片，並可進行高靈敏度、非標記的生物檢測。
【專利說明】一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法及其應用
[0001]優先權
[0002]本申請要求申請號為201310754275X、名稱為《一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法及其應用》的中國專利申請的優先權。
【技術領域】
[0003]本發明涉及一種基於三維結構納米陣列生物晶片及其製備方法，具體地，本發明涉及一種在金膜上合成三維結構二氧化矽納米管陣列生物晶片及其製備方法，以及該生物晶片在生物分子特異性檢測方面的應用。
【背景技術】
[0004]高靈敏度的生物傳感在許多領域中已經得到廣泛的應用，包括在生物醫藥研究、環境監控、蛋白質組學、基因組學、藥劑學、醫療診斷等領域，同時其也獲得了越來越廣泛的認可。例如，基於螢光信號檢測的生物傳感的靈敏度就可以很高，甚至可以檢測到單個的生物分子。然而基於螢光法的生物傳感也有些弊端，如用螢光集團標記生物分子價格非常的昂貴並且很耗時，而且這種方法在某些應用中甚至不可能實現。另外，標記螢光集團後可能會影響原有生物分子的某些功能。所以採用非標記的方法去直接檢測生物分子的傳感器相比就顯得比較重要。
[0005]在過去的一二十年中，很多基於不同類型納米結構的非標記生物傳感器已經得到廣泛的研究，這些傳感器都得益於納米技術的特點。例如有基於納米線、納米孔、納米管或納米柱類型的生物傳感器等。不同類型的非標記的生物傳感器可以簡單和快速的將探針分子和靶分子之間的相互作用的響應轉化成光信號、電信號、熱信號或是聲信號等。其中對於非標記的光學生物傳感器來說，信號轉變方法主要分為兩類:光學幹涉和表面等離子體。基於納米薄膜結構的光學波導傳感器就是一種典型的光學幹涉的生物傳感器。它具有兩個主要的優點。首先、入射光的電磁場以增強的光波導模式被限制在納米薄膜層中，並且能夠有效地覆蓋到薄層中所吸附的生物分子。其次、由於納米薄膜具有很大的吸附生物分子表面積的結構特點，進而導致生物分子的富集，所以可以進一步提高生物傳感器的響應。雖然如此，相對於基於螢光信號檢測的生物傳感器，非標記的生物傳感器的靈敏度還不是很高。相應的，如何提高非標記的生物傳感器的響應需要進一步的研究。
【發明內容】
[0006]本發明是提供了 一種基於三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片及其製作方法，以及其在生物分子特異性檢測方面中的應用。
[0007]本發明提供了一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法，該方法包括以下步驟:
[0008]( I)將金膜用含有巰基的矽烷溶液處理；
[0009](2)將經步驟(I)處理後的金膜用酸溶液處理；[0010](3)將通孔的陽極氧化鋁薄層膜貼於經步驟(2)處理後的金膜上；
[0011](4)將經步驟(3)得到的金膜順序的浸潰在四氯化矽(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中(此過程可循環多次);
[0012](5)將經步驟(4)得到的金基底用酸溶液處理。
[0013]本發明還提供了由上述所述方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片。
[0014]本發明還提供了由上述所述方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片在生物分子特異性檢測方面的應用。
[0015]在本發明中，將金膜用含有巰基的矽烷溶液處理，再用酸溶液處理，可以得到親水性的表面，然後將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼於金膜上，這樣金膜的親水性可以增強薄膜與金膜的連接，再通過交替浸入在四氯化矽(SiCl4)、正己烷、正己烷和甲醇的混合液、乙醇和水中一定次數得到二氧化矽管(柱)，最後將得到的金基底浸泡於酸溶液中得到三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片。本發明提供的方法易於在基底上製備三維結構的納米管(柱)陣列，並且管(柱)的尺寸可控，可用作於生物晶片進行高靈敏度、非標記的生物檢測。
[0016]本發明的其他特徵和優點將在隨後的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]附圖是用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用於解釋本發明，但並不構成對本發明的限制。在附圖中:
[0018]圖1是本發明實施例1製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片界面的掃描電子顯微鏡圖(SEM)；
[0019]圖2是本發明實施例1中使用的通孔的陽極氧化鋁薄膜的表面掃描電子顯微鏡圖(SEM)；
[0020]圖3是本發明按照應用例I的方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片特異性檢測鏈酶親和素(streptavidin)的反射率角度譜圖；
[0021]圖4是按照應用例I和對比例I的方法製備的利用三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片檢測鏈酶親和素(streptavidin)的動力學曲線圖。
【具體實施方式】
[0022]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。
[0023]本發明提供了一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法，該方法包括以下步驟:
[0024]( I)將金膜用含有巰基的矽烷溶液處理；
[0025](2)將經步驟(I)處理後的金膜用酸溶液處理；
[0026](3)將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼於經步驟(2)處理後的金膜上；
[0027](4)將經步驟(3)得到的金膜使用溶膠凝膠法，依次順序的浸潰在四氯化矽(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中(此過程可循環多次)；
[0028](5)將經步驟(4)得到的金基底用酸溶液處理，除去氧化鋁薄膜。[0029]根據本發明，在步驟(I)中，所述金膜為表面具有金層的玻璃基底材料。在本發明，可以使用磁控濺射蒸鍍法或熱蒸鍍法在該基底材料上鍍上一層具有35-50nm厚度的金，優選為 40_45nm。
[0030]根據本發明，在步驟(I)中，所述的巰基矽烷溶液為(3-巰基丙基)三甲氧基矽烷溶液，所述溶液濃度為l_30mM，優選為18-22mM。溶液中浸泡時間為3_12小時，優選為3小時。本發明中，可將巰基矽烷溶解於有機溶劑中配成巰基矽烷有機溶液，其中對溶解所述巰基矽烷的有機溶劑沒有特殊要求，可以為本領域所熟知的有機溶劑，例如，可以為甲醇、乙醇或丙酮中的一種或多種，優選地，可以為甲醇。
[0031]根據本發明，在步驟(2)中，所述酸溶液可以為鹽酸水溶液，濃度為0.05-0.2mol,優選為0.1mol0溶液中處理時間為1-20小時，優選為10-12小時，溫度為室溫。
[0032]根據本發明，在步驟(3)中，通孔的陽極氧化鋁薄膜和經步驟(2)所得金膜基底可浸潰於丙酮或丙酮與水的混合溶液中。當所述溶液為丙酮與水的混合液時，丙酮與水用量體積比可為1-3:1，優選為1:1。氧化鋁薄膜覆蓋到金膜基底上，然後乾燥箱中常溫放置24-48小時，優選為24-30小時。
[0033]根據本發明，在步驟(4)中，經步驟(3)處理的金膜基底依次順序的浸潰於四氯化矽(SiCl4)、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中。其中在四氯化矽中浸潰時間為1-2分鐘，其他溶液中為3-5分鐘，優選為5分鐘。正己烷與甲醇用量的體積比為1:1。步驟(4)為表面溶膠凝膠法的一次循環。
[0034]根據本發明，在步驟(5)中，所用的酸溶液為磷酸溶液，濃度為5-15質量％，優選為10-12質量％。溫度為20-40°C。
[0035]本發明還提供了由上述所述方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片。
[0036]本發明還提供了由上述所述方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片在生物分子特異性檢測方面的應用。
[0037]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述，但本發明的保護範圍並不僅限於這些實施例。
[0038]在以下實施例和對比例中:
[0039]3_ 氨丙基三乙氧基娃燒(3-aminopropyltriethoxysilane)購自於 Alfa Aesar公司；生物素(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)購自上海浩然生物技術有限公司；鏈酶親和素(streptavidin)購自北京博奧森生物技術有限公司。
[0040]實施例1
[0041]本實施例用於說明採用本發明的方法製備三維二氧化矽納米管陣列結構的生物
-H-* I I
心/T O
[0042](I)金膜的製備:將K9玻璃片置於體積比為7:3的H2SO4 (98重量%)和H2O2 (30重量％)混合溶液中，清洗I小時，然後用去離子水衝洗乾淨。將清潔後的K9玻璃片用磁控濺射法蒸鍍一層40nm厚的金，即本實施例使用的金基底；
[0043](2)金基底的巰基矽烷溶液處理:用甲醇配置20mmol的(3_巰基丙基)三甲氧基矽烷溶液。將經步驟(I)得到的金基底浸入上述溶液中溶液3小時。
[0044](3)金基底的酸溶液處理:使用0.1mol的鹽酸溶液處理經步驟(2)後的金基底，處理時間為10小時，常溫；
[0045](4)通孔氧化鋁薄膜貼於金基底上:通孔的陽極氧化鋁薄膜和經步驟(3)所得金基底可浸入於丙酮與水的混合溶液，其中丙酮與水的用量體積比為1:1。讓氧化鋁薄膜貼於金基底上，然後乾燥箱中常溫放置24小時。其中陽極氧化鋁薄膜的表面掃描電子顯微鏡圖(SEM)如圖2所不，圖中S4800表不掃描電子顯微鏡的型號,5.0kV表不觀測樣品時所加的電壓，9.1mmX 50.0k分別表示電子槍與樣品的距離以及放大的倍數，2013-3-13表示拍照的日期，1.00 μ m表示標尺。
[0046](5) 二氧化矽納米管的製備:將經步驟(4)得到的金基底浸入四氯化矽中2分鐘，然後再依次浸入正己烷、1:1體積比的正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水中各5分鐘。這樣一組是一次表面溶膠凝膠循環。對於本實施例，使用了 6次表面溶膠凝膠循環。
[0047]測得實施例1製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片如圖1所示。圖1中10為金膜,20為二氧化娃納米管陣列，S4800表不掃描電子顯微鏡的型號,5.0kV表示觀測樣品時所加的電壓，9.9mmX50.0k分別表示電子槍與樣品的距離以及放大的倍數，2013-7-3表示拍照的日期，1.00 μ m表示標尺。
[0048]應用例I
[0049]特異性檢測鏈酶親和素
[0050]本應用例使用按照實施例1方法製備的三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片。檢測裝置是基於Kretchmann結構。當滿足入射光與在納米管陣列層中的波導模式耦合時，經過生物晶片反射光將在反射率角度譜上以一個共振凹槽的形式出現。這個共振凹槽的角度位置與納米管陣列層的有效折射率有關。任何通過吸附生物分子到納米管陣列層中或者由於待測溶液折射率的微小改變而導致納米管陣列層的有效折射率改變都將被波導模式放大，最終體現在反射率角度譜中共振凹槽的移動。另外，如果把入射光角度固定在共振凹槽的角度附近去測量反射率，這種納米管陣列層的有效折射率的改變也可以通過折射的變化來量化。
[0051]生物晶片連接探測生物分子的方法如下:將生物晶片置於5重量％的3-氨丙基三乙氧基娃燒(3-aminopropyltriethoxysilane)溶液中24小時。3-氨丙基三乙氧基娃燒一端可以連接二氧化矽表面的羥基，另一端可以與含-NHS的官能團進行反應。此後，同一樣品上利用PDMS流道流入NHS修飾的生物素(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)溶液I小時後換成IOmmol磷酸緩衝液(buffer) —定時間，然後測量反射光的強度隨入射角度的變化，如圖3所示。圖3中，縱軸為反射率(Reflectivity),橫軸為光入射角度(Incident Angle),單位為度(degree)，數據點為菱形的曲線為使用該晶片檢測緩衝溶液(buffer)所得到的反射率角度譜圖，數據點為圓形的曲線為通入500 μ mol的生物素溶液(500 μ mol biotin)達到吸附飽和以後所測量的反射率角度譜圖，數據點為方形的曲線是通入IOOnmol鏈酶親和素(IOOnmol streptavidin)達到吸附飽和後所測的反射率角度譜圖。對於特異性檢測鏈酶親和素分子，IOOnmol的鏈酶親和素通過PDMS流道流入樣品表面90分鐘，然後用IOmmol磷酸緩衝溶液(buffer)衝洗一段時間，此過程中將入射角度固定在共振角度處(62.08° )，然後記錄反射率隨著時間的變化，如圖4所示。圖4中，縱軸為反射率(Reflectivity)，橫軸為時間(time)，單位為秒(s)，l表示應用例I的結果曲線，2表示對比例I的結果曲線，
3表示通入IOOnmol鏈酶親和素(IOOnmol streptavidin)的時間點,4表示通入緩衝溶液(buffer)的時間點。最後測量反射光的強度隨入射角度的變化，如圖3所示，共振凹槽的角度從修飾生物素後的62.08°移動到結合鏈酶親和素的62.72°。
[0052]對比例I
[0053]檢測鏈酶親和素
[0054]生物晶片連接探測生物分子的方法如下:對於檢測鏈酶親和素分子，先用IOmmol的磷酸緩衝液通過PDMS流道流入樣品表面建立背景基線，然後通入IOOnmol的鏈酶親和素溶液到樣品表面，此過程中在通入磷酸緩衝溶液後測得的共振凹槽角度處測量反射率的變化，從圖4中看出，反射率的變化相對於應用例I中幾乎可忽略。
[0055]本發明應用例I和對比例I可充分說明鏈酶親和素分子與生物素分子特異性的結合在一起。另外，也可說明此三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片可以應用於生物分子的特異性檢測。
[0056]本發明涉及在生物分子修飾方面在生物分子特異性檢測中的應用並不受限於上述方法，可以使用其他末端訂製的烷基連接於二氧化矽管上，並使用相應的生物分子連接方法。連接的生物分子也不受限於此實施例。
[0057]以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。
[0058]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0059]此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【權利要求】
1.一種基於三維結構納米陣列生物晶片的製備方法，其特徵是: A、將金膜用含有巰基的矽烷溶液處理； B、將經步驟A處理後的金膜用酸溶液處理； C、將通孔的陽極氧化鋁薄膜貼於經步驟B處理後的金膜上； D、將經步驟C得到的金膜順序地浸潰在四氯化矽、正己烷、正己烷與甲醇的混合液、乙醇和水這五種溶液中，浸潰一次或循環多次； E、將經步驟D得到的金基底用酸溶液處理，除去氧化鋁薄膜，得到三維二氧化矽納米管陣列結構的生物晶片。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟A中，所述的含有巰基的矽烷溶液為(3-巰基丙基)三甲氧基矽烷溶液，且所述溶液濃度為l-30mM ;溶液中浸泡時間為3-12小時。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟A中，所述含有巰基的矽烷溶液是將巰基矽烷溶解於有機溶劑中配成的巰基矽烷有機溶液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟B中，所述酸溶液為鹽酸溶液，濃度為0.05-0.2mol ;溶液中處理時間為1-20小時，常溫。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟C中，通孔的陽極氧化鋁薄膜和經步驟B所得金膜基底浸潰於丙酮或丙酮與水的混合溶液中；當所述溶液為丙酮與水的混合液時，丙酮與水用量體積比為1-3:1 ;氧化鋁薄膜覆蓋到金膜基底上，然後乾燥箱中常溫放置24-48小時。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟D中，在四氯化矽中浸潰時間為1-2分鐘，其他溶液中為3-5分鐘；正己烷與甲醇用量的體積比為1:1。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟E中，所用的酸溶液為磷酸溶液，濃度為5-15質量％ ;溫度為20-40°C。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是:在步驟A中，所述金膜附著於玻璃基底材料的表面，金膜的厚度為40-45nm。
9.一種基於三維結構納米陣列生物晶片，其特徵是:按照權利要求1-8中任一權利要求中所述的方法製備。
10.一種非標記的直接檢測生物分子的生物晶片，其特徵是:使按照權利要求1-8中任一權利要求中所述的方法製備的生物晶片，用於生物分子的特異性檢測。
【文檔編號】G01N21/41GK103712951SQ201410004328
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】孫樹清, 凡勇, 丁宇, 何永紅, 馬輝 申請人:清華大學深圳研究生院