一種用於鑑定浙貝母的引物對及其應用的製作方法

2023-12-02 01:17:31

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段鑑定中藥的方法，具體為一種用於鑑定浙貝母的引物對及其應用。
背景技術：
：浙貝母為道地藥材「浙八味」之一，具有潤肺止咳的功效，用藥歷史悠久。貝母品種較多，除了浙貝母外，貝母主要品種還包括川貝母、湖北貝母、平貝母和伊貝母，另外流通領域還存在較多貝母偽品。不同品種的貝母藥效差異顯著，而且價格相差較大，需要建立一種準確、高效的鑑定方法。目前，較多學者利用rapd技術對浙貝母及其它藥材進行分子鑑定，但是由於rapd實驗應用的是隨機引物，導致實驗結果重複性差，無法推廣應用。中藥的基源鑑定是中藥研究工作的基礎和關鍵。品種混亂現象是目前貝母類藥材在實際應用中較難以克服的問題，而傳統的鑑別方法又有一定的主觀性，特別是對一些開花前的新鮮貝母藥材、乾燥或破碎藥材，鑑定時更為困難，不僅如此，貝母屬植物種間的化學成分差異較大，用理化方法鑑定時也比較困難。核糖體dna的內轉錄間隔區基因與5srdna轉錄間隔區基因是目前研究中應用較多的序列片段之一，是被子植物進化研究中重要的dna分子標記。針對目前貝母類藥材基源混亂，部分資源短缺的狀況，為了建立有效的鑑別方法，同時了解貝母屬植物的種系關係，並從中尋找出可利用的藥用貝母資源，對貝母的樣品進行高效、準確的分子鑑定尤為重要。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種適用於浙貝母，且能夠特異性識別浙貝母的基因片段，準確、快速進行貝母品種區分的方法，本發明提供了一種用於鑑定浙貝母的引物對及其應用。技術方案：一種用於鑑定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5』-3』)seqidno.p1-fggacagtactgggggagaagtc1p1-rgccaaatggagggtatgtgtcg2p2-fcgtaacaaggtttccgtaggtgaa3p2-rttattgatatgcttaaactcagcggg4p3-fggatccgtgcttgggcgagagtagta5p3-rggatccttagtgctggtatgatcgca6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在製備鑑定中藥浙貝母試劑盒中的應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100～1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優選的，所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述引物對能夠直接對單一樣品進行鑑定，因此該方法操作簡單、準確、應用範圍廣等優點；(2)本發明所述引物對特異性好，結果重複性好，靈敏度高，適合開發成檢測試劑盒。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑑定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑑定結果；2為實施例2pcr產物鑑定結果；3為實施例3pcr產物鑑定結果；4～7為市售其他品種貝母。具體實施方式實施例1一種用於鑑定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用於鑑定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用於鑑定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產物單一。其餘品種無擴增條帶。sequencelisting蘇州市李良濟健康產業有限公司一種用於鑑定浙貝母的引物對及其應用7patentinversion3.3122dna人工序列1ggacagtactgggggagaagtc22222dna人工序列2gccaaatggagggtatgtgtcg22324dna人工序列3cgtaacaaggtttccgtaggtgaa24426dna人工序列4ttattgatatgcttaaactcagcggg26526dna人工序列5ggatccgtgcttgggcgagagtagta26626dna人工序列6ggatccttagtgctggtatgatcgca26740dna人工序列7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12