焦磷酸測序技術檢測豬甲型h1n1流感病毒的方法

2023-12-06 12:02:16 1

專利名稱：焦磷酸測序技術檢測豬甲型h1n1流感病毒的方法
技術領域：
本發明屬於動物病原的檢測技術領域，涉及一種採用焦磷酸測序 (Pyrosequencing)技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法。
背景技術：
豬甲型Hmi流感病毒，是由一系列抗原結構可變的A型流感病毒引起的豬急性呼 吸系統疾病。在流感病毒侵襲豬群的近90年裡，豬流感給全世界的養豬業帶來了災難性的 損失，其不斷發生的抗原變異使豬流感很難被徹底清除。又由於豬可以充當禽流感與人流 感的中間宿主，豬流感病毒可以向人進行傳播，從而給人類健康造成了潛在的威脅。2009年 爆發的豬甲型Hmi流感疫情不僅對世界公共衛生提出了嚴峻的考驗，並對世界經濟產生 了重大影響。疫情暴發後，一些國家相繼禁止進口來自墨西哥、美國等疫情重災區的豬肉及 相關肉製品，給兩地肉食品加工和出口商帶來經濟損失。因此，深入加強對豬流感的研究刻 不容緩。目前，用於豬流感病原檢測的方法主要有病毒的分離鑑定、血清學診斷方法、分子 生物學診斷等方法。病毒的分離鑑定耗時費力，要求較高的試驗條件，不能滿足急性傳染 病緊急疫情防制工作的需要；血清學診斷方法主要包括血凝和血凝抑制試驗、神經氨酸酶 抑制試驗、中和試驗、瓊脂凝膠擴散試驗、免疫螢光法、酶聯免疫吸附試驗，其方法具有特 異性強、敏感性高的優點，但方法相當繁瑣，不適宜對大量樣品進行檢測；分子生物學診斷 方法主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)、實時螢光定量聚合酶鏈式反應、核酸序列擴增實驗 (NASBA)法，這些方法比較快速、靈敏，但準確度不夠，並且交叉汙染問題比較嚴重。焦磷酸測序技術是近年發展起來的新技術，它是目前唯一得到定量序列結果的檢 測技術，具有極高的準確性，且重現性極佳，是一種通用型技術平臺，功能多樣，應用領域廣 泛，具有高通量、低成本的特點，聚合酶鏈式反應產物即可直接用於測序，不需進行產物純 化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小，符合出入境檢驗檢疫的要求，鑑於豬流感病 毒危害的嚴重性，加強流感疫情的監控，提高檢測方法的準確度和檢測效率，對有效控制流 感病毒的傳播在現階段具有重要的實際意義。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點，尋求提供一種豬甲型Hmi流感病 毒的焦磷酸測序技術檢測方法，以克服現有檢測技術的不足，為豬養殖業、肉食品加工和出 口商以及國際肉類食品貿易等方面提供一種快速、簡便、高效、實用的檢測方法。為了實現上述目的，本發明的主要原理是利用焦磷酸測序技術，通過測序引物和 聚合酶鏈式反應擴增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交，與脫氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三 磷酸(ATP)硫酸化酶、螢光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底物(APS)、螢光素孵育，逐一加入 四種三磷酸鹼基脫氧核苷酸(dNTPs)(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP ；三磷酸胸腺嘧啶脫 氧核苷酸dTTP ；三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP ；三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP)，如與模板配對，此三磷酸鹼基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價鍵，釋放焦磷酸基團(PPi)；腺嘌呤 核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情況下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷 酸，腺嘌呤核苷三磷酸驅動螢光素酶介導的螢光素向氧化螢光素轉化，氧化螢光素髮出與 腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可見光信號；光信號由電荷耦合器件(CCD)收集並由軟體轉 化為峰；每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未摻 入的三磷酸鹼基脫氧核苷酸由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，並再生反應體系，利 用光信號轉化得到的峰圖，對樣品中的豬甲型Hmi流感病毒進行準確的檢測。本發明的實現，首先設計豬甲型Hmi流感病毒特異性引物及焦磷酸測序引物；再 提取待測樣品的核糖核酸(RNA)，然後分別以豬甲型Hmi流感病毒HI、m引物進行逆轉 錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增；用進行瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物檢測，若Hl引物擴 增片段長度為102bp，Nl引物擴增片段長度為249bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行 焦磷酸測序反應，最後根據RT-PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有豬 甲型Hmi流感病毒。本發明所述的設計豬甲型Hmi流感病毒特異性引物及焦磷酸測序引物是根據豬 流感病毒的基因序列，選取保守序列，通過Assay Design SW軟體設計豬甲型Hmi流感病 毒特異性引物序列，以擴增出特異性單一條帶，再根據擴增區域中包含的特異核苷酸序列 (目標序列)設計焦磷酸測序引物以確定病毒亞型；豬甲型Hmi流感病毒RT-PCR及測序 引物為Hl 基因上遊引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，，Hl 基因下遊引物 5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，進行生物素標記Hl 基因測序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，，Nl 基因上遊引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，，Nl基因下遊引物5』 -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3』，5』進行生物素標記Nl 基因測序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，。豬甲型Hmi流感病毒Hl目標序列ATGATAGATGG ；豬甲型Hmi流感病毒Nl目標 序列AATGGAGCAAATGG ；Hl亞型擴增片段長度為102bp，Nl亞型擴增片段長度為249bp。本發明所述的提取待測樣品的RNA是利用TRIZOL裂解液處理豬甲型Hmi流感病 毒待測樣品，三氯甲烷抽提蛋白質，異丙醇沉澱得到RNA ；亦可用商業化的RNA提取試劑盒 提取。本發明所述的分別以豬甲型流感病毒HI、m引物進行RT-PCR擴增其中，Hl引 物擴增是將提取的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ LRNA模板中分別加 入 2 μ L 25mmol/L 氯化鎂(MgCl2)，1 μ L 10XRNA PCR 緩衝液，1 μ L 2. 5mmol/L三磷酸鹼基 脫氧核苷酸(dNTP)，0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制劑，0. 5 μ L 5U/μ L AMV RNA 反轉錄酶， 0. 5μ L 20pmol/y L Hl上遊引物和Hl下遊引物，用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件為42°C 30min,98°C lmin，4°C，在 反轉錄後的IOyL cDNA(complementary DNA)溶液中加入10倍聚 合酶鏈式反應緩衝液 (10 XPCR buffer) 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0. 25 μ L, 20pmol/μ L Hl 上遊引物和 Hl 下 遊引物0. 5 μ L，DEPC水補足體積至50 μ L，PCR循環條件為94°C預變性5min後，進入94°C 變性30s，54°C退火，72°C延伸30s，共循環50次；然後72°C再延伸IOmin ；Nl引物擴增是將提取的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ L RNA模板中分別加入2 μ L 25mmol/L MgC12,1 μ L IOXRNA PCRbuffer, 1 μ L 2. 5mmol/L dNTP,0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制劑，0. 5yL 5U/ μ LAMV RNA反轉錄酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl上遊引物和m下遊 引物，用DEPC水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件為42°C 30min,98°C lmin, 4°C，在反轉錄後的10 μ L cDNA溶液中加入10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0. 25 μ L，20pmol/ μ L Nl上遊引物和Nl下遊引物0. 5 μ L，DEPC水補足體積至50 μ L，PCR循 環條件為94°C預變性5min後，進入94°C變性30s，59°C退火，72°C延伸30s，共循環50次； 然後72°C再延伸lOmin。本發明所述的PCR擴增產物電泳檢測取2g瓊脂糖，於IOOmL電泳緩衝液中加熱， 充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. 5μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩衝液， 使液面剛剛沒過凝膠；將3 μ L 6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩衝液混合，點樣；9V/ cm恆壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果並記錄。本發明所述的製備焦磷酸測序單鏈模板使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與 200 μ g鏈黴親和素包被的磁珠，在室溫25°C下孵育20分鐘，用vacuum prep tool將與磁珠 結合後的PCR產物吸起，然後在70%乙醇中清洗5s ；變性緩衝液(denatureation buffer) 洗5s ；最後移到衝洗緩衝液(washing buffer)中清洗IOs ；vaccum prep tool放入含有測 序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80°C烘箱2分鐘，再冷卻到室溫。 本發明所述的焦磷酸測序反應測序反應在28°C下於焦磷酸測序儀上檢測，加樣 使用600毫巴/8毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加 入而延伸，隨著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，讀出DNA序列。本發明所述的關於根據RT-PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含 有豬甲型Hmi流感病毒H1和mRT-PCR反應均為陽性的，進行焦磷酸測序分析，測序片段 與HI、m目標片段完全相同的，確定為豬甲型Hmi流感病毒亞型；HI和mRT-PCR反應均 為陽性的，Hi和m測序片段與目標片段有一個以上鹼基不同判定為非豬甲型Hmi流感病 毒；Hi、mRT-PCR反應全部或有一個為陰性的判定為非豬甲型Hmi流感病毒。本發明適用於對豬甲型Hmi流感病毒進行快速檢測，可廣泛應用於肉類加工廠、 豬養殖場的疫病監控及進出口貿易中肉類豬甲型Hmi流感病毒的檢測；與現有技術相比， 其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便於構建標準化操作流程； 具有高通量、低成本的特點，PCR產物即可直接用於測序，不需進行產物純化等二次處理，操 作極為簡便，所需樣品量小。


圖1為本發明對豬肉樣品的HA基因擴增圖譜，其中M:DL2000，1 豬肉樣品。圖2為本發明對豬肉樣品的NA基因擴增圖譜，其中M:DL2000，1 豬肉樣品。圖3為本發明對豬肉樣品中HA基因焦磷酸測序結果。圖4為本發明對豬肉樣品中NA基因焦磷酸測序結果。
具體實施例方式下面通過具體實施例並結合附圖進一步闡述本發明。
實施例1 檢測出口的豬肉產品中是否含有豬甲型Hmi流感病毒1、設計特異性引物序列通過Internet登陸美國國立生物信息技術中心(NCBI)，查詢檢索已公布的豬流 感Hmi病毒HA和NA的核苷酸序列，不包含不明鹼基成分序列，對同源性較近的同年份同 地點的毒株只選取一株，用DNAStar 7. 1軟體包中的Editseq和MegAlign軟體對所選樣本 的HA、NA基因核苷酸序列進行編輯，逐一比對，用Clustal W Method (軟體)默認參數對所 選的HA、NA核苷酸序列進行同源性比較，找到代表各個亞型的保守序列區域，以及表徵該 區域的特異核苷酸序列(目標檢測序列)。PCR擴增引物設計和測序引物設計均可以通過Assay Design SW軟體來進行，使用 得分較高的一組引物進行實驗，根據DNASTAR的同源性分析結果，選取樣本基因中較保守 的序列區域，設計擴增引物，以便於擴增出特異性單一條帶，為後續測序奠定基礎。同時為 各個擴增區域中包含的特異核苷酸序列(目標序列)設計測序引物，Hl亞型擴增片段長度 為102bp，Nl亞型擴增片段長度為249bp。豬甲型Hmi流感病毒RT-PCR及測序引物為Hl 基因上遊引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，，Hl 基因下遊引物 5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，進行生物素標記Hl 基因測序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，，Nl 基因上遊引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，，Nl基因下遊引物5』 -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3』，5』進行生物素標記Nl 基因測序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，。2、提取待測樣品的RNA利用TRIZOL裂解液法提取待測樣品的RNA，具體步驟為取滅菌的1. 5mL離心管，力口 入600μ L TRIZOL裂解液，加入待測豬肉樣品各200mg，再加入200μ L氯仿，研磨，混勻器上 振蕩混勻30s，於4°C 12000r/min離心15min，吸取上清液500 μ L轉移到新的1. 5mL離心管 中，再加入_20°C預冷500 μ L異丙醇，室溫沉澱30min後，於4°C 12000r/min離心15min， 小心倒去上清，加入600 μ L 70%乙醇，顛倒洗滌，於4°C 12000r/min離心lOmin，再倒去上 清，將離心管倒置於吸水紙上，室溫乾燥。最後加入10μ L超純水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA, 2000r/min離心5s，即得到樣本的RNA。提取的RNA須在2小時內進行PCR擴增；若需 長期保存須放置冰箱。3、以豬甲型Hmi流感病毒HI、m引物進行RT-PCR擴增(I)Hl引物擴增將提取的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ L RNA模板中分別加 入 2yL 25mmol/L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/LdNTP, 0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制劑，0. 5yL 5U/μ L AMV RNA 反轉錄酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Hl 上遊引物 和Hl下遊引物，用DEPC水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件為42 V 30min, 98°C lmin，4°C，在反轉錄後的 10μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DN A聚合酶0. 25 μ L，20pmol/ μ L Hl上遊引物和Hl下遊引物0. 5 μ L，DEPC水補足體積至 50 μ L，PCR循環條件為94°C預變性5min後，進入94°C變性30s，54°C退火，72°C延伸30s， 共循環50次；然後72°C再延伸lOmin。
(2)m引物擴增 將提取的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ L RNA模板中分別加 入 2yL 25mmol/L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/LdNTP, 0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制劑，0. 5yL 5U/μ L AMV RNA 反轉錄酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl 上遊引物 和附下遊引物，用DEPC水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件為42 V 30min, 98°C lmin，4°C，在反轉錄後的 10μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，20pmol/ μ L Nl上遊引物和附下遊引物0. 5 μ L，DEPC水補足體積至 50 μ L ；PCR循環條件為94°C預變性5min後，進入94°C變性30s，59°C退火，72°C延伸30s， 共循環50次；然後72°C再延伸lOmin。4、進行瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，於IOOmL電泳緩衝液中加熱，充分 溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. 5 μ g/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩衝液，使液 面剛剛沒過凝膠；將3 μ L 6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩衝液混合，點樣；9V/cm 恆壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果，待檢豬肉樣品 能夠擴增出特異性條帶，Hl亞型為102bp，Nl亞型為249bp，電泳結果見圖1、圖2。5、製備焦磷酸測序單鏈模板使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與200 μ g鏈黴親和素包被的磁珠，在室溫 25°C下孵育20分鐘，用vacuum prep tool將與磁珠結合後的PCR產物吸起，然後在70%乙 醇中 青；denatureation buffer ^ 5s ；washing buffer 中i青 1 IOs ；vaccum prep tool放入含有Hl基因、Nl基因測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80°C 烘箱2分鐘，再冷卻到室溫。6、焦磷酸測序在焦磷酸測序儀(PYR0MARK ID)上進行反應，28°C條件下，加樣使用600毫巴/8 毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸；隨著核 酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，Hl基因、Nl焦磷酸測序結果及分別見圖3、圖 4，讀取的序列分別為 ATGATAGATGG、AATGGAGCAAATGG。7、結果判定豬肉樣品的Hl基因擴增片段長度為102bp，m基因擴增片段長度為249bp， 與標準一致；經過焦磷酸測序，測定的Hl序列與豬甲型Hmi流感病毒Hl目標序列一 致，為ATGATAGATGG ；測定的附序列與豬甲型Hmi流感病毒附目標序列一致，為 AATGGAGCAAATGG,因此判定豬肉樣品中含有豬甲型Hmi流感病毒。實施例2 檢測某養殖豬群中是否感染豬甲型Hmi流感病毒，採樣為豬鼻腔拭子1、設計特異性引物序列同實施例1。2、提取待測樣品的RNA 豬鼻腔拭子樣品在混合器上充分混合後，用高壓滅菌鑷子將拭子中的液體擠 出，室溫放置30min，取上清液，採用RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver 3. 0)，按照說明書進行RNA的提取。3、以豬甲型Hmi流感病毒HI、m引物進行RT-PCR擴增
同實施例1。4、進行瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，於IOOmL電泳緩衝液中加熱，充分 溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. 5μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩衝液，使液 面剛剛沒過凝膠；將3 μ L 6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩衝液混合，點樣；9V/cm 恆壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果。待檢樣品RT-PCR擴增未擴增出特異性條帶，因此判定某養殖場的豬群樣品中不含有豬甲型Hmi流感病毒。核苷酸序列表山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法8PatentIn version 3. 5119DNA人工序列primer_bind(1). . (19)用於擴增豬甲型Hmi流感病毒Hl基因的上遊引物1gccggattca ttgaaggag19223DNA人工序列primer_bind(1). . (23)用於擴增豬甲型Hmi流感病毒Hl基因的下遊引物2gcttttctga tctgctgcgt aac 23316DNA人工序列primer_bind
(1). . (16)用於豬甲型Hmi流感病毒Hl基因焦磷酸測序的引物3tgaaggagga tggaca 16420DNA
人工序列primer_bind(1). . (20)用於擴增豬甲型Hmi流感病毒附基因的上遊引物4aattggcatggctcaaatcg 20522DNA人工序列primer_bind(1). . (22)用於擴增豬甲型Hmi流感病毒附基因的下遊引物5tggatcccaa atcatctcaa aa 22617DNA人工序列primer_bind(1). . (17)用於豬甲型Hmi流感病毒附基因焦磷酸測序的引物6cgtttaaata cggcaat 17711DNAswine influenza virus
gene(1). . (11)豬甲型HlNl流感病毒Hl基因焦磷酸測序的目標序列7atgatagatg g 11814DNAswine influenza virusgene(1). . (14)豬甲型Hmi流感病毒附基 因焦磷酸測序的目標序列8aatggagcaa atgg 1權利要求
一種焦磷酸測序技術檢測豬甲型H1N1流感病毒的方法，其特徵在於先設計豬甲型H1N1流感病毒特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的RNA，然後分別以豬甲型H1N1流感病毒H1、N1引物進行RT-PCR擴增；用進行瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物檢測，若H1引物擴增片段長度為102bp，N1引物擴增片段長度為249bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據RT-PCR擴增結果和焦磷酸測序結果判定樣品中是否含有豬甲型H1N1流感病毒。
2.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特徵在 於所述的設計豬甲型Hmi流感病毒特異性引物及焦磷酸測序引物是根據豬流感病毒的基 因序列，選取保守序列，通過Assay Design SW軟體設計豬甲型Hmi流感病毒特異性引物 序列，以擴增出特異性單一條帶，再根據擴增區域中包含的特異核苷酸序列設計焦磷酸測 序引物以確定病毒亞型；豬甲型Hmi流感病毒RT-PCR及測序引物為Hl 基因上遊引物 5，-GCCGGATTCATTGAAGGAG-3，Hl基因下遊引物5，-GCTTTTCTGATCTGCTGCGTAAC-3，，5，進行生物素標記Hl 基因測序引物 5，-TGAAGGAGGATGGACA-3，Nl 基因上遊引物 5，-AATTGGCATGGCTCAAATCG-3，Nl基因下遊引物5』 -TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3』，5』進行生物素標記Nl 基因測序引物 5，-CGTTTAAATACGGCAAT-3，；豬甲型Hmi流感病毒Hl目標序列ATGATAGATGG ；豬甲型Hmi流感病毒m目標序列 AATGGAGCAAATGG ；Hl亞型擴增片段長度為102bp，Nl亞型擴增片段長度為249bp。
3.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特徵在 於所述的提取待測樣品的RNA是利用TRIZOL裂解液處理豬甲型Hmi流感病毒待測樣品， 三氯甲烷抽提蛋白質，異丙醇沉澱得到RNA，或用商業化的RNA提取試劑盒提取。
4.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特 徵在於所述的分別以豬甲型流感病毒HI、m引物進行RT-PCR擴增其中，Hl引物擴增是 將提取的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ L RNA模板中分別加入2 μ L 25mmol/L氯化鎂，IyL 10XRNA PCR緩衝液，IyL 2. 5mmol/L三磷酸鹼基脫氧核苷酸， 0. 25μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制劑，0. 5μ L 5U/ μ LAMV RNA 反轉錄酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Hl 上遊引物和Hl下遊引物，用焦碳酸二乙酯水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件 為42V 30min,98°C lmin，4°C，在反轉錄後的IOyL cDNA溶液中加入10倍聚合酶鏈式反 應緩衝液5口1^，5"口1^ Taq DNA聚合酶0. 25 μ L，20pmol/μ L Hl上遊引物和Hl下遊引物 0. 5 μ L，DEPC水補足體積至50 μ L，PCR循環條件為94°C預變性5min後，進入94°C變性 30s，54°C退火，72°C延伸30s，共循環50次；然後72°C再延伸IOmin ；Nl引物擴增是將提取 的待測樣品RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系為在3 μ L RNA模板中分別加入2 μ L 25mmol/ L MgC12,1 μ L 10XRNA PCR buffer, 1 μ L 2. 5mmol/L dNTP,0. 25 μ L 40U/ μ L RNA 酶抑制 劑，0. 5yL 5U/y L AMVRNA反轉錄酶，0. 5 μ L 20pmol/y L Nl上遊引物和附下遊引物，用 DEPC水補足體積至10 μ L，瞬時離心混合，反轉錄條件為42°C 30min, 98°C lmin, 4°C，在反轉 錄後的 10 μ L cDNA 溶液中加入 10XPCR buffer 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ L， 20pmol/ μ L Nl上遊引物和Nl下遊引物0. 5 μ L, DEPC水補足體積至50 μ L，PCR循環條件 為94°C預變性5min後，進入94°C變性30s，59 °C退火，72 °C延伸30s，共循環50次；然後72°C再延伸 lOmin。
5.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特徵在於所述的PCR擴增產物電泳檢測取2g瓊脂糖，於IOOmL電泳緩衝液中加熱，充分溶化，力口 入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. 5μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩衝液，使液面剛剛 沒過凝膠；將3 μ L 6 μ L PCR擴增產物分別和適量加樣緩衝液混合，點樣；9V/cm恆壓電 泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果並記錄。
6.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特徵 在於所述的製備焦磷酸測序單鏈模板使用50 μ 1標記有生物素的PCR產物與200 μ g鏈黴 親和素包被的磁珠，在室溫25°C下孵育20分鐘，用vacuum prep tool將與磁珠結合後的 PCR產物吸起，然後在70%乙醇中清洗5s ；變性緩衝液洗5s ；最後移到衝洗緩衝液中清洗 IOs ；vaccum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠，將樣品放入80°C烘箱2 分鐘，再冷卻到室溫。
7.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特 徵在於所述的焦磷酸測序反應測序反應在28 °C下於焦磷酸測序儀上檢測，加樣使用 600mbar/8msec的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延 伸，隨著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，讀出DNA序列。
8.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測豬甲型Hmi流感病毒的方法，其特徵在 於所述的關於根據RT-PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有豬甲型Hmi 流感病毒H1和WRT-PCR反應均為陽性的，進行焦磷酸測序分析，測序片段與HI、Nl目標 片段完全相同的，確定為豬甲型Hmi流感病毒亞型；Hl和mRT-PCR反應均為陽性的，Hl和 Nl測序片段與目標片段有一個以上鹼基不同判定為非豬甲型Hmi流感病毒；Hl AlRT-PCR 反應全部或有一個為陰性的判定為非豬甲型Hmi流感病毒。
全文摘要
本發明屬於動物病原的檢測技術領域的一種採用焦磷酸測序技術檢測豬甲型H1N1流感病毒的方法，先設計豬甲型H1N1流感病毒特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的RNA，然後分別以豬甲型H1N1流感病毒H1、N1引物進行擴增；用進行瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物檢測，若H1引物擴增片段長度為102bp，N1引物擴增片段長度為249bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有豬甲型H1N1流感病毒，其應用焦磷酸測序技術快速、準確地進行短DNA序列分析；具有高通量、低成本特點，產物可直接用於測序，不需進行二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。
文檔編號G01N21/76GK101845515SQ20091023153
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月4日 優先權日2009年12月4日
發明者凌宗帥, 孫濤, 嶽志芹, 張太翔, 徐彪, 梁成珠, 辛學謙 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心