抗PD1和CD20雙特異性抗體及其應用的製作方法

2023-12-02 05:50:56

本發明屬於抗體藥物開發和生產領域，涉及抗pd-1和cd20的雙特異性抗體及其應用。本發明提供了特異性識別和結合pd-1和cd20的雙特異性抗體或其功能性片段，還提供了編碼所述的雙特異性抗體或其功能性片段的核酸分子、用於表達所述雙特異性抗體或其功能性片段的表達載體和宿主細胞和它們在製備治療癌症的藥物中的應用，以及所述雙特異性抗體或其功能性片段的製備方法。
背景技術：
：cd20分子是b細胞表面特有的標誌物，絕大多數非霍奇金淋巴瘤都是具有cd20的b細胞，但在幹細胞、祖b細胞、正常漿細胞或其他正常組織中均不表達cd20分子。因此，cd20分子是用單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤的一個重要的藥物靶點。抗cd20單克隆抗體利妥昔單抗(rituximab，美羅華)是人鼠嵌合抗體，其廣泛用於b細胞淋巴瘤的治療。利妥昔單抗首先應用於nhl的治療，單藥治療166例復發或難治的nhl患者，總有效率為48％，完全緩解率為6％，部分緩解率為42％。第三代抗cd20治療性單抗目前還未上市，包括ocaratuzumab(ame-133v)、pro131921、obinutuzumab(ga101)等。在一項ⅱ期臨床實驗中，對44名接受初始利妥昔單抗治療後復發的fl患者用ocaratuzumab治療，每周4次，共注射375mg/m2，總體反應率僅為36％。同時，在腫瘤患者中，由於pd-1/pd-l1通路所造成免疫抑制等原因，機體對腫瘤細胞的免疫應答通常是無效的。阻斷pd-1/pd-l1信號通路可以逆轉腫瘤免疫微環境，恢復t細胞的抗腫瘤活性，從而增強內源性抗腫瘤免疫效應。阻斷抑制通路的pd-1及pd-l1的抗體可競爭性地與pd-1和pd-l1結合，進而阻斷pd-1/pd-l1信號通路，使t細胞免疫應答增強，行使殺傷腫瘤細胞的功能。近幾年來，研究人員已開發了多個抗pd-1和pd-l1單抗類免疫檢查點抑制劑，這些藥物有力地促進了癌症免疫治療的進展。儘管抗pd-1抗體及抗pd-li抗體對某些癌症已經顯現出了較好的臨床效果，但令人遺憾的是，這些抗體並不是對所有的患者都有效。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是設計並構建一種抗pd-1和抗cd20的雙特異性抗體，並使其具有足夠的靶向性和生物活性。更重要的是，該雙特異性抗體具有全人源序列，有效地避免了臨床治療應用中hama的發生，從而能夠更有效地減少了耐藥現象的發生，提高了藥物的利用效率和治療效果。本發明提供新的pd-1/cd20雙特異性抗體融合蛋白具有針對第一目的抗原的第一特異性和針對第二目的抗原的第二特異性，其具有對於兩種不同受體的結合特異性，同時本發明還涉及該雙特異性抗體融合蛋白的生產方法、該融合蛋白的藥物用途和使用該融合蛋白的治療方法。本發明用於解決上述技術問題的技術方案如下：一種抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段，其包括：a.特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域，其包括抗pd-1特異性抗體的重鏈可變區(抗pd-1vh)；以及b.特異性識別和結合cd20的結構域，其包括抗cd20特異性抗體的重鏈可變區(抗cd20vh)。優選地，所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(抗pd-1vl)、重鏈可變區(抗pd-1vh)、鉸鏈區和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成，或由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成，或由兩組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成，或由抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(抗pd-1vl)和重鏈可變區(抗pd-1vh)組成。優選地，所述特異性識別和結合cd20的結構域由依次連接的抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)、重鏈可變區(抗cd20vh)、鉸鏈區和fc片段(抗cd20ch2-ch3)組成，或由一組抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗cd20vl-cl)和重鏈(抗cd20vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成，或由兩組抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗cd20vl-cl)和重鏈(抗cd20vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成，或由抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)和重鏈可變區(抗cd20vh)組成。根據本發明的一個優選的實施方案，所述抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a』.特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域，其由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成；以及b』.特異性識別和結合cd20的結構域，其由一組抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗cd20vl-cl)和重鏈(抗cd20vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成。優選地，所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域與所述特異性識別和結合cd20的結構域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位於鉸鏈區的二硫鍵連接。根據本發明的一個優選的實施方案，所述抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a」.特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域，其由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成；以及b」.特異性識別和結合cd20的結構域，其由依次連接的抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)、重鏈可變區(抗cd20vh)、鉸鏈區和fc片段(抗cd20ch2-ch3)組成。優選地，所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域與所述特異性識別和結合cd20的結構域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位於鉸鏈區的二硫鍵連接。根據本發明的一個優選的實施方案，所述抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a」』.特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域，其由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(抗pd-1vl)、重鏈可變區(抗pd-1vh)、鉸鏈區和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成；以及b」』.特異性識別和結合cd20的結構域，其由一組抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗tcd20vl-cl)和重鏈(抗cd20vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成。優選地，所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域與所述特異性識別和結合cd20的結構域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位於鉸鏈區的二硫鍵連接。根據本發明的一個優選的實施方案，所述抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a」」.特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域，其由兩組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)組成；以及b」」.特異性識別和結合cd20的結構域，其由兩組抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)和重鏈可變區(抗cd20vh)組成。優選地，所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域中的每個抗pd-1特異性抗體的重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)的ch3分別與所述特異性識別和結合cd20的結構域中的每個抗cd20特異性抗體的重鏈可變區(抗cd20vh)通過化學鍵連接。優選地，所述的抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。優選地，所述特異性識別和結合pd-1的結構域中的重鏈可變區的胺基酸序列如seqno:1、5、9或21所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如seqidno:3、7、11或23所示。優選地，所述特異性識別和結合cd20的結構域中的重鏈可變區的胺基酸序列如seqidno:13、17或25所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如seqidno:15、19或27所示。優選地，所述抗pd-1特異性抗體的重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)的胺基酸序列為seqidno:29，核苷酸編碼序列為seqidno:30；所述抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)的胺基酸序列為seqidno:31，核苷酸編碼序列為seqidno:32；由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(抗pd-1vl)、重鏈可變區(抗pd-1vh)、鉸鏈區和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成的所述特異性識別和結合免疫細胞表面抗原pd-1的結構域的胺基酸編碼序列為seqidno:33，核苷酸編碼序列為seqidno:34。優選地，所述抗cd20特異性抗體的重鏈(抗cd20vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)的胺基酸序列為seqidno:35，核苷酸編碼序列為seqidno:36；所述抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗cd20vl-cl)的胺基酸序列為seqidno:37，核苷酸編碼序列為seqidno:38；由依次連接的抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)、重鏈可變區(抗cd20vh)、鉸鏈區和fc片段(抗cd20ch2-ch3)組成的所述特異性識別和結合cd20的結構域的胺基酸序列為seqidno:39，核苷酸編碼序列為seqidno:40；由抗cd20特異性抗體的輕鏈可變區(抗cd20vl)和重鏈可變區(抗cd20vh)組成的所述特異性識別和結合cd20的結構域的胺基酸序列為seqidno:41，核苷酸編碼序列為seqidno:42。另一方面，本發明還提供了一種編碼所述的抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段的核酸分子，或者一種包含所述核酸分子的表達載體，或者一種包含所述表達載體的宿主細胞。優選地，所述特異性識別和結合pd-1的結構域中的重鏈可變區的核苷酸序列如seqidno:2、6、10或22所示，輕鏈可變區的核苷酸序列如seqidno:4、8、12或24所示。優選地，所述特異性識別和結合cd20的結構域中的重鏈可變區的核苷酸序列如seqidno:14、18、26所示；輕鏈可變區的核苷酸序列如seqidno:16、20、28所示。再一方面，本發明還提供了一種藥物組合物，其包括所述的抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段，或所述的核酸分子，或所述的表達載體或所述的宿主細胞。優選地，所述藥物組合物還包括一種或多種其他抗腫瘤藥物；優選地，所述藥物組合物還與一種或多種其他抗腫瘤治療方法，例如化學療法、放射療法和/或生物療法一起使用。進一步地，本發明還提供了所述的抗pd-1和cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段、或所述的核酸分子、或所述的表達載體或所述的宿主細胞在製備治療腫瘤的藥物中的應用。具體地，所述腫瘤為非霍奇金淋巴瘤。本發明提供了能夠同時特異結合程序性死亡因子1(pd-1)和cd20的雙特異性抗體、突變體及其功能性片段。本發明的雙特異性抗體、突變體或其功能性片段具有以下特性的至少一種：a.能夠與pd-1以高特異性結合，並阻斷pd-1和pd-l1的相互作用；b.與其它cd28家族成員(如icos、ctla-4和cd28)不發生結合；c.能夠與cd20以高特異性結合；d.與其他b細胞分化抗原(如cd19，cd22)不發生結合；e.激活免疫細胞(如腫瘤特異性t細胞)，並特異識別cd20陽性腫瘤細胞，促進cd8+t細胞進入腫瘤組織，使ifn-γ等免疫效應物的水平大大增加，從而實現靶向殺傷腫瘤細胞。本發明還提供了人源化的抗pd-1/cd20雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段。所述人源化抗體由免疫小鼠產生的鼠源抗體經由計算機模擬設計並結合噬菌體展示技術而得到，並且根據其與不同物種的pd-1和cd20蛋白胞外結構域的結合特性，鑑定其相應的結合表位。本發明所述的人源化抗pd-1/cd20雙特異性抗體、變體及其功能性片段具備上述pd-1/cd20雙特異性抗體及其功能性片段的有利特性。本發明所述變體和功能片段包括通過化學修飾或通過摻入脂質體中能夠增加半壽期的任何片段，修飾後的片段保留與其來源抗體相同的結合特異性和親和力，這樣獲得的新的具有雙特異結合特性的蛋白分子也在本發明保護的範圍內。在不實質性影響抗體活性的前提下，本領域技術人員可以對本發明的序列替換、添加和/或缺失一個或更多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個)胺基酸，以獲得所述抗體或其功能性片段之序列的變體。它們都被視為包括在本發明保護的範圍內。本領域技術人員可以將編碼本發明所述抗pd-1/cd20雙特異性抗體的dna分子克隆到載體中，進而轉化宿主細胞。因此，本發明還提供了以圖1a-d所示雙特異抗體為例的重組dna載體。編碼圖2所示pd-1/cd20雙特異抗體的變體及功能片段的載體及宿主細胞也在本發明保護的範圍內。本發明所述宿主細胞可以為原核宿主細胞、真核宿主細胞或噬菌體。所述原核宿主細胞可以為大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、鏈黴菌或奇異變形菌等。所述真核宿主細胞可以為如巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母、木黴等真菌，如草地粘蟲等昆蟲細胞，如菸草等植物細胞，如bhk細胞、cho細胞、cos細胞、骨髓瘤細胞等哺乳動物細胞。在一些實施方案中，本發明所述宿主細胞優選為哺乳動物細胞，更優選bhk細胞、cho細胞、nso細胞或cos細胞。本發明從重組體培養液中獲得相應的雙特異性抗體，並用細胞elisa和流式細胞術來檢測其對pd-1和cd20的結合活性。實驗結果表明，本發明的雙特異性抗體能夠結合cd20陽性的細胞，如raji細胞，也能夠結合t淋巴細胞，因此本發明所構建的雙特異性抗體可以有效靶向cd20陽性淋巴瘤細胞和t淋巴細胞。鑑於以上pd-1抗體和cd20單克隆抗體的缺點，如果把能夠增強t淋巴細胞功能的pd-1抗體分子與靶向b淋巴瘤細胞的分子cd20抗體分子融合，這樣就能夠有效地在非霍奇金淋巴瘤細胞周圍富集t淋巴細胞，在防禦免疫逃逸的基礎上，能夠更有效地靶向殺傷腫瘤細胞，從而大大提高了殺傷腫瘤細胞的效果。因此，本發明將pd-1抗體和cd20抗體設計成pd-1/cd20雙特異性抗體，使細胞毒性t淋巴細胞靶向到腫瘤細胞，既避免了免疫逃逸，又能精確殺傷腫瘤細胞，比單純利用pd-1抗體或cd20抗體的殺傷效能更充分、更精確，大大提高了抗體治療非霍奇金淋巴瘤患者的臨床效果，有更好的臨床應用價值。本發明應用純化方法獲得高純度的雙特異性抗體後，在體外檢測其對t淋巴細胞的激活作用，還利用體外細胞模型和體內動物模型來檢測其對b細胞淋巴瘤生長的抑制作用。在體外實驗中，用mtt等方法檢測本發明的雙特異性抗體對pd-1表達陽性的t淋巴細胞的增殖作用，或用mtt等方法檢測其對cd20表達陽性的淋巴瘤細胞如raji細胞的生長抑制作用。在體內實驗中，上述cd20陽性的腫瘤細胞可以用來構建小鼠腫瘤模型，腫瘤模型可通過腹背側皮下、腹腔、尾靜脈等方法構建，以用於觀察雙特異性抗體的抗腫瘤或抗轉移實驗。本發明提供的包含pd-1抗體和cd20抗體的人源雙特異性抗體蛋白在體內外都具有良好的生物活性和穩定性，能夠同時結合pd-1和cd20陽性的細胞，並且能夠激活人t淋巴細胞，靶向殺傷非霍奇金淋巴瘤細胞。本發明的有益效果在於提供了一種人源化的pd-1/cd20雙特異性抗體，其可以結合pd-1和cd20陽性的細胞，並且能夠增強t淋巴細胞的功能，從而達到靶向抗非霍奇金淋巴瘤細胞的作用，較目前臨床應用的pd-1抗體和cd20單克隆抗體，具有更加強大的殺傷能力，在臨床應用中具有很好的應用前景。附圖說明以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：圖1為本發明所述抗pd-1/cd20雙特異性抗體的結構示意圖。圖2為本發明所述抗pd-1/cd20雙特異性抗體的功能性片段或變體的結構示意圖。圖3為純化人源化pd-1、cd20胞外結構域的sds-page檢測結果。圖4為抗pd-1單克隆抗體與抗cd20單克隆抗體的elisa檢測結果。圖5分別顯示抗pd-1單克隆3、21、45與77與cd28家族蛋白的結合。圖6分別顯示抗pd-1單克隆3、21、45與77對pd-l1蛋白與人t細胞的pd-1結合的封閉作用。圖7分別顯示抗cd20單克隆8、65與cd20蛋白的特異性結合。圖8顯示編碼本發明的雙特異抗體的重組質粒圖譜。圖9顯示流式細胞術檢測雙特異性抗體對raji細胞的結合效應的結果，左圖：抗-pd1/抗-cd20；右圖：對照抗體。圖10顯示雙特異抗體中抗pd-1抗體部分的親和力能力實驗結果；圖11顯示本發明的pd-1/cd20雙特異性抗體對pd-1和cd20的特異結合；圖12顯示雙特異性抗體的體外腫瘤細胞生長抑制活性；圖13顯示雙特異性抗體抑制小鼠體內移植瘤的生長的實驗結果，其中縱坐標為腫瘤體積。具體實施方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。實施例1抗pd-1/cd20雙特異性抗體的結構設計本發明提供了一些可同時特異性結合pd-1與cd20胞外結構域的雙特異性抗體的結構模型，此類抗體4種主要實施例的結構如圖1所示，圖1(a-c)中3種異源二聚體的形成均基於本領域技術員所熟知的ch3結構域突變技術(「knobandholemutation」)(vonkreudensteinetal.，mabs.20135(5):646-54)。(其中，(a)抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)-重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)對與抗cd20特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)-重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區-ch2-ch3)對組成的雙特異性結合蛋白；(b)抗pd-1特異性抗體的輕鏈-重鏈對與cd20輕鏈可變區(抗cd20vl)、重鏈可變區(抗cd20vh)、鉸鏈區和fc片段(抗cd20ch2-ch3)融合蛋白組成的雙特異性結合蛋白；(c)抗pd-1輕鏈可變區、重鏈可變區、鉸鏈區和fc片段融合蛋白與抗cd20特異性抗體的輕鏈-重鏈對組成的雙特異性結合蛋白；(d)抗pd-1特異性抗體的輕鏈與抗pd-1特異性抗體的重鏈、抗cd20輕鏈可變區(抗cd20vl)和重鏈可變區(抗cd20vh)融合蛋白組成的雙特異性結合蛋白。抗pd-1/cd20雙特異性抗體的變體及功能性片段的實施例如圖2所示，圖2e-h中的雙特異抗體變體及功能性片段的形成基於本領域技術員所熟知的融合肽技術(以多肽鏈或蛋白質將不同結構域連接，進而實現融合表達)，圖2i中異源二聚體的形成基於本領域技術員所熟知的ch3結構域突變技術(同圖1a-c)(e)抗pd-1的重鏈可變區(抗pd-1vh)與抗cd20重鏈可變區(抗cd20vh)的融合蛋白；(f)抗pd-1的單鏈可變片段(scfv)與抗cd20的scfv組成的融合蛋白；(g)抗pd-1的單鏈可變片段(scfv)與抗cd20的scfv組成的非免疫球蛋白融合蛋白；(h)抗pd-1輕鏈可變區、重鏈可變區、鉸鏈區、fc片段與抗cd20輕鏈可變區、重鏈可變區組成的四價融合蛋白；(i)抗pd-1輕鏈可變區、重鏈可變區、鉸鏈區和fc片段融合蛋白與抗cd20輕鏈可變區、重鏈可變區、鉸鏈區和fc片段融合蛋白組成的雙特異性結合蛋白(註：圖中特異識別pd-1與cd20的功能片段位置可互換)。實施例2抗pd-1/cd20雙特異性抗體抗原(人pd-1和cd20胞外可溶結構域)的製備在uniprot資料庫獲得人源pd-1和cd20胞外結構域的編碼基因序列，通過全基因合成的方式獲得編碼基因pd-1ed-cds和cd20ed-cds，合成產物在經bamhi、ecori(pd-1ed-cds)和bamhi、xbai(cd20ed-cds)雙酶切後，克隆到pcdna3.1載體，利用cho細胞作為宿主細胞進行蛋白質表達，利用親和層析、離子交換層析等純化技術對目的蛋白進行純化。圖3顯示人源pd-1與cd20胞外結構域蛋白純化並進行去糖基化處理後的sds-page檢測結果圖。實施例3抗人pd-1與cd20抗體的獲得1.免疫動物將1mg/ml已純化的人pd-1或cd20胞外結構域蛋白100μl分別與等體積弗氏完全佐劑室溫下均勻混合後，腹部皮下多點注射入6-8周balb/c小鼠體內。7天後，將1mg/ml蛋白100μl與等體積弗氏不完全佐劑在室溫下均勻混合後，腹部皮下多點注射入小鼠體內。七天後，重複上面步驟。七天後，重複上面步驟。第四次注射後三天，斷鼠尾尖取血15μl，室溫下靜置2h，25℃，6000-8000rpm，離心10-15min，取上清，通過elisa實驗檢測效價。若效價檢測可用即眼部取全血，室溫下靜置2h，25℃，6000-8000rpm，離心10min，取上清，-80℃保存。若效價不可用，繼續免疫一次。2.細胞融合無菌取小鼠脾細胞並製成細胞懸液，將1×108個脾細胞與2-5×107個骨髓瘤(sp2/0-ag14)細胞融合，50％peg作融合劑，以hat選擇培養基培養3-10天後，以ht培養基進行培養，培養條件為5％co2，37℃。3.陽性克隆篩選利用elisa反應篩選單克隆雜交瘤細胞中可分泌結合pd-1或cd20胞外結構域的蛋白抗體的克隆，分別是篩選出結合pd-1(克隆3、21、45、77)和cd20(克隆8、65)的優選克隆，克隆均可特異性識別相應的抗原蛋白。實施例4抗pd-1抗體與其他cd28家族蛋白的結合鑑定為鑑定篩選出的pd-1抗體的特異性，將cd28家族的成員蛋白pd-1、cd28、ctla-4和icos(r&dsysterm)於酶標板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌後加入100μl侯選抗體(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗滌5次後加入稀釋的hrp標記山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次後加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min後加入50μl/孔的2mh2so4終止反應。用酶標儀測定490nm處各孔的吸光值。實驗結果如圖5，候選克隆分泌的抗體不結合除pd-1外的cd28家族成員蛋白。實施例5抗pd-1抗體對人t細胞的pd-1受體與pd-l1結合的封閉實驗1.人外周血t細胞的分離抽取健康志願者外周血10ml，緩慢加入裝有5ml淋巴細胞分離液的離心管中，2500rpm，20min，取出白膜層，以pbs洗滌3次，獲得人外周血單核細胞pbmc。分離得到的pbmc，加入100μl/mlcd3抗體(invitrogen)，輕吹混勻，室溫孵育15min；加入5μl/ml免疫磁珠(invitrogen)，4℃下孵育60min，每10分鐘震蕩一次；以pbs衝洗並稀釋，將細胞懸液注入填有不鏽鋼毛的特製試管中，放入分離器進行分離純化，強磁場下t細胞不能通過分離器，得以純化。2.人pd-l1胞外結構域與綠色螢光蛋白融合蛋白的製備在uniprot資料庫獲得人pd-l1胞外結構域編碼基因序列，通過全基因合成的方式獲得編碼基因，合成產物在經ecori、xhoi雙酶切後，克隆到pegfp-n1載體，利用cho-s細胞作為宿主細胞進行蛋白質表達，利用親和層析、離子交換層析等純化技術對目的蛋白進行純化，獲得綠色螢光蛋白融合表達的人源pd-l1胞外結構域蛋白rh-pd-l1-gfp，圖6(a)顯示融合蛋白的表達與純化並進行區糖基化處理後的sds-page結果。3.抗pd-1抗體對人t細胞的pd-1受體與pd-l1結合的封閉實驗將優選克隆產生的4種抗體(1μg/ml)與rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)室溫下輕柔混合30min，然後將混合蛋白溶液加入分離純化出的人外周血t細胞，室溫孵育15分鐘後以pbs清洗3次，以流式細胞儀進行分析。由圖6(b-f)，克隆3、21和77可阻礙pd-l1與人t細胞上的pd-1受體的結合，克隆45的阻斷效果較差。實施例6抗cd20抗體與cd19、cd33和cd138的結合鑑定將cd20、cd19、cd33和cd138(r&dsysterm)於酶標板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌後加入100μl侯選抗體(1μg/ml)，37℃孵育1h；洗滌5次後加入稀釋的hrp標記山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次後加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min後加入50μl/孔的2mh2so4終止反應。用酶標儀測定490nm處各孔的吸光值。實驗結果如圖7，候選克隆分泌的抗體不結合cd19、cd33和cd138蛋白。實施例7抗pd-1和cd20候選抗體可變區序列的獲得分別擴大培養抗pd-1克隆3、21、77和抗cd20克隆8、65，培養至細胞量為109個，離心收集細胞，去除細胞培養液，以預冷的pbs緩衝液(6-8ml)輕輕洗滌細胞兩次；以trizol試劑盒(takara)提取總rna，以紫外分光光度計檢測rna的純度與濃度；以總rna為模板，逆轉錄獲得cdna，逆轉錄體系20μl，其中5×逆轉錄buffer(4μl)，dntp(1μl)，mgcl2(2.4μl)，pd(n6)隨機引物(1.5μl)，rna模板(2μg)，逆轉錄酶(1μl)，depc水(至20μl)。以cdna為模板，擴增雜交瘤中可變區的dna序列，擴增引物序列與抗體可變區第一框架區和恆定區互補(orlandir，etal.cloningimmunoglobulinvariabledomainsforexpressionbypolymerasechainreaction.proc.natl.acad.sci.usa,1989,86：3833)，擴增體系50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。擴增產物克隆至pmd19載體，經藍白斑篩選後，重組子測序，獲得的抗pd-1克隆3、21、77的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列見seqno:1和3，5和7，9和11；編碼相應胺基酸的核苷酸序列見seqno:2和4，6和8，10和12。獲得的抗cd20克隆8、65的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列見seqno:13和15，17和19；編碼相應胺基酸的核苷酸序列見seqno:14和16，18和20。實施例8抗pd-1與cd20抗體的人源化改造利用獲得的抗pd-1與cd20抗體的可變區胺基酸序列(實施例7獲得的序列)，利用imgt/v-quest在線伺服器分析抗體亞型，綜合kabat、chothia及imgt三種抗體的cdr區的numbering方案確定抗體輕鏈與重鏈的六個cdr區序列；利用ds軟體進行小鼠親本抗體fab及其嵌合人源化抗體fab的空間結構，獲得嵌合抗體的分子模型後，對親本fab和嵌合抗體fab初始模型採用分子動力學模擬進行全面的優化，提取穩定的平均構象；利用表位掃描檢驗設計的人源化抗體可能存在的線性表位與構象表位，確定必須保留的框架區胺基酸位點後，設計不同的胺基酸突變位點獲得人源化抗體。在此基礎上，我們得到了多個人源化抗體，其中評分最高的抗pd-1和抗cd20抗體序列分別為克隆81和克隆34，克隆81的重鏈和輕鏈胺基酸序列分別為seqidno:21和23，編碼相應胺基酸的核苷酸序列分別為seqidno:22和24；克隆34的重鏈和輕鏈胺基酸序列分別為seqidno:25和27，編碼相應胺基酸的核苷酸序列分別為seqidno:26和28。實施例9抗pd-1/cd20雙特異性抗體表達載體的構建本發明的抗pd-1/cd20雙特異性抗體中的抗pd-1(克隆81，製備方法見實施例8)的可變區編碼核苷酸pd-1-vh和pd-1-vl，抗cd20(克隆34，製備方法見實施例8)的可變區編碼核苷酸cd20-vh和cd20-vl，igg1重鏈恆定區ch1、鉸鏈區、fc和fc-knob和fc-hole編碼核苷酸，以及輕鏈恆定區cl的kappa鏈編碼核苷酸，以及連結scfv的多肽(ggggs)3編碼基因得自於lifetechnologiesinc.(carlsbad，ca)。同時，為了抗pd-1/cd20抗體能在cho細胞中表達，並能分泌到培養基中，選擇了分泌tnf-α的前導肽序列作為分泌信號肽。雙特異性抗體pd-1/cd20的n端加上了分泌信號肽以及his6標籤，不但能夠保證其分泌到哺乳細胞外，而且還能夠利用親和層析純化，並能夠進一步利用酶切除標籤而只保留活性雙特異性抗體蛋白。圖1中所示4種結構的雙特異性抗體中的各個不同鏈，vl和cl、vh和ch1、ch1和fc(fc-knob、fc-hole)、scfv和fc(fc-knob、fc-hole)、fc和scfv通過重疊pcr的方式獲得。pcdna3.1和pires作為表達載體以製備雙特異性抗體。實施例10本發明的雙特異性抗體在細胞中的表達和純化本發明的雙特異性抗體是在cho-s細胞中表達並分泌到培養液中的，並利用鎳柱親和層析的方法純化得到。1.抗pd-1/cd20雙特異性抗體在cho-s細胞中的瞬時表達獲得高純度編碼雙特異性抗體pd-1/cd20的重組質粒後，利用lipofectamine2000質粒轉染試劑盒(invitrogen公司)將重組質粒轉染cho細胞(atcc)，在無血清培養基中培養三天後收集cho細胞上清液，可以用免疫印跡檢測雙特異性抗體的表達。此方法可用於快速地獲取少量的雙特異性抗體蛋白，其濃度可以用elisa法定量檢測，所用一抗可以為抗his6抗體。2.抗pd-1/cd20雙特異性抗體在cho-s細胞中的穩定表達將編碼雙特異性抗體的重組質粒用lipofectamine2000質粒轉染試劑盒轉染cho細胞，在無血清培養基中培養兩天後加入潮黴素，採用有限稀釋法進行細胞克隆培養，大約14天後挑取潮黴素抗性的細胞克隆進行細胞的擴大培養，並選取狀態良好的細胞在液氮中冷凍保存。穩定轉染後的cho-s細胞進一步擴大培養以生產大量的雙特異性抗體蛋白，此方法可用於獲取大量的雙特異性抗體pd-1/cd20，其濃度可以用elisa法定量檢測，所用一抗可以為抗his6抗體。3.雙特異性抗體pd-1/cd20的純化包含雙特異性抗體的細胞培養液可採用鎳柱親和層析的方法進行純化。將鎳層析柱以緩衝液平衡後，將超濾器濃縮過的cho-s細胞培養液上清液進樣，以a280(nm)進行監測，用清洗液洗至未結合的蛋白全部被洗脫，然後用洗脫液洗脫結合蛋白。純化後的雙特異性抗體用elisa法檢測濃度。實施例11本發明雙特異性抗體與細胞的體外結合實驗本發明的雙特異性抗體(序列參見實施例8)在體外能夠富集t淋巴細胞至相應的靶細胞。本發明以raji細胞作為cd20陽性的細胞，並以本發明的雙特異性抗體來檢測其細胞結合活性。1.雙特異性抗體與raji細胞的結合活性對照抗體或雙特異性抗體20μl與1×106個raji細胞混合，37℃下孵育30分鐘。pbs緩衝液洗滌2次，然後與鼠抗his6抗體在冰上孵育30分鐘。pbs緩衝液洗滌，與pe標記的兔抗鼠抗體在染色緩衝液中在冰上孵育30分鐘。pbs緩衝液洗滌2次，上流式細胞儀進行分析。結果顯示，本發明的雙特異性抗體與cd20單克隆抗體相比，具有更強結合cd20陽性的raji細胞的能力，並且差異較為顯著(見圖9)。2.雙特異性抗體中抗pd-1抗體的親和力鑑定將pd-1-his重組蛋白按2μg/ml包被到酶標板中，4℃下靜置過夜。用pbst洗3次。用0.1％的bsa室溫封閉1小時。用pbst洗3次，將實施例2製備獲得的pd-1/cd20抗體配製成200μg/ml濃度，並進行梯度稀釋，每孔加入30μl，室溫靜置30分鐘。用pbst洗3次，加入偶聯hrp的抗人fc的酶標二抗，室溫靜置1小時。用pbst洗4次，加入tmb顯色，並用2m的h2so4終止反應，酶標儀讀數。從結果可看出，篩選得到的抗體對pd-1具有較好的親和力，而且其能力與陽性對照nivolumab相近(圖10)。實施例12抗pd-1/cd20雙特異性抗體的特異性結合鑑定將pd-1、ctla-4、cd20和cd19(r&dsysterm)於酶標板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌後加入純化的4種抗體(序列參見實施例8，結構參見圖1a-d)(100μg/ml)的梯度稀釋液(pbs連續稀釋(1：102，1：103，1：104，1：105，1：106，1：107，1：108，1：109)，100μl/孔，37℃孵育1h；洗滌5次後加入稀釋的hrp標記山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次後加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min後加入50μl/孔的2mh2so4終止反應。用酶標儀測定490nm處各孔的吸光值。實驗結果如圖11，4種雙特異性抗體可同時特異性識別pd-1和cd20。實施例13本發明的雙特異性抗體的體外腫瘤細胞生長抑制活性檢測本發明利用raji細胞作為細胞模型來檢測雙特異性抗體對raji細胞的體外生長抑制作用。在96孔細胞培養板內接種raji細胞，按照t淋巴細胞與raji細胞10：1的比例將t淋巴細胞加入到培養板內，同時將不同濃度的雙特異性抗體加入到細胞培養孔。繼續培養細胞後，每孔加20μlmtt。繼續孵育4小時後，吸棄細胞培養孔內的上清液，每孔加150μl二甲基亞碸(dmso)，用酶聯免疫檢測儀測定各孔490nm波長的吸收值，繪製細胞生長曲線。結果顯示，較pd-1抗體組和cd20單克隆抗體組，本發明的雙特異性抗體(序列見實施例8，結構見圖1d)能顯著抑制raji細胞的生長，與對照組有顯著差異(見圖12)。實施例14本發明的雙特異性抗體pd1/cd20對小鼠體內移植瘤生長抑制的檢測本發明利用raji細胞來接種scid小鼠以檢測雙特異性抗體對raji細胞的體內生長抑制作用。4-5周齡scid小鼠(體重為18-20g/只)分為4組。小鼠腋下接種raji細胞l×107/ml，0.2ml/只，建立淋巴瘤裸鼠模型。一組raji接受vehicle(pbs)，另一組接受5μg雙特異性抗體(pd-1/cd20bsab)處理，其餘兩組均為陽性對照組：抗pd-1抗體對照組(實施例8製備的克隆81)和抗cd20單克隆抗體對照組(實施例8製備的克隆34)，處理方案為隔天尾靜脈注射5次。15天後，測量腫瘤大小，結果見表1。表1雙抗對腫瘤的抑制作用結果組別腫瘤體積(cm3)pbs對照組2.76±0.5pd-1抗體對照組1.65±0.2*cd20單克隆抗體組1.62±0.08*雙抗組1.20±0.1**#&註：與pbs對照組比較**p<0.01，*p<0.05；與pd-1抗體對照組比較#p<0.05；與cd20單克隆抗體組比較&p<0.05。圖13顯示，比pbs對照組相比，抗pd-1抗體對照組、抗cd20單克隆抗體對照組和本發明的雙特異性抗體組(序列參見實施例8，結構參見圖1d)能夠明顯抑制移植瘤的生長(p<0.01)；與抗pd-1抗體對照組和抗cd20單克隆抗體對照組相比，本發明的雙特異性抗體能夠更加有效抑制raji移植瘤的生長，且差異具有顯著性(p<0.05)。實施例15抗pd-1/cd20雙特異抗體的變體(圖2所示的5種變體)體內腫瘤殺傷實驗將種植瘤小鼠分為6組，每組4隻，以純化的5種抗pd-1/cd20雙特異抗體的變體(圖2e-i所示的雙抗變體，序列參見實施例8)尾靜脈注射至成瘤小鼠體內，用量分別為a組：pbs，b組：30mg/kg變體1(圖2e)，c組：30mg/kg變體2(圖2f)，d組：30mg/kg變體3(圖2g)，e組：30mg/kg變體4(圖2h)，和f組：30mg/kg變體5(圖2i)。每隔一周注射1次，連續注射4次，記錄小鼠體內腫瘤大小變化。5種抗pd-1/tem-8雙特異性抗體的變體同樣具備抑制腫瘤生長的功效(p＜0.01)。表2不同抗體的變體對腫瘤的抑制作用結果組別腫瘤大小對照組1495±33mg變體1(圖2e)組218±41mg**變體2(圖2f)組129±19mg**變體3(圖2g)組86±23mg**變體4(圖2h)組87±15mg**變體5(圖2i)組82±14mg**註：與對照組比較**p<0.01。上述實施例表明，本發明的人源抗pd-1/cd20雙特異性抗體可以在cho細胞中表達，能夠進一步通過親和層析純化。所得到的雙特異性抗體可以結合cd20陽性的raji細胞，並且可以抑制t淋巴細胞的凋亡，誘導t淋巴細胞靶向殺傷非霍奇金淋巴瘤的作用，並且較單獨使用抗pd-1抗體或抗cd20抗體具有更顯著的殺傷效能。順昊細胞生物技術（天津）股份有限公司抗pd1和cd20雙特異性抗體及其應用shunhobimab-pd-1xcd2042patentinversion3.31120prt人工序列克隆3重鏈的胺基酸序列1glnglyglnleuvalglnserglyglygluvallyslysproglyala151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyglyiletrptyraspglyserlysargtyrtyrasnglulysphe505560lysasnargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargargasptyrphepheasptrptyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrvalthrvalserser1151202360dna人工序列克隆3重鏈可變區的核苷酸序列2cagggccagctggtgcagagcggcggcgaggtgaagaagcccggcgccagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacaccttcaccaactactacatgcactgggtgaggcaggcc120cccggccagggcctggagtggatgggcggcatctggtacgacggcagcaagaggtactac180aacgagaagttcaagaacagggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctac240atggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggagggac300tacttcttcgactggtacttcgactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc3603111prt人工序列克隆3輕鏈可變區的胺基酸序列3gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserglnservalserthrser202530glytyrsertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro354045argleuleuiletyraspalasertyrleugluserglyileproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileser65707580serleugluprogluaspvalglyvaltyrtyrcysglnhisserser859095asntrpproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelys1001051104333dna人工序列克隆3輕鏈可變區的核苷酸序列4gagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagccagagcgtgagcaccagcggctacagctacctggcctggtac120cagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacgacgccagctacctggagagc180ggcatccccgccaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagc240agcctggagcccgaggacgtgggcgtgtactactgccagcacagcagcaactggcccctg300accttcggccagggcaccaagctggagatcaag3335114prt人工序列克隆21重鏈可變區的胺基酸序列5glnvalglnleuvalgluserglyalagluvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrilethrpheserasp202530tyrtyrmettyrtrpvalargglnalaproglyhisglyleuglutrp354045ileglytyrileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulys505560phelysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu65707580pheleuglnmetasnserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyr859095cysalathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser6342dna人工序列克隆21重鏈可變區的核苷酸序列6caggtgcagctggtggagagcggcgccgaggtggtgcagcccggcaggagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacatcaccttcagcgactactacatgtactgggtgaggcag120gcccccggccacggcctggagtggatcggctacatcaaccccagcaacggcggcaccaac180ttcaacgagaagttcaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctg240ttcctgcagatgaacagcctgcagttcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaccaac300gacgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc3427107prt人工序列克隆21輕鏈可變區的胺基酸序列7aspilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserlysglyvalsersertyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnserproargleuleuile354045tyrleualasertyrleugluserglyvalproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserargaspleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys1001058321dna人工序列克隆21輕鏈可變區的核苷酸序列8gacatcgtgatgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagcaagggcgtgagcagctacctgcactggtaccagcagaagccc120ggccagagccccaggctgctgatctacctggccagctacctggagagcggcgtgcccgac180aggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagggtggaggcc240gaggacttcgccgtgtactactgccagcagagcagggacctgccctacaccttcggccag300ggcaccaagctggagatcaag3219115prt人工序列克隆77重鏈可變區的胺基酸序列9glnglyglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrcysthrvalthrglytyrserilethrserasptyrsertrpasn202530trpileargglnalaproilehisglyleuglutrpileglytyrile354045asntyralaglyserthrsertyrasnproserleuglualavalthr505560ilethralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserser65707580leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargtrpphegly859095serthralatrptyrileaspvaltrpglyglnglythrthrvalthr100105110valserser11510345dna人工序列克隆77重鏈可變區的核苷酸序列10cagggccagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccacctgcaccgtg60accggctacagcatcaccagcgactacagctggaactggatcaggcaggcccccatccac120ggcctggagtggatcggctacatcaactacgccggcagcaccagctacaaccccagcctg180gaggccgtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagc240ctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggtggttcggcagcaccgcctgg300tacatcgacgtgtggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc34511109prt人工序列克隆77輕鏈可變區的胺基酸序列11aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugln151015proalaserilesercyslysserserglnalaleuleuhisserasp202530glylysthrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglyglnserpro354045lysleuleuiletyrgluleuserserargpheserglyileproasp505560argilethrglyserglythraspphethrleulysileserargval65707580glualagluaspleuglyvaltyrphecyspheglnglyvalhisile859095protyrserpheglyglnglythrlysleugluilelys10010512327dna人工序列克隆77輕鏈可變區的核苷酸序列12gacgtggtgatgacccagagccccctgagcctgcccgtgaccctgcagcccgccagcatc60agctgcaagagcagccaggccctgctgcacagcgacggcaagacctacctgtactggtac120ctgcagaagcccggccagagccccaagctgctgatctacgagctgagcagcaggttcagc180ggcatccccgacaggatcaccggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagggtg240gaggccgaggacctgggcgtgtacttctgcttccagggcgtgcacatcccctacagcttc300ggccagggcaccaagctggagatcaag32713121prt人工序列克隆8重鏈可變區的胺基酸序列13glnvalglnleuleugluserglyalagluleuvalargproglyser151015servallysilesercyslysalaserglytyra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