一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統及其製備方法

2023-11-02 18:41:47

專利名稱：一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥製藥領域，涉及蛋白質和基因工程藥物的納米乳新型載藥系統， 具體涉及一種蛋白質藥物新型納米乳載藥系統及其製備方法。
背景技術：
隨著生物科技及分子生物學的發展，越來越多的高純度蛋白質藥物出現並開始應 用於醫藥領域。蛋白質藥物與其他藥物相比，具有高活性、特異性強、低毒性、生物功能明 確、成本低廉、成功率高、安全可靠等優點，從而成為醫藥產品中的重要組成部分。自1982 年美國Lilly公司將第一個重組蛋白質藥物_重組胰島素投放市場來，以蛋白質藥物研發 為主的全球生物技術公司總數已近5000家，上市公司600餘家。到目前為止，全球已批准 適應症多達220種的150個蛋白質藥物上市，其產值和銷售額已超過400億美元。雖蛋白 質藥物發展迅速，但其研發方面還面臨著嚴峻和巨大挑戰，這根本原因在於以下自身特點 與不足(1)結構複雜，影響因素多，理化性質不穩定，質量不易控制和檢測，穩定性差，使 其保存、運輸過程均需低溫或凍幹，使用也不方便；(2) —些蛋白質藥物的分子量大，口服 給藥易受胃腸道PH、菌群及酶系統破壞，生物膜穿透性差，吸收困難，生物利用度低，非注射 給藥一般僅為百分之幾；(3)擴散差、分配係數小使其難通過生物屏障及脂質膜，傳遞效率 與靶向性較低；(4)顯著的肝、胃腸首過效應，經過首過效應後僅保留2 3% ； (5)生物半 衰期短，體內清除率高。由於蛋白質藥自身特點，用藥方式大多只能用頻繁地注射給藥，但 這往往會對患者造成費用高、順應差、安全性差、治療率低等問題。蛋白質藥物和其他藥物 一樣都要理想、合適的載藥系統，才能發揮出最佳的藥物效果。由於載藥系統是蛋白質藥物 研發是非常關鍵和重要環節，用藥物載藥系統來改變蛋白質藥物自身不足，成為當前研發 白勺 ^^ ； ^^ O由於蛋白質藥物不穩定性和成本原因，在研究中通常先要用蛋白質模型藥物進行 研究。因此，國內外蛋白質藥物研發中，通常用具有性質穩定，在多數生化反應中不發生作 用，價格低廉，蛋白分子量較小、溶解度較大、穩定性較好且容易較大量、高純度的製備的人 和牛血清白蛋白作為蛋白質藥物研發中標準的蛋白質模型藥物。同時，它還常被作為生物 相容性和水溶性的生物大分子被廣泛研究。由於蛋白質藥物的載藥系統是蛋白質藥物研發中重要和關鍵的環節，因此標準 的蛋白質模型藥物牛和人血清白蛋白的載藥系統也成為國內外蛋白質藥物研究的熱點。 以BSA為蛋白質藥物模型，國外內研究主要有胡凱莉(2009)製備的乳鐵蛋白修飾聚乳 酸-聚羥基乙酸和乳鐵蛋白修飾聚乳酸納米粒載藥系統[1]；張慧芳(2009)以丙烯酸和 N-乙烯基吡咯烷酮為反應單體，用原位聚合法製備BSA納米囊和微球[2]。薛璇(2008)制 備出粒徑為2.0 3. Oum，載藥量為14. 72%，包封率為92. 07%的BSA凝膠[3]；王黎(2007) 製備的BSA多囊脂質體M。Byimg Soo Kim(2009)用聚乳酸-聚乙二醇酸(PLGA)和聚乙烯 醇為材料，製備的用FITC標記的BSA微球[5] ；Yunqing Kang (2009)以聚L-丙交酯(PLLA) 材料，製備 1. 22um 的 BSA 微球[6] ；MarciIene Μ. A (2009)製備的直徑 170 520nm 的 BSA納米球[7] ；Yujun Wang (2009)用殼聚糖為材料，製備直徑為10 20nm的磁性BSA納米粒 [8] J. C. Gayet (1996)製備出 BSA-PEG 凝膠[9] ；Tse-Ying Liu (2005)製備含缺鈣性羥基磷 灰石BSA控釋系統_ ；M. Igartua (1998)用PLGA材料製備出粒徑在0. 6 2um的BSA微 球[11]；曹金娜(2009)製備的包封率為46. 82%的N-三甲基殼聚糖BSA脂質體[12]；夏洪 男(2009)用生物可降解材料PLG607材料，用溶劑揮發法製備了粒徑為40 70im，包封 率為46. 3%的BSA微球[13]；黃婉丹(2009)以PLGA為材料，製備復乳-溶劑揮發法製備 BSA-PLGA微球[14]；張良珂(2005)用Ca2+，Ba2+為交聯劑，製備果膠BSA凝膠微丸[15]；梁曉 暉(2008)製得平均粒徑為284. lnm，包封率為34. 21%,Zeta電位為+27. ImV的肝靶向BSA 脂質體[16]。國內專利主要有戴傳雲以磷脂和海藻酸鈉為材料，製備的BSA多泡脂質體 [CN1727001A]；張陽德的BSA納米粒[CN1736489A]；張麗娜以殼聚糖和海藻酸鈉為材料，制 備BSA微囊[CN1546557A]；王身國製備親水性藥物BSA釋放體系[CN1393217A]、脂肪族內 酯共混物釋藥體系[CN1393267A]和生物可降解持續釋藥體系[CN1393218A]；張政樸以四 臂型聚乙烯丙交酯為材料，製備BSA微球[CN1927906]；王榮民製備納米級BSA微球及納米 囊[CN101401490A]；杜予民製備羧甲基殼聚糖納米粒[CN100393782C]。以人血清白蛋白 (HAS)為藥物模型的主要有孟慧(2009)用PLGA、N-甲基_2_卩比咯烷酮、苯甲酸苄酯為材料 製備可注射HSA凝膠[17]。劉世芸(2009)以用聚乳酸為材料，用復乳法製備出粒徑在10 40 μ m，包封率為85. 25%，負載率為14. 52%的複合HSA微球[18]。總之，以牛和人血清白蛋白作為標準蛋白質模型藥物的蛋白質藥物載藥系統研究 主要集中在納米粒、納米囊、納米微球、微囊、多泡脂質體、脂質體；藥用輔料主要是PLA、 PLAG、PLG607、三甲基殼聚糖、殼聚糖、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚3-羥基丁酸酯、磷脂和海藻 酸鈉、PVP、PLLA等；製備方法多用復乳_溶劑揮發法、原位包合法、乳化交聯法、吸附法等。 這些載藥系統或藥用輔料、製備方法存在以下問題(1)藥物包封率及載藥量低；(2)使用 材料毒副作用較大，製備過程中有機溶媒殘餘量大，毒性大；(3)製造工藝複雜、條件要求 高、工藝操作時間長；(4)製備過程易破壞藥物；(5)具有突釋效應；(6)生物相容性不理 想，產率低、不易滅菌、穩定性和重複性差，難大規模生產；(7)原料價格昂貴，生產成本高。 用納米乳載藥系統可較好地解決。納米乳(Nanoemulsion)，曾稱微乳狀液、微乳液或微乳劑，現又稱納米乳液、納 米乳狀液、納米乳劑，是一個由油、水、表面活性齊U、助表面活性劑四個組分組成的、粒徑為 1 lOOnm、液滴多為球形，大小比較均勻，透明或半透明、具熱力學穩定和各向同性、熱壓 滅菌或高速離心穩定不分層的膠體分散系統。其具有的顯著特點有各向同性的透明液體， 熱力學穩定，經熱壓滅菌或高速離心不分層；自發形成、工藝簡單，易於製備、製備過程不需 特殊設備、製劑質量穩定；在一定程度上能保護藥物在胃腸、肝臟內免遭酶解，避免藥物首 過效應；粒徑小，增強藥物在胃腸道吸收，提高生物利用度；改變藥物在體內分布，具有一 定的組織與器官靶向性；對於易水解藥物保護作用，有緩釋作用。由於納米乳以上的顯著 優勢，因此在國內外研究如火如荼，尤其是在蛋白質藥物方面。研究主要有葛偉(2009) 製備了胃癌特異性(MAGE1-HSP70/SEA)納米乳疫苗，可明顯提高細胞的免疫應答，具有明 顯抗腫瘤活性[19』2°] ；Makidon(2009)製備了洋蔥伯克氏菌17kDa的外膜蛋白納米乳疫苗。 免疫後，可明顯提高CD-I小鼠血清的IgG和SIgA水平，增強抗體交叉中和反應水平[21]； Bielinska(2008)製備HIV gpl20重組抗原水包油納米乳[22] ；Paul E(2008)用大豆油、酒精為材料，製備出粒徑小於400nm無需注射的納米乳B肝疫苗。實驗證實該疫苗無毒、免疫 效果好、可產生長久的免疫力[23]；葛偉(2008)製備了腫瘤基因工程(MAGE-1/HSP70/SEA) 納米乳疫苗，口服、皮下、靜脈和腹腔注射4種途徑免疫C57BL/6小鼠後，都能有效地抑制腫 瘤生長[24]。Bielinska(2007)用非離子表面活性劑為原料，製備含炭疽芽孢桿菌保護性 抗原(rPA)納米乳[25]；孫玉靜(2005)包裹含腫瘤特異性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白與 適量超抗原SEA配比組成的複合抗原，製備出腫瘤基因工程納米乳疫苗。體內實驗表明能 顯著激活針對MAGE-I的細胞免疫反應，對小鼠腫瘤模型能產生明顯的治療效果[26]。師瑞 (2005)研製出胃癌MG7基因特異性納米乳疫苗具有將強的免疫原性和較強的抗腫瘤作用 [27]。Hamoudal (2001)製備I型單純性皰疹、流感病毒A和牛痘的納米乳疫苗[28]。上述用 納米乳作為蛋白質藥物的載藥系統成功研究為本發明提供堅實的理論基礎和可行性。

發明內容
理想藥物及其製劑應遵循「三效」、「三小」和「五便」原則，「三效」高效、速效、長
效；「三小」劑量小、副作用小、毒性小；「五便」生產、儲藏、運輸、攜帶、使用。而理想載藥 系統的則應具有(1)所用全部輔料均是藥用輔料，符合藥典標準、生物相容性好，安全無 毒副作用；(2)載藥量大，能滿足用藥要求；(3)包封率高，至少80%以上；(4)生產過程和 工藝簡單，易推廣、無有積溶劑殘留；(5)製劑質量穩定、安全，有效；(6)粒徑小，吸收快，在 體內維持時間長，且具有一定的緩釋和靶向作用。設計思路由於蛋白質藥物在醫藥製藥領域非常重要地位，其載藥系統成為研究 熱點。針對蛋白質藥物本身特點及載藥系統中存在不足與缺陷，根據藥物所遵循的三原則 和理想載藥系統的要求，利用現代納米乳技術對蛋白質藥物進行包裹，提出一種包封率高 和載藥量大、製備過程和工藝簡單、使用藥用輔料安全且無有機溶劑殘留，且可極大提高蛋 白質藥物的穩定性、成本低廉、便於應用和推廣的，粒徑在1 IOOnm範圍，符合納米乳質量 要求的蛋白質藥物新型納米乳載藥系統。實現上述目的的技術方案是一種蛋白質藥物新型納米乳載藥系統，由下列部分 組成0. 15%蛋白質藥物、10% 30%的表面活性劑、5% 25%的助表面活性劑、 3% 20%的油相、0% 10%的穩定劑，20% 70%的水相，所述表面活性劑為聚山梨酯 或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性劑為失水山梨醇脂肪酸酯或者C2 C4的一元醇或多元 醇，所述油相為食用藥用液體石蠟、食用色拉油或有機酸酯，所述水相為蒸餾水，生理鹽水， pH為6. 5 7. 5磷酸鹽緩衝液中的一種或幾種，所述穩定劑為甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。所述的蛋白質藥物包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、肌紅蛋白，或者水 溶性或難溶性蛋白質類似藥物，所述蛋白質藥物濃度範圍牛血清白蛋白1 10% ；胰島 素1 5% ；肌紅蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。所述聚山梨酯為吐溫-80、吐溫-85、吐溫60中的一種或幾種，所述聚氧乙烯脂 肪酸酯為聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一種及一種以上組合；其有效量為吐 溫-80 10 30%、吐溫-85 10 30%、吐溫60 :5 30%、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40) 10 30%、聚氧乙烯蓖麻油(EL35) :10 30%。所述失水山梨醇脂肪酸酯是司盤-85、司盤80和司盤60中的任一種及一種以上組 合；其有效量為司盤-85 5 15%、司盤80 5 15%、司盤60 5 10%。
所述C2-C4的一元醇或多元醇為無水乙醇、正丁醇、甘油、1，3-丁二醇、1，3-丙二 醇中的任一種，其有效量為無水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ； 1，3_ 丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。較優選組合表面活性劑與助表面活性劑的互配為吐溫80/司盤80、吐溫85/司 盤 85、RH40/ 丙二醇、EL35/ 丙二醇。所述有機酸酯為肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一種， 其中油相的有效量分別為IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、 GTCC :3 15%。所述穩定劑的有效量為甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、丙氨酸1 10%。優選EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，蛋白質藥物濃度4. 5%和生理鹽 水56. 5%，丙氨酸5%。所述納米乳的粒徑為1 lOOnm。所述納米乳載藥系統可以是上述納米乳的水和緩衝液無限稀釋液。本發明的另一目的是提供一種蛋白質藥物新型納米乳載藥系統的製備方法，具體 包括下列步驟1)按配方稱取蛋白質藥物、溶劑、表面活性劑、助表面活性劑、油相、穩定劑、水相2)將所述量的表面活性劑與蛋白質藥物混勻且使牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑讓蛋白質藥物完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和穩定劑，攪拌下緩慢加入處方量70%水相，得到澄清的 溶液；5)最後再加入餘量水相，混勻，得到澄清透明的納米乳。所述步驟⑵的混勻為4°C下，轉速為50 100r/m攪拌。所述步驟(4)中的攪拌為在25°C 37°C恆溫水浴下，轉速為100 200r/m攪拌。所述製備方法還包括納米乳的除菌、檢測和包裝步驟，所述除菌為採用0. 2μπι微 孔濾膜過濾。本發明的蛋白質藥物新型納米乳載藥系統是由表面活性劑、助表面活性劑、油 相、水相及穩定劑組成。製備出的該納米乳是粒徑在1 IOOnm間的乳滴分散在另一種液 體中形成的具有各向同性的熱力學穩定的膠體分散系統。處方設計原則納米乳作為藥物載體，首先應在國家食品藥品衛生藥用輔料目錄， 並符合藥物載體基本要求，即無毒、無刺激、無不良藥理作用、具有良好的生物相容性、不影 響主藥的藥效和穩定性；另外由於納米乳自身特性，它對各處方組成還有特殊的要求，在用 滴定法繪製偽三元相圖的基礎上，篩選出形成穩定的納米乳區的較大區域作為其最優化處方。表面活性劑是納米乳形成所必需的物質，其主要作用是降低界面張力形成界面 膜，促使納米乳形成；增加主藥的溶解性，確保製劑的穩定性。表面活性劑分為非離子型表 面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、嵌段共聚物、兩性離子表面活性劑、氟化 表面活性劑6類。目前較常用的脂肪酸山梨坦(親油性)、聚山梨酯(吐溫類，親水性)、聚 氧乙烯脂肪酸酯類(商品名Myr j，親水性)、聚氧乙烯脂肪醇醚類(商品名Brij，親水性)、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物類(聚醚型，商品名Poloxamer或Pluronic)、蔗糖脂肪酸酯類和 單硬脂酸甘油酯、琥珀酸甘油酯/Brii類和EmLphor、Labraso 1。但是表面活性劑的選擇決 定於所形成的納米乳的特性和使用目的。HLB值在4 7的表面活性劑可製備W/0型納米 乳，HLB值在8 18內的表面活性劑可製備0/W型納米乳。本發明採用高HLB值的表面活 性劑吐溫類和聚氧乙烯脂肪酸酯類，這些表面活性劑，無毒無刺激，生物相容性好，有一定 的營養作用，是製備各種納米乳的較好輔料。優選吐溫60、吐溫80、吐溫85、聚氧乙烯蓖 麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40)。納米乳的形成還要求有短暫的負表面張力。因此，常需要有助表面活性劑的參與。 助表面活性劑有三方面作用協助表面活性劑降低界面張力，降低表面活性劑分子間的排 斥力；增加界面流動性，減少納米乳形成時的界面彎曲能，使納米乳自發形成；調節表面活 性劑的HLB值，使表面活性劑在油-水界面有較大的吸附。最常用的是適宜HLB值的非離 子表面活性劑。本發明用目前最常用的司盤類(85、60、80)為其主要的助表面活性劑，同時 還加入具有增強助表面活性劑的作用的低鏈醇類溶劑(乙醇、甘油、1，3_ 丁醇、正丁醇，丙 二醇)，可讓納米乳中所使用的油相與界面膜上表面活性劑分子之間保持滲透和聯繫，並易 於與表面活性劑形成界面膜，從而更有利於納米乳的形成。本發明採用的油相有色拉油、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸/葵酸 三甘油脂(GT°C C)、藥用液體石蠟中等，這些油相材料均可食用，無毒無刺激，生物相容性 好，有一定的營養作用，是製備各種納米乳的主要醫藥輔料。本發明還加入少量的穩定劑O 10%，可讓本發明的劑型穩定性更好，便於儲存。本發明與其它現有技術相比，具有以下的有益效果1.解決蛋白質和基因工程藥物的穩定性差，製備蛋白質的納米乳可極大蛋白質提 高其穩定性。2.製備的蛋白質藥物新型納米乳載藥系統可進一步加入任意比例的水分稀釋，熱 力學性質穩定，可用微孔濾膜過濾除菌，易於製備、運輸和儲存、澄清透明的納米乳；3.解決目前蛋白質的藥物存在的藥物包封率及載藥量低，本發明製備的蛋白質藥 物新型納米乳載藥系統的載藥量大，包封率高，提高藥效。4.本發明所選擇的原料均是藥用輔料，製備過程不涉及任何有機溶劑，無殘留，安 全無毒，製備過程溫和，對蛋白質無破壞作用。5.本發明採用的配方和方法簡單可行、成本低廉，可以便於大規模工業化生產。


1.部分蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳外觀圖，圖中主要處方依次為1號為吐溫80、司盤80、IPM ；2號為吐溫85、司盤85、 IPM、3 號為PMH40/丙二醇、吐溫 85、司盤 85、IPM、4 號為EL35、丙二醇、IPM。2.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳透射電鏡圖，3.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳粒徑與粒度分布圖，4. BCA法檢測蛋白含量的標準曲線方程圖，5.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩定性部分研究結果圖，圖中1和2號處方質量穩定，3號發生明顯絮凝，4、5號變成半透明，有明顯破乳和乳析。6.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳室溫放置不同時間的SDS-PAGE圖，圖6從做左到右條帶次依次為最優含4. 5%的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納 米乳在室溫放置30、60、180、360d ；而相同質量比的牛血清白蛋白的溶液室溫放置30和 60d。7.不同pH下的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的電位，8.不同溫度下的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的粒徑，9.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的電泳分析其完整性圖，從左到右的順序依次為空白納米乳劑未破乳上清，空白納米乳劑未破乳沉澱，空 白納米乳劑破乳上清，空白納米乳劑破乳沉澱，蛋白分子Marker、蛋白質模型藥物牛血清 白蛋白納米乳劑未破乳上清，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑未破乳沉澱，蛋白質 模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳上清，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳沉 澱、牛血清白蛋白水溶液。10.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的免疫印跡分析其特異性圖，從左到右的順序依次為牛血清白蛋白水溶液，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米 乳劑破乳沉澱，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳上清，蛋白質模型藥物牛血清 白蛋白納米乳劑未破乳沉澱，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑未破乳上清，蛋白分 子預染Marker、空白納米乳劑破乳沉澱、空白納米乳劑破乳上清、空白納米乳劑未破乳沉 澱、空白納米乳劑未破乳上清。11.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳在體外抗腐蝕圖，從右到左的順序依次為條帶1和2分別為牛血清白蛋白水溶液放入水中0. 5h， lh,條帶3和4分別為牛血清白蛋白水溶液放入人工胃液中0. 5h，lh,條帶5、6、7分別為蛋 白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳處方1水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h，條帶8、9、10 分別為蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳處方2水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h。12.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳對正常小鼠口服後，IgG效價柱形圖，13.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳對正常小鼠口服後，IgG效價變化折線 圖。
具體實施例方式下面結合具體試驗例中選擇目前常用的兩種比較標準蛋白質模型藥物人和牛血 清白蛋白、肌肉紅蛋蛋白和胰島素共4種蛋白質藥物為本發明的納米乳載藥系統的藥物有 效成分；在實施例來用目前用的最多的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白為藥物載體，進一步 對闡述和證實蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統的有益效果。由於蛋白質藥物種類繁多， 不可能一一舉例，因此並不意味著本發明僅僅限於此。實施例實施例1 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(IOOg)1)稱取牛血清白蛋白5g、正丁醇5g、吐溫_8030g、司盤_8010g、藥用IPM 10g、蒸 餾水39g.2)將所述量的表面活性劑與牛血清白蛋白混勻，並在轉速為50 100r/m恆溫磁力攪拌器攪拌，溫度在4°C下先讓牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑和溶劑讓牛血清白蛋白完全溶解，得到澄清的溶 液；4)再加入所述量的油相和穩定劑Ig甘露醇，25°C 37°C恆溫水浴，並在轉速為 100 200r/m恆溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入約70%處方量蒸餾水，得到澄清的溶液；5) 最後再加入餘量的蒸餾水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最後用微孔濾膜過濾除菌，檢測質量合格後，灌裝、密封、保存。製備的蛋白質藥物牛血清白蛋白的納米乳載藥系統外觀黃色、澄清透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為4. 5%，包封率為93%，室溫和 4°C放置半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例2 蛋白質藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取人血清白蛋白lg、甘油5g、吐溫_8010g、司盤_805g、藥用液體石蠟5g、生 理鹽水69g，備用；步驟2)、3)同實施例1相同；4)再加入所述量的油相和穩定劑5g甘露醇，25°C 37°C恆溫水浴，並在轉速為 100 200r/m恆溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最後再加入餘量的蒸餾水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最後用微孔濾膜過濾除菌，檢測質量合格後，灌裝、密封、保存。製備的蛋白質藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為1. 9%，包封率為93%，室溫和4°C 放置半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例3蛋白質藥物胰島素納米乳載藥系統1)稱取胰島素0. 5g、無水乙醇5g、吐溫_6010g、司盤_805g、色拉油5g、甘氨酸5g、 蒸餾水69g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物胰島素納米乳載藥系統外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm間， 12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為0. 49%，包封率為99%，室溫和4°C放置半年 後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例4蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取牛血清白蛋白8g、丙二醇5g、吐溫-6030g、司盤_6010g、GTCC 10g、 ρΗ6· 80. OlM磷酸鹽緩衝液32g，備用；步驟2)、3)同實施例1相同；、4)再加入所述量的油相和穩定劑5g丙氨酸，25 V 37°C恆溫水浴，並在轉速為 100 200r/m恆溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最後再加入餘量的磷酸鹽緩衝液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最後用微孔濾膜過濾除菌，檢測質量合格後，灌裝、密封、保存。製備的蛋白質藥物胰島素納米乳載藥系統外觀深黃色、澄清透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為7. 2%，包封率為90%，室溫和4°C 放置半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例5 蛋白質模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取人血清白蛋白 4. 5g、l，3 丁二醇 10g、EL3520g、司盤 _8015g、GTCClOg、 pH7. 40. OlM磷酸鹽緩衝液37. 5g，備用；步驟2)、3)同實施例1相同。
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4)再加入所述量的油相和穩定劑3g甘氨酸，25°C恆溫水浴，並在轉速為100 200r/m恆溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最後再加入餘量的磷酸鹽緩衝液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最後用微孔濾膜過濾除菌，檢測質量合格後，灌裝、密封、保存。製備的蛋白質藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，實際載藥量4. 1 %，包封率91 %，室溫和4°C 放置半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例6 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取牛血清白蛋白 10g、l，3 丁二醇 5g、RH4027g、GTCC 3g、甘露醇 10g、 ρΗ7· 40. 05Μ磷酸鹽緩衝液45g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統外觀深黃色、澄清、透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為9. 1 %，包封率為91 %，室溫和 4°C放置三個月後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例7 蛋白質藥物胰島素蛋白納米乳載藥系統1)稱取胰島素2g、甘油10g、EL3530g、液體石蠟15g、甘氨酸IOg pH7. 40. IM磷酸 鹽緩衝液33g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為1. 76 %，包封率為88 %，室溫和4°C 放置半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例8 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取牛血清白蛋白15g、甘油10g、EL3530g、乙酸乙酯10g、0. 9%生理鹽水35g， 備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統外觀深黃色、澄清、透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為13.8%，包封率為92 %，室溫 和4°C放置三個月後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例9 蛋白質模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取人血清白蛋白10g、甘油5g、RH-4030g、司盤_855g、色拉油15g、pH6. 80. IM 磷酸鹽緩衝液30g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為8. 7%，包封率為87%，室溫和4°C 放置三個月後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例10 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取牛血清白蛋白lg、無水乙醇10g、RH_4014g、司盤_605g、油酸乙酯5g、甘氨 酸10g、蒸餾水55g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明，粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為0. 96 %，包封率為96 %，室溫和4°C 放置一年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例11 蛋白質藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統1)稱取肌紅蛋白10g、正丁醇10g、吐溫8020g RH-40 10g、司盤-80 5g、乙酸乙酯20g、丙氨酸lg、蒸餾水24g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm 間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為4. 25%，包封率為85%，室溫和4°C放置 一年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例12 蛋白質藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統1)稱取肌紅蛋白5g、吐溫8530g、司盤-8515g、IPM20g、蒸餾水30g，備用；步驟2)、 3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm 間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，載藥量為4. 35%，包封率為87%，室溫和4°C放置 半年後，納米乳無明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例13 蛋白質藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統1)稱取肌紅蛋白lg、甘油5g、吐溫8520g、EL3510g、司盤-855g、GTCC 15g、甘氨酸 lg、蒸餾水43g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同。製備的蛋白質藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，實際載藥量4. 5 %，包封率92 %，室溫和 4°C放置半年後，納米乳不發生明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例14 蛋白質模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統1)稱取人血清白蛋白5g、丙二醇10g、吐溫6010g、吐溫8015g、司盤-8515g、油酸 乙酯15g、甘氨酸5g、甘露醇5g、蒸餾水20g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同製備的蛋白質藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間，12000rpm, IOmin高速離心後不分層，實際載藥量4. 5%，包封率92%。室溫和 4°C放置半年後，納米乳不發生明顯的絮凝、分層和藥物析出。實施例15 蛋白質藥物胰島素蛋白納米乳載藥系統1)稱取胰島素5g、吐溫8510g、吐溫8015g、司盤_8515g、液體石蠟10g、甘氨酸5g、 甘露醇5g、蒸餾水35g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實施例1相同製備的蛋白質藥物胰島素納米乳載藥系統外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間， 12000rpm, IOmin高速離心後不分層，實際載藥量4. 5 %，包封率91 %。試驗例在以下的試驗例，主要用標準蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳為蛋 白質藥物的代表進行證明本發明蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統及其製備方法所帶來 的效果。試驗材料與儀器設備試驗材料牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, Fraction V, > 98% ), Sigma 公司生產；吐溫80、吐溫85、吐溫60、司盤80、司盤85、司盤60購至中國上海國藥集團；BCA 試劑盒，購至武漢博士德公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)，德國 BASF公司生產，購至北京鳳禮精求商貿有限責任公司；GTCC英國CRODA公司生產，購至北京 鳳禮精求商貿有限責任公司；乙酸乙酯、油酸乙酯均購至北京鳳禮精求商貿有限責任公司。 低分子蛋白Marker和預染蛋白Ladder Marker均購至Fermentas公司。儀器設備透射電鏡(荷蘭PHILIPS公司)；NanOZS90Zeta電位及粒度分析儀(英 國馬爾文公司)；SDS-PAGE電泳裝置電泳儀(Mini-Protein III)、半乾電轉儀、酶標儀、洗
12板機均是BIO-RAD公司；ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop公司)、藥物穩定檢測箱 等國家免疫製劑技術工程研究中心現有儀器。試驗例1 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白的納米乳製備及其理化性質檢測1.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白的納米乳最優處方的篩選油相的篩選選擇IPM(CH)、色拉油(C17 22)、乙酸乙酯(C4)、油酸乙酯(C20)、GTCC (C18)、 液體石蠟(C16 C20)等6種不同碳鏈長短的油，20°C黏度大小依次為液體石蠟(110 230mPas)、GTCC (25. 0 33. OmPas)、色拉油(8. 5mPas)、IPM (5 6mPas)、油酸乙酯 (5. 15mPas)、乙酸乙酯(0. 449mPas)。分別取上述6種油適量，分別置具塞錐形瓶中，加入過 量的牛血清白蛋白，4°C水浴，震搖24h到達平衡。用BCA法測定牛血清白蛋白在各種油相 中的溶解度。結果表明IPM(C14)、色拉油、乙酸乙酯、油酸乙酯、GTCC、液體石蠟分別為 0. 35mg/g、0. 15mg/g、0. 14mg/g、0. 13mg/g、0. 12mg/g、0. 08mg/g，在 IPM 的溶解度最大，為 0.35mg/g。這可能與IPM的碳鏈長短與黏度有關，有利於藥物在油相中的分布和溶解。因 此，選擇IPM作為蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的最優化油相。表面活性劑和助表面活性劑的篩選用篩選蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳 油相的方法對表面活性劑吐溫80、吐溫85、吐溫60、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化 蓖麻油(RH40)和助表面活性劑(CoSF)，即司盤80、司盤85、司盤60、以及乙醇、甘油、丙二 醇的同樣方法篩選牛血清白蛋白的飽和濃度。在用其較大濃度的表面活性劑和助表面活性 劑，全面設計實驗組，按 9 1、8 2、7 3、6 4、5 5、4 6、3 7、2 8、1 9，(SF 和CoSF的質量比)，稱取SF-CoSF，加入所選擇的油相，渦旋震蕩，滴加水，觀察各組的變化， 以離心(13，OOOrpm, 30min)穩定性和乳滴粒徑為主要的評價標準，從而確定出形成納米乳 的SF和CoSF。以表面活性劑/助表面活性劑(混合表面活性劑)、油相和去離子水作為等 邊三角形的3個頂點，繪製偽三元相圖，相圖每條邊上的點分別表示相應兩組分之間的比 例關係，相圖任意一點表示相應體系中各組分的質量百分含量。根據油、水、混合表面活性 劑在臨界點的質量分數，繪製偽三元相圖，確定最大的納米乳區。納米乳的評價標準評價標準為製備的液體呈澄清透明或半透明；有藍色乳光； 高速離心(13000r/m，30min)離心後，穩定不分層；平行光入射後有丁達爾現象；通過透射 電子顯微鏡和雷射粒度儀，檢測出乳滴在1 IOOnm之間。若製備的混合液體呈乳白色，平 行光入射後有散射現象，則為乳劑；若澄清透明、稠厚，則為凝膠。同時在相轉變過程還會產 生液晶。利用液晶有折光存在，在偏光顯微鏡檢測中，會出現明暗變化，所以往往用其來區 分液晶和凝膠，如發亮為液晶，不發亮的凝膠。對上述表面活性劑與助表面活性劑的溶解度測定結果是牛血清白蛋白在吐溫 80、吐溫85、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)、司盤80、司盤85、正丁 醇、丙二醇均有較大的溶解度(大於0.2mg/ml)，符合可以製備納米乳要求。但是根據其最 大的偽三元相圖區域，最終確定其表面活性劑與助表面活性劑互配較優組合為吐溫80/ 司盤80、吐溫85/司盤85、RH40/丙二醇、EL35/丙二醇。2.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳製備根據序貫設計思想，以水、油、SF/CoSF為三相，採用滴定法繪製偽三元相圖。選擇離心(13，000rpm，30min)穩定，直徑在1 IOOnm的納米乳區為處方候選區。精確稱取 處方量的牛血清白蛋白，處方量的表面活性劑與助表面活性劑(表面活性劑與助表面活性 劑為上述篩選出來的4種較優互配組合)，處方量的油相，先加入大約70%的水溶液或緩 衝液，攪拌均勻，最後逐步加入水或緩衝液，即得澄清透明的納米乳液，部分結果見圖1。從 圖1可看出，製備的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳外觀淡黃色澄清透明液體。根據 繪製偽三元相圖的最終表明製備的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的最優化處方為 EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，牛血清白蛋白濃度4. 5%和生理鹽水56. 5%，丙 氨酸5%。以下性能檢測如無表明處方均採用的該最優化處方。3.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的形態少量納米乳適量，用水稀釋100倍後，滴在覆有支持膜的銅網上，靜止IOmin後用 濾紙片吸乾，再滴加2%磷鎢酸(pH為7. 4)溶液於銅網上負染3min，自然揮幹，用透射電子 顯微鏡觀察並攝製照片，結果見圖2。結果表明，納米乳在電鏡下均呈圓球形，內部為油相，見圖2從電鏡下，隨機選取 不少於500個液滴測量粒徑，得納米乳液滴粒徑範圍在1 lOOnm，平均粒徑為21. 8nm。4.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的溶液顏色用蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳最優化處方製備的納米乳液均為淡黃色 澄清、均一、透明液體，根據《中國藥典》(2005年版)II部附錄IXA溶液顏色檢查法，配製黃 綠色調標準比色液。納米乳液顏色與黃綠色調1號比色液相比，不得更深。5.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的澄清度根據《中國藥典》(2005年版)II部附錄IXB澄清度檢查法下檢查，為澄清的溶液。 經蒸餾水稀釋後，即出現明顯的淡黃色的乳光。6.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的粒徑和粒度分布取模型蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳適量，用適量蒸餾水稀釋後用雷射粒度測 定儀進行測定，納米乳的粒徑與粒度分布見圖3。測定結果圖3表明，實驗製備的蛋白質模 型藥物牛血清白蛋白納米乳平均粒徑21. 81nm。小於50nm的粒子佔75% ；小於60nm的粒 子佔90%，可見製得的納米乳載藥系統的粒徑分布範圍窄，粒徑比較均勻。7.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的理化性質檢測考察了空白納米乳和模型蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳的黏度(旋轉式黏度 計)、折光率(25°C、阿貝折光儀)、電導率(電導率儀)、Zeta電位(電勢顯微電泳儀)。結 果見表1。從表1結果表明，藥物的加入使納米乳的電導率增加，Zeta電位減小，而黏度和 折光率無明顯變化(P > 0. 05)。表1納米乳的理化性質測定η = 3 (χ士 s)
樣品黏;Ι/πιιη2 折光率電導率/mS_1Zeta 電位/mV空白納米乳5.24±0.041.422±0.0021328±12.530.1&t0.03牛血清蛋白納米乳5.31±0.051.412±0.0142345±13.824.21±0.01 試驗例2 蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的質量檢測
1.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的載藥量和包封率和測定1)繪製標準曲線①實驗方法參照BCA蛋白試劑盒進行根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1 體積試劑B配製適量BCA工作液，充分混勻。②稀釋標準品溶液將凍幹的標準品用0. 9% NaCl稀釋成2000ug/mL的儲存液， 讓後 0. 9% NaCl 用將其稀釋成濃度分別為:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000ug/ mL。分別取25u L的稀釋不同濃度的標準品溶液的樣品分別添加到96孔的微孔中。③各孔加入200u L BCA工作液，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37°C放置30min。④用Nanodrop ND-1000C紫外分光光度計，選擇562nm為測定波長，根據吸光度值 與蛋白濃度之間的關係繪製標準曲線。繪製的標準曲線方程，見圖4，線性關係良好，標準曲線方程為Y = 0. 0008X+0. 1637 (R2 = 0. 9951，線性方程範圍25_1000ug/mL)，具有較高的相關性和較寬的 檢測範圍，因該檢測方法此可用於BCA檢測BSA的包封率和載藥量。2)蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳蛋白濃度的測定稱取製備好的模型蛋白質藥物牛血清白蛋白納米乳和空白的納米乳各三份，每份 lg(體積約Iml)。將其分別放置在無菌的3mlPE管中，用0. 9% NaCl稀釋稀釋到牛血清白 蛋白的理論值為250 500mg/ml，然後分別將稀釋好的牛血清白蛋白直接用無水乙醇按照 體積比為(1 2)加入後，搖勻使其破乳後，高速離心(13000，30min)，離心後取其上清和沉 澱，其中沉澱用上清液體中相同的體積的0. 9% NaCl進行稀釋，用BCA法測定破乳前的上 清液(C遊上)和沉澱中的牛血清白蛋白的濃度(C遊沉)、破乳後的上清液(C破上)和沉 澱中的牛血清白蛋白的濃度(C破沉)。根據稀釋倍數和體積量，各取25uL溶液，添加到96 孔板中，用BSA標準試劑盒檢測方法，測定其吸光度值，並將吸光度值代入標準曲線方程， 分別計算出破乳前牛血清白蛋白的在上清液中的質量(M遊上)和沉澱中的質量(M遊沉)、 破乳後的牛血清白蛋白在上清液(M破上)和沉澱中的牛血清白蛋白的質量(M破沉)。載藥量=[(M破沉)+ (M破上)]/M總X 100 %。包封率=[(M破沉)+ (M破上)-(M遊上)-(M遊沉)]/ [ (M破沉)+ (M破上)]X 100 %其中M總為稱取的納米乳總質量。試驗測定三批納米乳劑的載藥量分別為4. 5%,4. 3%,4. 4%平均值為4. 4% ；包 封率分別為98. 3%,97. 5%,93. 5%，其平均值為96. 4%。製備出的牛血清白蛋白具有較大 的載藥量，且包封率高達96. 4 %，完全符合納米乳的質量要求，且解決了目前牛血清白蛋白 的載藥量和包封率低的最大問題。2.蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩定性檢測按照《中華人民共和國藥典》2000年版附錄197頁相關規定進行，納米乳穩定性試 驗分為加速穩定性試驗及長期穩定性試驗兩部分。加速穩定性試驗取蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳適量3份，分別放置在 4°C、25°C、40°C、6(rC條件下，分別於5、10、30、45、60、90d取樣考察，首先對其外觀是否發 生明顯絮凝、分層、沉澱、乳析、破乳等及載藥量、包封率情況進行考察；分別將納米乳樣品 適量裝於離心管中，高速離心(13000，30min)，用上述相同的指標觀察進行考察。將納米乳 熔封於5ml安瓿瓶中，放置在自然光照射條件下，分別於l、3、7、10d取樣，對其進行外觀考
15察，觀察是否有渾濁、破乳、分層等現象。長期穩定性試驗取蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳適量3份，分別分別放 置在4°C、25°C、40°C、60°C條件下，分別於30d、60d、90d、180d、360d取樣考察對其進行外觀 考察，觀察是否有渾濁、破乳、分層等現象。同時放置室溫的30d、60d、180d、360d的蛋白質 模型藥物牛血清白蛋白納米乳和牛血清白蛋白水溶液的樣品按照載藥量和包封率檢測制 備的方法進行處理後的上清液用SDS-PAGE觀察牛血清白蛋白降解情況。見圖5和圖6，製備的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的外觀無明顯絮凝、分 層、沉澱、乳析、破乳，且其載藥量和包封率為發生明顯的改變。這表明製備的蛋白質模型 藥物牛血清白蛋白納米乳具有良好的穩定性。從圖6可看出，蛋白質模型藥物牛血清白蛋 白納米乳在室溫放置30、60、180、360d均有明顯的一條帶；而牛血清白蛋白的溶液在30和 60d有明顯一條帶，且在60d的條帶，蛋白質雖然為一條帶，但濃度減少，表明蛋白質明顯降 解。從圖6可看出，製備的蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩定性得到較高的提高。3.用電位及粒度分析儀檢測蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩定性取用蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳最優化處方製備的納米乳適量，用適量 蒸餾水稀釋後用雷射粒度測定儀，測定牛血清白蛋白的納米乳在不同溫度下的納米乳的粒 徑，其粒徑變化圖，見圖7和表2。從圖7的不同溫度下的納米乳粒徑圖可看出，隨著溫度升 高，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳的平均粒徑增大，但是當溫度大於80°C，其平均粒 徑小於30nm，當溫度高於80°C，其平均粒徑增大變化趨勢非常明顯，當溫度到90°C，其平均 粒徑還是小於lOOnm。圖7結果表明，蛋白質模型藥物牛血清白蛋白納米乳非常穩定，可以 室溫保存。表2不同溫度下的納米乳粒徑
權利要求
一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，其載藥系統組合特徵在於0.1％～15％的蛋白質藥物、10％～30％的表面活性劑、5％～25％的助表面活性劑、3％～20％的油相、0％～10％的穩定劑，20％～70％的水相；所述表面活性劑為聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性劑為失水山梨醇脂肪酸酯或者C2～C4的一元醇或多元醇，所述油相為食用藥用液體石蠟、食用色拉油或有機酸酯，所述水相為蒸餾水，等滲的生理鹽水、pH為6.5～7.5磷酸鹽緩衝液中的一種或幾種，所述穩定劑為甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，所述的蛋白質藥物 包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、肌紅蛋白，或者水溶性或難溶性蛋白質類似藥 物，所述蛋白質藥物濃度範圍牛血清白蛋白1 10% ；胰島素1 5% ；肌紅蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。
3.根據權利要求1所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，所述表面活性劑 為聚山梨酯為吐溫-80、吐溫-85、吐溫60中的一種或幾種，聚氧乙烯脂肪酸酯為聚氧乙烯 氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一種或其組合；其有效量分別為吐溫-80 10 30%、吐 溫-85 10 30%、吐溫60 5 30%、聚氧乙烯氫化蓖麻油10 30%、聚氧乙烯蓖麻油 10 30%。
4.根據權利要求2所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，所述助表面活性劑 為失水山梨醇脂肪酸酯是司盤85、司盤80和司盤60中的任一種及一種以上組合；C2 C4的一元醇或多元醇為無水乙醇、正丁醇、甘油、1，3_ 丁二醇、1，3_丙二醇中的任一種；其 有效量分別為司盤-85 5 15%、司盤80 5 15%、司盤60 5 10% ；無水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ；1，3-丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。
5.根據權利要求3所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，表面活性劑與助表 面活性劑的互配組合為吐溫80/司盤80、吐溫85/司盤85、聚氧乙烯氫化蓖麻油/丙二醇、 聚氧乙烯蓖麻油/丙二醇。
6.根據權利要求1 4任一所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，所述的有 機酸酯是IPM、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一種，其中油相的有效量分別為IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、GTCC :3 15%、藥用液體石蠟5 15%、 食用色拉油5 15%;所述穩定劑的有效量分別為甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、 丙氨酸1 10%。
7.根據權利要求6所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，蛋白質模型藥物牛 血清白蛋白4.5%、聚氧乙烯蓖麻油27%、丙二醇9%、肉豆蔻酸異丙酯3%、等滲的生理鹽 水56. 5%，丙氨酸5%。
8.根據權利要求1 7任一所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統，用水或緩 衝液無限稀釋，粒徑在1 IOOnm範圍。
9.權利要求1 7任一所述的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統的製備方法，具 體包括下列步驟1)按配方稱取蛋白質藥物、表面活性劑、助表面活性劑、油相、穩定劑、水相備用；2)將所述量的表面活性劑與蛋白質藥物混勻且使蛋白質藥物部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑讓蛋白質藥物在4°C下完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和穩定劑，攪拌下緩慢加入處方量70%水相，得到澄清的溶液；5)最後再加入餘量水相，混勻，得到澄清透明的納米乳。
10.根據權利要求9所述的製備方法，所述步驟(2)的混勻為4°C下，轉速為50 IOOr/ m ；所述步驟⑷中的攪拌是25°C 37°C下恆溫水浴，轉速為100 200r/m ；所述製備方法 中還包括納米乳的除菌、檢測和包裝步驟，所述除菌為用0. 2 μ m微孔濾膜過濾。
全文摘要
本發明的一種蛋白質藥物的新型納米乳載藥系統及其製備方法，主要用以標準蛋白質模型藥物牛血清白蛋白等為藥物模型，製備出了蛋白質藥物的納米乳載藥系統。其組合特徵在於0.1％～15％的蛋白質藥物、10％～30％的表面活性劑、5％～25％的助表面活性劑、3％～20％的油相、0％～10％的穩定劑，20％～70％的水相。本發明的蛋白質藥物納米乳載藥系統可較大提高蛋白質藥物的穩定性，保留良好免疫學與生物學活性，載藥量大、包封率高、製備工藝簡單、成本低廉、安全無毒、無有機溶劑殘留、便於運輸和儲存，較好地解決目前蛋白質藥物存在的穩定性差、藥效容易喪失、載藥量和包封率低、製備工藝複雜和有機溶劑殘留、毒性大等問題。
文檔編號A61K38/28GK101961314SQ20101029208
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者劉唯, 劉開雲, 孫紅武, 張衛軍, 毛旭虎, 鄒全明, 郭剛 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學