一種羊肚菌菌種鑑定方法
2024-02-26 08:29:15 2
專利名稱：一種羊肚菌菌種鑑定方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，涉及一種羊肚菌菌種的鑑定方法。
背景技術：
羊肚菌是羊肚菌屬(Mordwlla)真菌的統稱，全世界已報導50餘種，中國已報導 10餘種(關於羊肚菌屬物種的界定，不同學者之間分歧較大，有些學者僅承認羊肚菌屬的 3 6個物種名稱)，它們全都是具有重要食用和藥用價值的珍稀經濟真菌。羊肚菌菌種是指生活於一定培養基上的羊肚菌菌絲體，是重要的生物資源，也是相關科研、教學上的重要材料。對羊肚菌的利用主要有兩種途徑。其一是利用羊肚菌的子實體，目前市場上的羊肚菌子實體主要來源於野外採集，因貨源稀少，價格一直很高，國內市場價一般穩定在每公斤400 500元，國際市場價高達每公斤200美元左右。利用羊肚菌菌種通過人工栽培的方法生產其子實體，是百餘年來真菌學家和食用菌栽培者竭力探索的課題之一，並且，國內外均有通過人工栽培生產出羊肚菌子實體的報導，但迄今未實現羊肚菌的商品化人工栽培。 已報導的羊肚菌人工栽培技術都停留在子實體偶然產生且產量很低的水平，距商品化生產還有相當大的差距。目前，在許多地方，關於羊肚菌人工栽培的探索仍在進行中。對羊肚菌開發利用的另一條途徑是利用羊肚菌菌種通過工業發酵的方法生產菌絲體產品。國外從上世紀六十年代已開始商業化生產羊肚菌菌絲體作為調味品。無論是從事羊肚菌人工栽培探索等方面的科學研究，還是開展羊肚菌的工業發酵生產，都需要利用羊肚菌菌種。對羊肚菌菌種進行真偽鑑定，判別其是否真的是羊肚菌菌種，是相關科研、生產和菌種保藏單位的一項重要工作。羊肚菌是一種能產生大型子實體的真菌，屬於大型真菌範疇，關於大型真菌的菌種鑑定，傳統的方法是通過人工栽培使其產生子實體，然後依據子實體的特徵進行鑑定。由於羊肚菌在人工栽培的條件下基本不產生子實體，只是很個別的單位在很偶然的情況下培養出過羊肚菌子實體，這使得依據子實體特徵對羊肚菌菌種進行鑑定的方法很難實現。對於從事羊肚菌研究來講，若應用的菌種是假的，其研究結果就不可能正確，這也是長期以來羊肚菌研究未取得明顯進展的重要原因之一。對於從事羊肚菌菌絲體發酵生產的單位來講，若應用的菌種是假的，還存在著造成嚴重危險的可能。分子生物學技術的發展使得人們可以利用真菌的菌絲體測出其特定的DNA序列， 然後依據其特定DNA序列進行羊肚菌等真菌的菌種鑑定。但這種基於分子生物學技術的鑑定，需要比較昂貴的儀器設備和專業的科技人員，花費的資金也較多，許多單位尚無法開展。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於菌絲體形態特徵的羊肚菌菌種鑑定方法，克服以上所述兩類羊肚菌菌種鑑定方法的缺點，實現在簡易條件下對羊肚菌菌種的快速鑑定。
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本發明的目的是通過如下技術方案實現的先觀察待鑑定菌種的培養基表面菌絲，若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，可初步判斷該菌種是羊肚菌菌種，再進一步觀察其基內菌絲，若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。具體步驟如下
(1)在一個培養皿中並列放兩塊載玻片(兩塊載玻片之間留間隙)，將融化並冷卻至 45 50°C的PDA培養基傾倒在載玻片上，在每塊載玻片上都製成厚度約2 3mm的平板培養基；用接種針從待鑑定菌種的菌落上取菌絲體分別接種到每塊平板培養基的中部，蓋上培養皿的蓋，將其置於18 20°C的培養箱中培養；當待鑑定菌種在上述平板培養基上長出的新菌落半徑達1 1. 5cm時，即可用於以下步驟的鑑定；
(2)將步驟(1)所述培養皿中的一塊承載有待鑑定菌種菌落的載玻片取出，用擦鏡紙將載玻片下面(無培養基的一面)擦淨，在菌落邊緣處滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用吸水紙從蓋玻片邊緣吸去多餘的水；
(3)將經上述經步驟(2)處理的載玻片置顯微鏡下觀察，以培養基表面菌絲的形態特徵作為判斷是否為羊肚菌的重要依據，若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，可初步判斷該菌種為羊肚菌菌種；所述羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵是菌絲有明顯的主幹，作為主幹的菌絲較長，挺直，粗細比較均勻，隔膜較少，兩側生分枝；從主幹上生出的分枝有兩類，其中一類在很短的距離內多次分枝，呈聚集的樹枝狀，這些構成聚集樹枝狀分枝的小枝都較短，粗細不均勻，也不直；從主幹上生出的另一類分枝與主幹形態相似，可稱為次級主幹；次級主幹上的分枝特性與主幹相似，即可產生兩類分枝，其中一類為再次一級的主幹，另一類在很短的距離內多次分枝，呈聚集的樹枝狀；各級主幹上雖可產生次級主幹，但產生的次級主幹數較少，產生的大多數分枝是短小且在很短的距離內多次分枝的聚集樹枝狀分枝(見圖1 一圖3)；
(4 )將步驟(1)所述培養皿中的另一塊承載有待鑑定菌種菌落的載玻片取出，在有菌落的地方切取大小約為0. 3X0. 3cm的培養基小塊，並用刀片切去該培養基小塊表面厚約 Imm的部分(即切掉表面著生有菌落的一層培養基)；
(5)將步驟(4)所述切掉了表面的培養基小塊切成厚約1 2 mm的薄片(切面與平板培養基的表面平行)，將切成的培養基薄片置於載玻片上的水滴中，蓋上蓋玻片，並按壓蓋玻片將培養基薄片擠壓成一薄層，然後將載玻片置顯微鏡下觀察，觀察到的菌絲即是基內菌絲。若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。羊肚菌的基內菌絲是由該菌培養基表面菌絲上呈聚集樹枝狀分枝的頂端向培養基內部生長形成的，具有以下形態特徵菌絲粗細不勻，不直，顏色比羊肚菌的培養基表面菌絲色淺，分枝多且不規律；總的來看，羊肚菌的基內菌絲與培養基表面的菌絲有很明顯的差異。總之，若經過以上步驟，觀察到的培養基表面菌絲和基內菌絲分別具有羊肚菌培養基表面菌絲和基內菌絲的特徵，即可判定該菌種是羊肚菌菌種；若經過以上步驟，觀察到的培養基表面菌絲不具有羊肚菌培養基表面菌絲的形態特徵，或者觀察到的基內菌絲不具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定所鑑定的菌種不是羊肚菌菌種。本發明的優點是操作簡單，不需要特的殊儀器和設備，成本低，鑑定結果容易判斷，且鑑定結果較為可靠。
圖1 3為羊肚菌的培養基表面菌絲； 圖4 6為非羊肚菌的培養基表面菌絲。
具體實施例方式本發明的羊肚菌菌種鑑定方法，具體步驟如下
(1)在一個培養皿中並列放兩塊載玻片(兩塊載玻片之間留有間隙)，將融化並冷卻至 45 50°C的PDA培養基傾倒在載玻片上，在每塊載玻片上都製成厚度約2 3mm的平板培養基；用接種針從待鑑定菌種的菌落上取菌絲體分別接種到每塊平板培養基的中部；蓋上培養皿的蓋，將其置於18 20°C的培養箱中培養；當待鑑定菌種在上述平板培養基上長出的新菌落半徑達1 1. 5cm時，即可用於以下步驟的鑑定；
(2)將步驟(1)所述培養皿中的一塊承載有待鑑定菌種菌落的的載玻片取出，用擦鏡紙將載玻片下面(無培養基的一面)擦淨，在菌落邊緣處滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用吸水紙從蓋玻片邊緣吸去多餘的水；
(3)將上述載玻片置顯微鏡下觀察，以培養基表面菌絲的形態特徵作為判斷是否為羊肚菌的重要依據；若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的形態特徵(如圖1 3所示)，可初步判斷該菌種為羊肚菌菌種。羊肚菌培養基表面菌絲的形態特徵是 菌絲有明顯的主幹，作為主幹的菌絲較長，挺直，粗細比較均勻，隔膜較少，兩側生分枝；從主幹上生出的分枝有兩類，其中一類在很短的距離內多次分枝，呈聚集的樹枝狀，這些構成聚集樹枝狀分枝的小枝都較短、粗細不均勻，也不直；從主幹上生出的另一類分枝與主幹形態相似，可稱為次級主幹。次級主幹上的分枝特性與主幹相似，即可產生兩類分枝，其中一類為再次一級的主幹，另一類在很短的距離內多次分枝，呈聚集的樹枝狀。各級主幹上雖可產生次級主幹，但產生的次級主幹數較少，產生的大多數分枝是短小且在很短的距離內多次分枝的聚集樹枝狀分枝；
(4 )將步驟(1)所述培養皿中的另一塊承載有待鑑定菌種菌落的的載玻片取出，在有菌落的地方切取大小約為0. 3X0. 3cm的培養基小塊，並用刀片切去該培養基小塊表面厚約Imm的部分(即切掉表面著生有菌落的一層培養基)；
(5)將上述切掉了表面的培養基小塊切成厚約1 2mm的薄片(切面與平板培養基的表面平行)，將切成的培養基薄片置於載玻片上的水滴中，蓋上蓋玻片，並按壓蓋玻片將培養基薄片擠壓成一薄層，然後將載玻片置顯微鏡下觀察，觀察到的菌絲即是基內菌絲；若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。羊肚菌基內菌絲的形態特徵如下菌絲粗細不勻，不直，顏色比羊肚菌在培養基表面的菌絲色淺，分枝多且不規律。總的來看，羊肚菌的基內菌絲與培養基表面的菌絲有很明顯的差異。 羊肚菌的基內菌絲是由羊肚菌的培養基表面菌絲上呈聚集樹枝狀分枝的頂端向培養基內部生長形成的。若經過以上步驟，觀察到的培養基表面菌絲不具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，或者觀察到的基內菌絲不具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定所鑑定的菌種不是羊肚菌菌種。用本發明的方法和基於rDNA內轉錄間隔區(ITS)序列的分子鑑定方法(對照)分別對包括有羊肚菌菌種的近百個菌種材料進行了鑑定試驗，試驗證實，兩種鑑定結果完全一致。見下表
本發明的鑑定方法與分子鑑定法的鑑定結果對比
權利要求
1.一種羊肚菌菌種鑑定方法，其特徵在於，先觀察待鑑定菌種在培養基表面的菌絲，若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，可初步判斷該菌種是羊肚菌菌種，再進一步觀察其基內菌絲，若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。
2.根據權利要求1所述的羊肚菌菌種鑑定方法，其特徵在於，具體步驟如下(1)在一個培養皿中並列放兩塊載玻片，將融化並冷卻至45 50°C的PDA培養基傾倒在載玻片上，在每塊載玻片上都製成厚度約2 3mm的平板培養基；用接種針從待鑑定菌種的菌落上取菌絲體分別接種到每塊平板培養基的中部；蓋上培養皿的蓋，將其置於18 20°C的培養箱中培養；當待鑑定菌種在上述平板培養基上長出的新菌落半徑達1 1. 5cm 時，可用於以下步驟的鑑定；(2)將步驟(1)所述培養皿中的一塊承載有待鑑定菌種菌落的載玻片取出，用擦鏡紙將載玻片下面擦淨，在菌落邊緣處滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，用吸水紙從蓋玻片邊緣吸去多餘的水；(3)將上述經步驟(2)處理的載玻片置顯微鏡下觀察培養基表面的菌絲，若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，可初步判斷該菌種為羊肚菌菌種；(4 )將步驟(1)所述培養皿中的另一塊承載有待鑑定菌種菌落的的載玻片取出，在有菌落的地方切取大小約0. 3cmX0. 3cm的培養基小塊，並切去該培養基小塊表面厚約Imm的部分；(5)將步驟(4)所述切掉了表面的培養基小塊切成厚約1 2 mm的薄片(切面與平板培養基的表面平行)，將切成的培養基薄片置於載玻片上的水滴中，蓋上蓋玻片，並按壓蓋玻片將培養基薄片擠壓成一薄層，然後將載玻片置顯微鏡下觀察，觀察到的菌絲即是基內菌絲，若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。
3.根據權利要求1或2所述的羊肚菌菌種鑑定方法，其特徵在於，所述羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵是菌絲有明顯的主幹，作為主幹的菌絲較長，挺直，粗細比較均勻， 隔膜較少，兩側生分枝；從主幹上生出的分枝有兩類，其中一類在很短的距離內多次分枝， 呈聚集的樹枝狀，這些構成聚集樹枝狀分枝的小枝都較短，粗細不均勻，也不直；從主幹上生出的另一類分枝與主幹形態相似，可稱為次級主幹；次級主幹上的分枝特性與主幹相似， 即可產生兩類分枝，其中一類為再次一級的主幹，另一類在很短的距離內多次分枝，呈聚集的樹枝狀；各級主幹上雖可產生次級主幹，但產生的次級主幹數較少，產生的大多數分枝是短小且在很短的距離內多次分枝的聚集樹枝狀分枝。
4.根據權利要求1或2所述的羊肚菌菌種鑑定方法，其特徵在於，所述羊肚菌基內菌絲的形態特徵是菌絲粗細不勻，不直，顏色比羊肚菌的培養基表面菌絲色淺，分枝多且不規律，羊肚菌的基內菌絲是由羊肚菌的培養基表面菌絲上呈聚集樹枝狀分枝的頂端向培養基內部生長形成的。
全文摘要
本發明屬於微生物技術領域,涉及一種羊肚菌菌種的鑑定方法。本發明的方法是先觀察待鑑定菌種在培養基表面的菌絲，若觀察到的培養基表面菌絲具有羊肚菌培養基表面菌絲的典型形態特徵，可初步判斷該菌種是羊肚菌菌種，再進一步觀察其基內菌絲，若觀察到的基內菌絲具有羊肚菌基內菌絲的形態特徵，即可判定該菌種就是羊肚菌菌種。本發明的羊肚菌菌種鑑定方法操作簡單，不需要特殊的儀器和設備，成本低，鑑定結果容易判斷，且鑑定結果可靠。
文檔編號C12Q1/04GK102242183SQ201110162490
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者侯軍, 張華 , 張洋, 林曉民, 王少先 申請人:河南科技大學