一種與植物器官脫落相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2024-01-21 11:55:15 1

專利名稱：：一種與植物器官脫落相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種與植物器官脫落相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：對作物收割的基礎是果實不脫落，因此器官脫落可以說是人類在農業發展史上所利用的第一個性狀。儘管作物的器官脫落性狀經過了幾千年的選擇，但在某些具體作物如部分品種的油菜和棉花中，還存在由於過早脫落引起產量損失的問題。與植物的脫落過程相關的自然因素有衰老、光、乾旱等環境脅迫。植物激素乙烯和生長素在脫落過程中發揮調節作用。根據離區細胞的發育狀態，擬南芥花器官脫落過程可以分為四個階段離區的分化形成，脫落信號的轉導，下遊細胞壁水解酶活性激活和細胞分離，以及最後的脫落後離區形成保護層。
發明內容本發明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發明的基因來源於擬南芥，序列長741bp，編碼一個含有247個胺基酸的蛋白序列，分子量為27KD。本發明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物器官脫落相關的由a)衍生的蛋白質。所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。為了使上述(a)中的蛋白便於純化，可在由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列tableseeoriginaldocumentpage3tableseeoriginaldocumentpage4上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得至|J。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。所述引物對為一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述蛋白在調節植物器官脫落中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述編碼基因在調節植物器官脫落中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述應用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。本發明的另一個目的是提供一種使植物器官脫落期延遲的方法。本發明所提供的使植物器官脫落期延遲的方法，包括如下步驟向宿主植物中導入上述任一所述編碼基因，得到器官脫落期延遲於所述宿主植物的重組植物。上述方法中，所述宿主植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。實驗證明，將本發明的編碼基因通過農桿菌轉化導入擬南芥植株中後，轉基因擬南芥中本發明基因及蛋白超表達，該超表達非常明顯地抑制了擬南芥器官脫落。此外，通過對本發明基因的亞細胞定位，表明本發明基因通過調節細胞壁間水解酶活性控制植物器官脫落過程。本發明基因可以控制植物器官脫落進程而不引起其他生理活動的改變，在作物遺傳育種和品質改良中有非常廣泛的應用前景。圖1為AtD0F4.7基因在野生型和兩個獨立的超表達轉基因株系中的表達水平。圖2為超表達AtD0F4.7植物的花器官脫落推遲。圖3為AtD0F4.7抑制PGAZAT啟動子的活性。圖4為轉基因植株與對照植株表型。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、基因的製備及確認與功能一、基因的製備及確認M-MLV兩步法RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，產品目錄號為D2639S。PMD-18T_easy載體購自TaKaRa，產品目錄號為D101A。用M-MLV兩步法RT-PCR試劑盒進行RT-PCR，以野生型擬南芥花器官為實驗材料，提取其組織總RNA，反轉錄為cDNA，反轉錄體系如下tableseeoriginaldocumentpage570°C水浴保溫5min，水上放置2min，離心，將管內液體收集至管底。在冰上依次加入以下試劑5XRTBuffer5.0μ150U/μ1RNasin0.5μ11mraol/1dNTPs5.0μ1200U/1M-MLVRT1.0μ1Total25.0μ1混勻，離心，將管內液體收集至管底，在GeneAmp9700PCR儀中，進行如下反應370C90min,95°C5min。反應完成後取出2μ1用於PCR擴增。以此cDNA為模板，以下述引物1和2(在引物序列中引入EcoRl和BstEII酶切位點)進行PCR擴增，用pfu酶擴增。引物序列如下上遊CTGGAATTCATGATGACGTCATCCCATCAG(序列3)，引入EcoRI酶切位點，下遊GCGGGTAACCTTAGAGCAGAGCATTATTATTAGCA(序列4)，引入BstEII酶切位點。將PCR擴增產物進行電泳，結果顯示擴增得到的片段為752bp。將PCR擴增產物加PolyA尾巴後連接到PMD-lST-easy載體上，將重組載體轉化大腸桿菌，Amp抗性篩選，得到陽性重組菌；提取陽性重組菌的質粒，測序驗證，測序結果如序列表中序列2所示，將序列2所示基因命名為AtD0F4.7，該基因編碼的蛋白如序列表中序列1所示。二、基因的功能(一)轉基因擬南芥的構建pCAMBIA1391質粒(張勇，付紹紅，張汝全，牛應澤.甘藍型油菜PEPC基因保守序列的克隆和種子特異性ihpRNA表達載體的構建.2008.分子植物育種.第6卷，第4期，第775-780頁)(pCambia,Austria)(由中國農業大學提供)。農桿菌菌株GV3101(HolstersΜ,SilvaB,VanVlietF,GenetelloC,DeBlockΜ,DhaeseP,DepickerA,InzD,EnglerG,VillarroelR,VanMontaguM,SchellJ(1980)ThefunctionalorganizationofthenopalineA.tumefaciensplasmidpTiC58.Plasmid3=212-230)(由中國農業大學提供)。將實驗一中得到的陽性質粒用EcoRI/BstEII雙酶切，回收基因片段；用EcoRI/BstEII雙酶切pCAMBIA1391載體，回收載體大片段；將回收的載體大片段與基因片段連接，得到重組載體，記作pCAMBIA1391-35s::AtD0F4.7。將pCAMBIA1391-35s::AtD0F4.7質粒通過CaCl2介導轉化農桿菌GV3101，通過抗生素Rif和Kan篩選，得到陽性克隆，將陽性克隆進行PCR鑑定，PCR鑑定的引物為序列3和序列4。結果PCR擴增產物大小為750bp。表明構建的重組農桿菌正確。將陽性重組農桿菌，用flowerdip法轉化擬南芥，收取TO代種子；將TO代種子播種，在添加25mg/LHyg的MS培養基上篩選抗性苗，獲得Tl代種子。選取Hyg抗性31分離的株系繁殖並收穫T3種子，選取表達水平不同的兩個株系用於後續研究，並命名為S107和S109。以轉入空載體pCAMBIA1391的擬南芥為對照。(二)轉基因擬南芥的鑑定以4周齡的S107、S109和轉入空載體pCAMBIA1391的擬南芥的花器官為材料，提取總RNA並反轉錄為cDNA。以110稀釋cDNA為模板，分別以下列引物為探針，按Takara公司定量PCR試劑盒體系擴增，檢測溶解峰和擴增效率後，以Actin2基因為內參基因，ΔACt算法計算AtD0F4.7在轉基因植株中的超表達水平ACTIN2上遊5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，ACTIN2下遊5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，D0F47上遊CTCGTGAGCTTGTAAGAAACCA(序列5)D0F47下遊GAGGCAAGGTTGAAGTTAGGAT(序列6)程序如下，94°C5min，94°C5min，94°C10s，63°C10s，72°C20s，40個循環，溶解檢測從72°C到94°C。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。結果顯示AtD0F4.7基因在轉入空載體pCAMBIA1391的擬南芥的花器官中表達量很低，而在轉基因S107、S109中表達量非常高，表明AtD0F4.7基因在轉基因株系中超表達，構建的轉基因株系正確。(三)轉基因植株的表型分析由於在模式植物擬南芥中，只有一個器官，也就是花器官具有脫落性狀，所以本實驗對不同位置的花器官的脫落狀況進行具體的分析。這裡，為了便於描述，將以剛剛張開的花為第一位，按花序順序依次向下排序命名不同位置的花或果實，具體與文獻(ButenkoMA,PattersonSE,GriniΡΕ,StenvikG-E,AmundsenSS,MandalA,AalenRB(2003)INFLORESCENCEDEFICIENTINABSCISSIONControlsFloralOrganAbscissioninArabidopsisandIdentifiesaNovelFamilyofPutativeLigandsinPlants.PlantCell152296-2307)中所述一致。結果如圖2所示和圖4(圖2中，A表示轉入空載體的擬南芥的花器官脫落狀況，B表示超表達植株的花器官脫離狀況；2、4、6、…20表示不同花位的器官脫落情況)。結果顯示對照組的花器官在第8位基本脫落了，但是在S107和S109中花器官的脫落基本觀察不到，甚至直到角果變黃成熟乾燥後，花器官都不會自然脫落，表明超表達植株中花器官脫落明顯推遲了。圖4顯示，轉基因擬南芥與對照擬南芥表型無差異，說明轉入本發明基因，不改變植物其它的生理過程(如形態)。實驗設3次重複，結果均一致。三、AtD0F4.7通過抑制離區細胞壁水解酶活性調節脫落為了尋找AtD0F4.7影響脫落過程的可能線索，本實驗檢測目前已知的大多數脫落相關基因在S107和S109兩超表達植株中的表達情況。結果，大多數的脫落相關基因的表達並不受AtD0F4.7超表達的影響，只有一個多聚半乳糖醛酸酶基因PGAZAT的表達受到明顯的抑制。PGAZAT基因是目前已知的唯一的在擬南芥花器官脫落過程中起作用的細胞壁水解酶類基因，AtD0F4.7基因超表達可能通過了抑制PGAZAT的表達從而提高了脫落的難度。為了進一步明確AtD0F4.7基因的作用，本實驗利用懸浮細胞瞬時轉化為基礎的轉錄因子——啟動子作用快速檢測體系，檢測了AtD0F4.7基因過表達對PGAZAT表達的作用。在只轉入輔助菌株P19和作用因子35s::AtD0F4.7的對照中，檢測不到⑶S活性，當同時轉入作用因子35s::AtD0F4.7和報告子PromoterPGAZAT:GUS時，GUS的活性約為僅轉入報告子PromoterPGAZAT⑶S樣品的1/3，這說明AtD0F4.7可以明顯的抑制PGAZAT的表達。而轉入作用因子35s::AtD0F4.7並不影響作為陽性對照的報告子35s:⑶S樣品中的⑶S活性(圖3)。這進一步說明AtD0F4.7對PGAZAT的表達是以特異的方式進行的。權利要求一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物器官脫落相關的由a)衍生的蛋白質。2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。4.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5.根據權利要求4所述的引物對，其特徵在於所述引物中一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。6.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。7.權利要求1所述蛋白和/或權利要求2或3所述編碼基因在調節植物器官脫落中的應用。8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。9.一種使植物器官脫落期延遲的方法，包括如下步驟向宿主植物中導入權利要求2或3所述編碼基因，得到器官脫落期延遲於所述宿主植物的重組植物。10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述宿主植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥；所述器官為花。全文摘要本發明涉及一種與植物器官脫落相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列1所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且編碼所述蛋白的由a)衍生的蛋白質。該基因及其作用機制可以廣泛的應用於作物改良過程，特別是棉花和油菜的品質改良中。本發明基因可以控制植物器官脫落進程而不引起其他生理活動的改變，在作物遺傳育種和品質改良中有非常廣泛的應用前景。文檔編號C12N15/63GK101805400SQ201010155878公開日2010年8月18日申請日期2010年4月21日優先權日2010年4月21日發明者張秀清,王學臣,魏鵬程申請人:中國農業大學