一種高濃度γ‑聚穀氨酸及其發酵方法與流程

2023-12-06 09:03:51 2

本發明涉及微生物發酵
技術領域：
，具體涉及一種高濃度γ-聚穀氨酸及其發酵方法。
背景技術：
：γ-聚穀氨酸（poly-γ-glutamicacid，簡稱γ-PGA）是一種胺基酸聚合物，由L/D-穀氨酸通過γ-聚谷醯鍵連接而成，其分子量一般在100-1000KDa之間，相當於500-5000個穀氨酸單體聚合而成。γ-聚穀氨酸具有優良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產物為無公害的穀氨酸，是一種優良的環保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環境保護、食品、醫藥、農業、沙漠治理等產業均有很大的商業價值和社會價值。γ-聚穀氨酸的主要發酵方法有化學合成法、提取法和生物合成法。相比於生物合成法，前兩種方法工藝複雜、副產物多、產量低、環境汙染較大。目前，國內外主要是利用以芽孢桿菌為代表的微生物來發酵生產γ-聚穀氨酸。在二十世紀九十年代以來，科研工作者們在篩選γ-聚穀氨酸高產菌株及改善γ-聚穀氨酸的發酵工藝方面做了大量的研究工作。Kubota從土壤中分離得到一株BacillussubtilisF201，γ-聚穀氨酸的最大產量可達到50g/L。Yoon對BacilluslicheniformisATCC9945a利用高密度流加培養，在發酵35h後，γ-聚穀氨酸的產量達到最大值39g/L。江波等從土壤中篩選一株Bacillusmethylotrophicus，該菌株可不依賴於穀氨酸進行發酵，產量達到17g/L，其專利公開號為CN102268389。喬長冕等通過向培養基中添加硝酸鈉，調節聚穀氨酸合成酶的活性，提高了穀氨酸的轉化率，γ-聚穀氨酸的產量達到45-55g/L，其專利公布號為CN103695485。目前利用微生物發酵生產γ-聚穀氨酸的過程中，合成代謝途徑較為複雜，發酵液極其粘稠，發酵液的高粘度顯著降低了溶氧濃度，並大大增加了傳質阻力係數，使得氧氣供給困難，營養物質得不到有效利用。這極大地限制了菌體的生長代謝，最終導致γ-聚穀氨酸產量較低。因此，尋找一種改善培養菌體的低氧環境及提高發酵液的傳質係數，是目前發酵生產γ-聚穀氨酸亟待解決的問題。技術實現要素：為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在於提供一種高濃度γ-聚穀氨酸的發酵方法，該發酵方法可以解決菌體生長過程中供氧不足的難題，在低成本的液體培養基中實現γ-聚穀氨酸的高產。本發明的另一目的在於提供一種高濃度γ-聚穀氨酸。本發明的目的通過下述技術方案實現：一種高濃度γ-聚穀氨酸的發酵方法，包括如下步驟：（1）將產γ-聚穀氨酸的枯草芽孢桿菌接種到含有Span20的發酵培養基中進行發酵培養；（2）在發酵培養5-7h，添加一定量的正十二烷；（3）在發酵培養5-7h開始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；（4）從發酵培養18-24h開始，流加蔗糖溶液、穀氨酸鈉溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，發酵結束；（5）分離提取發酵液中的γ-聚穀氨酸。表面活性劑Span20具有改善發酵環境的作用，它的非極性端結合在菌體表面，能夠使菌體分散度增加，強化傳質效果。此外，Span20還能提高細胞膜的通透性，增加菌體細胞的攝氧速率。為了在不增加能耗的情況下，進一步改善菌體生長的低氧環境，本發明一方面進行了氧載體強化溶氧的研究，在載體中氧氣的溶解度比在水中的溶解度高很多。氧載體增加溶氧的方法與提高通氣量強化溶氧的方法相比，具有氧氣傳遞速率快、利用率高、能耗低、氣泡少、液體剪切力小等優點。因此，氧載體的方法非常適合應用於γ-聚穀氨酸的發酵生產，本發明選取了正十二烷進行研究，它與Span20共同作用取得了更佳的實驗效果。在另一方面，本發明通過添加合適濃度的H2O2來增加氧氣的供應，並對菌體細胞產生一定的氧化脅迫，刺激更多γ-聚穀氨酸的形成，此種方法具有成本低、效率高、環境汙染低、不增加能耗等優點。本發明與相應的不添加Span20、正十二烷和H2O2的方法相比可獲得更多的γ-聚穀氨酸，在本發明的具體實施方式中，γ-聚穀氨酸的產量達到55g/L左右。在本發明中，產γ-聚穀氨酸的枯草芽孢桿菌為本鄰域技術人員所熟知，如本發明
背景技術：
部分所提及的，本發明優選採用的枯草芽孢桿菌將在下文中更詳盡地描述；枯草芽孢桿菌的發酵溫度為34-38℃，本發明優選採用37℃。優選的，所述步驟（1）中，產γ-聚穀氨酸的枯草芽孢桿菌是於2014年5月20日保藏于波頓香料有限公司保藏中心的枯草芽孢桿菌PBS55，其保藏編號為CMCC3366。優選的，所述步驟（1）中，產γ-聚穀氨酸的枯草芽孢桿菌是在種子培養基中活化培養而獲得的，種子培養基包括如下組分：蛋白腖10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化鈉10-20g/L、硫酸鎂0.5-4g/L、磷酸二氫鉀1-8g/L和氯化銨2-10g/L，pH為6.0-8.0。更為優選的，種子培養基包括如下組分：蛋白腖為12-18g/L，酵母粉為6-12g/L，氯化鈉為12-16g/L，硫酸鎂1-3g/L，磷酸二氫鉀1.5-5g/L，氯化銨為3-6g/L，pH為6.5-7.5。在本發明中，如未特別指出培養基中的添加物，培養基僅僅是未添加相應添加物的培養基。優選的，所述步驟（1）中，發酵培養基包括如下組分：蔗糖30-100g/L、蛋白腖10-30g/L、酵母粉5-20g/L、穀氨酸鈉20-80g/L、硫酸鎂0.5-3g/L和磷酸二氫鉀2-5g/L，pH為6.5-7.5。更為優選的，所述步驟（1）中，發酵培養基包括如下組分：蔗糖40-100g/L、蛋白腖15-20g/L、酵母粉6-12g/L、穀氨酸鈉30-70g/L、硫酸鎂1-2g/L和磷酸二氫鉀2-3g/L，pH為6.8-7.2。優選的，所述步驟（1）中，培養參數為：培養溫度為34-38℃，攪拌轉速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。更為優選的，所述步驟（1）中，培養參數為：培養溫度為37℃，攪拌轉速350r/min，通氣量1.5vvm，罐壓0.08mPa。優選的，所述步驟（1）中，Span20的添加量為1-10ml/L；所述步驟（2）中，正十二烷的添加量為10-60ml/L；所述步驟（3）中，H2O2的添加量為3-20ml/L。更為優選的，所述步驟（1）中，Span20的添加量為2-6ml/L；所述步驟（2）中，正十二烷的添加量為20-40ml/L；所述步驟（3）中，H2O2的添加量為5-10ml/L。優選的，所述步驟（4）中，蔗糖溶液的質量濃度為45-55%，流加速度為每小時6-12mL/L；酵母粉溶液的質量濃度為15-25%，流加速度為每小時3-6mL/L；穀氨酸鈉溶液的質量濃度為45-55%，流加速度為每小時4-8mL/L。更為優選的，所述步驟（4）中，蔗糖溶液的質量濃度為50%，流加速度為每小時6-12mL/L；酵母粉溶液的質量濃度為20%，流加速度為每小時3-6mL/L；穀氨酸鈉溶液的質量濃度為40%，流加速度為每小時4-8mL/L。本發明在發酵罐上，通過連續留加底物方式控制菌體的生長和代謝，進一步促進了γ-聚穀氨酸的生成。分別在不同時間留加蔗糖、穀氨酸鈉和酵母粉等營養物質，在10-100L發酵罐中培養，γ-聚穀氨酸產量可達50g/L以上，比利用該菌種單批發酵產量提高了25%左右。本發明的另一目的通過下述技術方案實現：一種高濃度γ-聚穀氨酸，所述高濃度γ-聚穀氨酸根據上述所述的發酵方法製得。本發明的有益效果在於：本發明的發酵方法可以解決菌體生長過程中供氧不足的難題，在低成本的液體培養基中實現γ-聚穀氨酸的高產，還具有成本低、效率高、環境汙染低、不增加能耗等優點。附圖說明圖1是實施例2在10L發酵罐上不添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸的蔗糖、穀氨酸及γ-聚穀氨酸含量變化圖。圖2是實施例2在10L發酵罐上不添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸的DO及相關氧化酶酶活變化圖。圖3是實施例3在10L發酵罐上通過添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸的蔗糖、穀氨酸及γ-聚穀氨酸含量變化圖。圖4是實施例3在10L發酵罐上通過添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸的DO及相關氧化酶酶活變化圖。圖5是實施例4在10L發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產γ-聚穀氨酸的蔗糖、穀氨酸及γ-聚穀氨酸含量變化圖。圖6是實施例5在100L發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產γ-聚穀氨酸的蔗糖、穀氨酸及γ-聚穀氨酸含量變化圖。具體實施方式為了便於本領域技術人員的理解，下面結合實施例及附圖1-6對本發明作進一步的說明，實施方式提及的內容並非對本發明的限定。實施例1一種高濃度γ-聚穀氨酸的發酵方法，使用本發明所用菌種枯草芽孢桿菌PBS55進行不同處理的對比發酵，其中發酵方法1的過程如下：將在25%（v/v）的甘油中保藏好的菌種接種到液體種子培養基中，以37℃和搖床轉速180-220r/min，震蕩培養12-16h。然後將獲得的種子液以3%（v/v）的接種量，接種於發酵培養基中，以37℃和搖床轉速180-220r/min，震蕩培養60-80h。最後測定並計算發酵液中的γ-聚穀氨酸產量。其中，種子培養基的配方為：蛋白腖為12-18g/L，酵母粉為6-12g/L，氯化鈉為12-16g/L，硫酸鎂1-3g/L，磷酸二氫鉀1.5-5g/L，氯化銨為3-6g/L，發酵初始PH為6.5-7.5；發酵培養基的配方為：蔗糖為60-120g/L，蛋白腖為10-40g/L，酵母粉為5-20g/L，穀氨酸鈉為60-100g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，磷酸二氫鉀2-7g/L，發酵初始PH為6.5-7.5；更優選可以是如下配方：蔗糖為80-100g/L，蛋白腖為15-20g/L，酵母粉為6-12g/L，穀氨酸鈉為70-90g/L，硫酸鎂2-4g/L，磷酸二氫鉀3-5g/L，發酵初始PH為6.8-7.2。發酵結束後，測定發酵液黏度和γ-聚穀氨酸產量，並將發酵液稀釋15倍後，在660nm處測定其吸光值。發酵方法2、3、4的過程與發酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發酵培養基中還含有2ml/L、4ml/L、6ml/L的Span20；發酵方法5、6、7的過程與發酵方法1基本相同，所不同的是在發酵培養6h時，向發酵液添加了20ml/L、40ml/L、60ml/L的正十二烷；發酵方法8、9、10的過程與發酵方法1基本相同，所不同的是分別在發酵培養6h開始，每隔3h向培養基中添加5ml/L、10ml/L、15ml/L的H2O2，直到發酵結束；發酵方法11的過程與發酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發酵培養基中還含有2ml/L的Span20，然後在發酵培養6h向發酵液中添加40ml/L的正十二烷；發酵方法12的過程與發酵方法1基本相同，所不同的是在搖瓶發酵培養基中還含有2ml/L的Span20，然後在發酵培養6h向發酵液中添加40ml/L的正十二烷，並發酵培養6h開始，每隔3h，向發酵液中添加10ml/L的H2O2，直到發酵結束。結果如表1所示，在Span20、正十二烷和H2O2單獨作用下，γ-聚穀氨酸的產量均有不同程度的增加。其中，在Span20的作用下，發酵液黏度明顯降低，促進了營養物質的傳遞。在正十二烷、H2O2的作用下，培養系統的低氧環境得到了改善，有效地解決了發酵液中氧氣供應不足的問題。發酵方法11和發酵方法12的結果也表明，Span20、正十二烷和H2O2三者聯合作用，可以起到協同效果，極大地提高了γ-聚穀氨酸的產量。表1不同發酵方法下菌種生物量及γ-聚穀氨酸的產量發酵方法OD660發酵液黏度（mPa·s）γ-聚穀氨酸產量（g/L）10.47126.523.620.53219.727.230.48318.924.540.29814.319.850.49623.825.760.56327.231.670.55825.429.380.46828.731.590.45230.834.3100.38623.721.7110.57921.836.7120.53127.443.8實施例2在10L發酵罐上不添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸，發酵培養基配方為：蔗糖為100g/L，蛋白腖為20g/L，酵母粉為10g/L，穀氨酸鈉為80g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發酵培養基中，培養72h，培養溫度為37℃，發酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。發酵結果如圖1、圖2所示。結果表明，在不添加調節劑的情況下，γ-聚穀氨酸產量只有23.2g/L，DO從36h開始就低於20%，CAD和SOD的酶活力均較低，這極大地限制了枯草芽孢桿菌菌體的生長，從而影響最終γ-聚穀氨酸的合成。實施例3在10L發酵罐上通過添加調節劑單批發酵生產γ-聚穀氨酸，發酵初始培養基配方為：蔗糖為100g/L，蛋白腖為20g/L，酵母粉為10g/L，穀氨酸鈉為80g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發酵培養基中，發酵培養6h，向發酵液添加40ml/L的正十二烷，並發酵培養6h開始，每隔3h，向發酵液中添加10ml/L的H2O2，直到發酵結束。共發酵72h，發酵溫度為37℃，發酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。發酵結果如圖3、圖4所示。結果表明，在Span20、正十二烷和H2O2的共同作用下，培養環境有了很大改善，DO始終維持在20%以上，CAT和SOD酶活活性較高，有效地解決了γ-聚穀氨酸發酵過程中供氧不足的問題，γ-聚穀氨酸產量有了顯著的提高，達到42.8g/L。實施例4在10L發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產γ-聚穀氨酸，發酵初始培養基配方為：蔗糖為50g/L，蛋白腖為20g/L，酵母粉為10g/L，穀氨酸鈉為30g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發酵培養基中，發酵培養6h，向發酵液添加40ml/L的正十二烷，並發酵培養6h開始，每隔3h，向發酵液中添加10ml/L的H2O2，發酵溫度為37℃，發酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。當發酵培養18-24h左右時，糖濃度較低，發酵液PH上升至7.0以上時，開始分別流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的穀氨酸鈉溶液4-8ml/（L*h），流加至72h，發酵結束。發酵結果如圖5所示，通過流加補料的方式，營養物質得到充分利用，γ-聚穀氨酸的產量有了進一步的提高，達到55.1g/L。實施例5在100L發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產γ-聚穀氨酸，發酵初始培養基配方為：蔗糖為60g/L，蛋白腖為20g/L，酵母粉為10g/L，穀氨酸鈉為40g/L，硫酸鎂2g/L，磷酸二氫鉀3g/L，Span202ml/L，發酵初始PH為6.8，裝液量為5L。將培養好的種子液以3%（v/v）的接種量接種到發酵培養基中，發酵培養6h，向發酵液添加40ml/L的正十二烷，並發酵培養6h開始，每隔3h，向發酵液中添加10ml/L的H2O2，發酵溫度為37℃，發酵過程控制pH為6.5-7.2，攪拌轉速300-400r/min，通氣量1-2vvm，罐壓0.04-0.1mPa。當發酵培養18-24h左右時，糖濃度較低，發酵液PH上升至7.0以上時，開始分別流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的穀氨酸鈉溶液4-8ml/（L*h），流加至56h結束補料，繼續發酵至74h時，蔗糖和穀氨酸鈉消耗殆盡，結束髮酵。發酵結果如圖6所示，100L發酵罐的發酵結果與10L發酵罐的發酵結果相似。在流加補料發酵方式下，γ-聚穀氨酸產量達到57.3g/L，比添加調節劑的單批發酵提高了32%，比不添加調節劑的單批發酵提高了148%。上述實施例為本發明較佳的實現方案，除此之外，本發明還可以其它方式實現，在不脫離本發明構思的前提下任何顯而易見的替換均在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp