一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體及其製備方法與流程
2024-02-26 08:24:15 1
本發明涉及一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體及其製備方法，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的急性、高度接觸性傳染性傳染病，豬感染TGEV主要臨床症狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水。TGE首先在1946年首次由Dolye和Hutching在美國報導，隨後在歐洲、美洲、亞洲等多個國家相繼報導發生病例，現在已經成為一種全世界性豬的疾病。同時TGE發病率高，各年齡段的豬均可發病，尤其是兩周齡內仔豬，死亡率高達100％。PED的頻發給我國養豬業造成嚴重的經濟損失。疫苗接種是預防本病發生的途徑之一，但是已研製出的PED滅活和弱毒疫苗效果並不理想。單鏈抗體是一種基因工程抗體，以其分子量小、特異性高、穿透力強、易於改造等特點，顯示了巨大的應用潛力，越來越受到人們的重視。
技術實現要素：
本發明的目的之一是提供一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的基因工程單鏈抗體，該單鏈抗體能夠與豬傳染性胃腸炎病毒特異性結合，可用於阻斷豬傳染性胃腸炎病毒的感染和入侵。
本發明提供的一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體，所述單鏈抗體具有如SEQ ID No.1所示的重鏈可變區的胺基酸序列、如SEQ ID No.2所示的輕鏈可變區胺基酸序列和位於重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接肽；所述連接肽為(GGGGSGGGGSGGGGS)。
上述單鏈抗體具有如SEQ ID No.3所示的胺基酸序列。
本發明的另一目的是提供一種編碼上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的基因，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
為了方便地對單鏈抗體篩選和表達純化，在上述序列的基礎上進一步設計酶切位點和識別序列，進一步含有內切酶位點SfiI和NotI識別序列，SfiI的序列為GGCCCAGCCGGCC，NotI的序列為GCGGCCGC。
本發明還提供一種表達上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的表達載體，所述載體為原核表達載體。優選的，所述載體為pCANTAB-5e-ScFv載體。
本發明的再一目的是提供一種製備上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的方法，具體步驟如下：
(1)採用RT-PCR法直接從豬傳染性胃腸炎病毒感染的豬外周血RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因；
(2)利用SOE-PCR法將連接肽與重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因相連構建豬源性單鏈抗體基因；
(3)將步驟(2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌粒載體中，構建重組噬菌粒；
(4)將步驟(3)的原核表達載體轉化入E.coli TG1感受態細胞(北京普如汀生物技術有限公司)，培養、建立噬菌體單鏈抗體庫；
(5)將步驟(4)表達的單鏈抗體用豬傳染性胃腸炎病毒作為包被抗原，進行富集淘選，陽性克隆即為抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的噬菌體。
(6)將步驟(5)所得陽性單鏈抗體噬菌體，即獲得所述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體。
本發明的技術原理是採用RT-PCR直接從豬傳染性胃腸炎病毒感染的豬外周血RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區(VH)基因和輕鏈可變區(VL)基因。利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應)法將linker與VH基因和VL基因相連構建豬源性單鏈抗體(ScFv)基因，並將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5e中，phage-ELISA篩選抗ETEC單鏈抗體的陽性克隆，測序後使用DNAstar的MegAlin進行序列分析，證明該單鏈抗體屬於豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體。
和現有技術相比，本發明的有益效果是：抗豬傳染性胃腸炎病毒的基因工程抗體能與豬傳染性胃腸炎病毒特異性結合，能夠用於豬傳染性胃腸炎病的預防和治療。
附圖說明
圖1為VH-Linker-VL PCR電泳圖；M為2000bp DNA ladder marker；1、2為VH-Linker-VL基因PCR產物。
圖2為pCANTAB5e-ScFv雙酶切鑑定；M為2000bp DNA ladder marker；1、2為重組質粒經Sfi I和Not I雙酶切。
圖3為重組原核表達載體pCANTAB5e-ScFv質粒圖譜。
圖4為噬菌體抗體庫的多樣性分析。
圖5為抗傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的純化電泳圖；M為預染蛋白Marker；1為純化後的單鏈抗體。
圖6為單鏈抗體對豬傳染性胃腸炎病毒的體外中和效果。
具體實施方式
實施例中各步驟採用的實驗材料均為正規公司獲得的標準材料,所用方法均為標準試劑盒產品說明書所述方法(見相應的實施例),各步驟獲得的中間產品及最後的終產品均經過多次試驗證明可以重複獲得,其生物學性質保持穩定一致。說明本發明各試驗步驟所涉及的中間產品和終產品均可以按照本發明所陳述的發法準確獲得。
實施例1豬源性抗傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的製備
1：對養殖場出現腹瀉症狀的仔豬進行豬傳染性胃腸炎病毒抗原檢測(陽性抗原系本實驗室保存的TGEV毒株)，用常規(參照F.M.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》)ELISA法檢測血清抗體效價大於1:20000時，採集該豬血液，裂解紅細胞後獲得白細胞(紅細胞裂解液上海碧雲天生物技術有限公司)，用Trizol法(TRIZOL Reagent購自美國Invitrogen公司)提取總RNA。以提取的總RNA為模版，採用Oligo primer，根據反轉錄試劑盒(cDNA第1鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司)的產品說明操作步驟，合成第1鏈cDNA。
2：對GenBank已公布的豬抗體編碼基因重鏈可變區序列(AF064686.1；AF064687.1；AF064688.1；AF064689.1；AF064690.1)和輕鏈可變區序列(KF561242.1；GQ867594.1；GQ867595.1)設計擴增抗體輕、重鏈的引物(表1)，其中VH1F分別與VH1R、VH2R用於擴增VH區；VL1F、VL2F、VL3F和VL1R用於擴增VL區；VH3F、VH3R用於VH基因加入酶切位點和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F擴增的VL基因基礎上加入酶切位點，VL2R用於VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位點，VL 2R含有Not I酶切位點；VH3R、VL4F、VL5F、VL6F含互補的Linker序列(酶切位點和Linker序列在表1中用下劃線標示出)。Linker採用(GGGGS)3，其對應的編碼核苷酸序列為：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表1 擴增抗體可變區的引物及其擴增片段大小
註：下劃線代表Sfi I或Not I酶切位點，方框代表連接肽序列。
3：VH和VL基因的擴增
以cDNA為模版，VH1F、VH1R為引物擴增VH基因。引物VL1F、VL2F、VL3F分別與引物VL1R配對，擴增VL基因。PCR反應體系為25μL：2×PCR mix12.5μL，模版cDNA 2μL，上下遊引物(25μM)各1μL，ddH2O 8.5μL。擴增程序如下：95℃預變性3min；94℃變性40s，50℃退火40s，72延伸1min，30個循環；最後72℃延伸10min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑑定產物並回收目的基因(根據Thermo公司提供的膠回收說明書操作)。
4：ScFv基因的獲得
分別以VH和VL基因為模板，VH2F、VH2R為引物PCR擴增帶有Linker的重鏈可變區基因，VH4F、VL5F、VL 6F分別與VL2R配對，PCR擴增帶有Linker的輕鏈可變區基因，PCR條件同上。擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑑定後回收目的基因(含有Linker序列的VH和VL基因)。以VH2 F、VL 2R為引物，通過重組鏈延伸反應(SOE-PCR)將含有Linker序列的VH和VL基因連接為ScFv基因，並加入Sfi I和Not I酶切位點，VH-Linker-VL擴增產物大小為714bp(見圖1)。
5：豬源性ScFv噬菌體原始文庫的構建
根據常規分子克隆方法(參照J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實驗指南》)，ScFv基因和pCANTAB-5e載體分別經Sfi I和Not I雙酶切後，瓊脂糖凝膠電泳並用凝膠回收試劑盒回收酶切產物(見圖2)。將ScFv基因插入pCANTAB-5e載體(北京普如汀生物技術有限公司)，構建重組表達質粒(見圖3)，並將其電轉化E.coliTG1感受態細胞(北京普如汀生物技術有限公司)，連續電轉化50次，構建豬源性ScFv噬菌體原始文庫。挑取單克隆菌落PCR驗證其陽性率，菌落PCR驗證正確的克隆進行測序分析來確定文庫的多樣性(見圖4)。
6：ScFv的富集篩選
取密度梯度離心獲得的高濃度豬傳染性胃腸炎病毒(本實驗室保存)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氫鈉鹽溶液，pH＝9.6)稀釋至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4℃包被過夜；每孔加入5％脫脂奶粉溶液200μL，37℃封閉1h，PBS洗滌3次；每孔加入100μL噬菌體ScFv原始文庫，37℃孵育2h，PBS洗滌10次；每孔加入洗脫緩衝液(Gly-HCl pH＝2.2)100μL洗脫，再加入50μL(Tris-HCl pH＝9.0)進行中和。將部分洗脫的噬菌體感染對數生長期的大腸桿菌TG1，測定第一輪的捕獲的噬菌體滴度，其餘洗脫的噬菌體進行第二輪富集篩選；捕獲的噬菌體滴度需要達到106cfu/mL；挑取最後一輪淘選的單菌落，即為抗豬傳染性胃腸炎病毒的陽性ScFv菌落。
7：ScFv的誘導表達
挑取陽性ScFv菌落至含氨苄抗生素(終濃度為100μM)和葡萄糖(終濃度為(2M)的2YT液體培養基中，37℃振搖培養，菌液OD600至0.6時感染輔助噬菌體M13KO7(北京普如汀生物技術有限公司)。12h後離心，吸取上清，即為陽性ScFv的噬菌體。陽性ScFv的噬菌體感染對數生長期的HB2151菌液(北京普如汀生物技術有限公司)，培養至菌液OD600為0.6。將菌液分為兩份，分別為誘導組、和非誘導組。誘導組在菌液中加入IPTG(終濃度100μM)，於30℃誘導過夜，離心收集菌液。用PBS懸浮菌液，超聲波裂解，離心後收集上清。採用Ni-NTA his band Rasin純化ScFv，純化過程參照默克公司的《pET System Manual》。純化後的樣品進行SDS-PAGE電泳(見圖5)。
實施例2抗原特異性ScFv的間接ELISA篩選
取超速離心濃縮的豬傳染性胃腸炎病毒(本實驗室保存)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氫鈉鹽溶液，pH＝9.6)稀釋至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4包被過夜；每孔加入5％脫脂奶粉溶液200μL，37封閉1h，PBS洗滌3次；將純化蛋白的上清50μL與4％脫脂奶粉溶液50μL混勻後加入上述孔中，37℃孵育2h，PBST洗滌3次；加入E-Tag Mouse mAb(E-tag標籤鼠單克隆抗體購自RayBiotech公司)100μL(1:2000)，37℃反應2h，PBST洗滌3次；加入過氧化氫標記的羊抗鼠IgG二抗(購自美國Invitrogen公司)1000μL(1:4000)，37℃反應1h，PBST洗滌3次；TMB顯色15min，2mol/L硫酸終止反應，酶標儀(美國Thermo公司讀取OD450處吸光值，將設未誘導菌液上清為表達陰性對照。以P/N(P為陽性孔的OD450值，N為陰性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1為陽性；1.5≤P/N＜2.1為可疑；P/N＜1.5為陰性。陽性克隆經3次重複性試驗驗證，同時設豬傳染性胃腸炎病毒、豬沙門菌、豬產腸毒素大腸桿菌作為對照，驗證ScFv的特異性。結果證明單鏈抗體A能夠特異性的識別豬傳染性胃腸炎病毒，但不與豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌、豬產腸毒素大腸桿菌發生交叉免疫反應。
實施例3
對獲得的單鏈抗體編碼基因進行測序，證明其由747個核苷酸及據此推測的249個胺基酸組成，所述核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述胺基酸序列如SEQ ID No.3所示。
實施例4
檢測單鏈抗體對豬傳染性胃腸炎病毒的中和活性分析(見表1)。首先採用Reed-Muench方法檢測TGEV感染PK15細胞的TCID50。TCID50的測定在96孔中進行，將5×105個/孔Vero細胞接種到96孔細胞培養板，37℃、5％CO2細胞培養箱中培養至細胞密度為80％；在1.5mL Eppendorf管中將病毒液分別從10-1到10-10作連續10倍梯度稀釋；以無血清培養基洗滌細胞3次後將稀釋好的病毒液分別入96孔板中，每一個稀釋梯度接種一個縱排，每孔加入100μL病毒稀釋液，最後一孔加入空白培養基做為陰性對照；37℃培養1h後，每孔補加一滴含10％胎牛血清的DMEM培養基；放置於37℃細胞培養箱中培養，逐日觀察細胞病變情況，結果按照Reed-Muench法計算。公式如下：
距離比例＝(高於50％病變率的百分數-50％)/(高於50％病變率的百分數-低於50％病變率的百分數)
lgTCID50＝距離比例×稀釋度對數之間的差+高於50％病變率的稀釋度的對數
然後測定單鏈抗體的體外中和活性，分為三組。單鏈抗體處理組，將100μL純化的單鏈抗體(100ng/μL)與100μL 1MOI病毒混合，預先作用30min，然後感染細胞；無關單鏈抗體處理組(證實不與TGEV結合的單鏈抗體)，將100μL純化的所述單鏈抗體(100ng/μL)與100μL 1MOI病毒混合，預先作用30min，然後感染細胞；病毒處理組，將100μL PBS與1MOI病毒混合，預先作用30min，然後感染細胞；每組三個重複，分別在感染後6、12、18、24、30、36h收集細胞上清，測定病毒滴度，分析單鏈抗體的中和效果(見圖6)。從結果可以看出，TGEV感染後18-36h，單鏈抗體處理組的病毒滴度顯著低於PBS和陰性ScFv處理組(P<0.05)，說明ScFv具有中和病毒的活性。統計方法使用Student’s T test。