治療呼吸道分泌過多的組合物和方法

2023-11-07 13:47:47 2

專利名稱：治療呼吸道分泌過多的組合物和方法
治療呼吸道分泌過多的組合物和方法本發明受政府支持，在NHLBI資助的POl HL29594下完成。政府在 本發明中具有某些權利。發明領域本發明一般涉及用於治療呼吸道疾病的組合物和方法。背景呼吸道分泌過多是呼吸道疾病的特徵，包括慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、嚢性纖維化和哮喘。在患分泌過多的個體中，粘液堆積在呼 吸道中並引起呼吸道阻塞。沿所述呼吸道上皮排列的呼吸道黏膜下腺和杯 形細胞分泌粘液一一由水、碳7K化合物、蛋白質和脂質組成的粘性的、粘 彈性凝膠。在健康個體中，粘液是吸入的外源顆粒和病原體的第一道防禦 屏障。粘液捕獲這些顆粒和病原體並促進對它們的清除，同時也預防組織 脫水。含有許多杯形細胞的小呼吸道及外周呼吸道和那些不能通過咳嗽清 除的尤其易受粘液堆積和粘液逐漸阻塞。大量個體患有呼吸道分泌過多疾 病，因為它和許多呼吸道疾病相關，包括COPD、嚢性纖維化和哮喘及呼 吸系統感染，包括病毒性支氣管炎和細支氣管炎。在美國，大約1.42億人 已被診斷患有COPD。嚢性纖維化影響超過30，000美國人並且哞喘影響1.7 億美國人。皮質類固醇、抗膽鹼能藥、抗生素療法、支氣管舒張劑(例如曱基黃嘌呤)、 具有強p2腎上腺素能刺激性質的擬交感神經藥、氣溶膠送遞"粘液溶解" 劑(例如水、高滲鹽溶液)和口服施用祛痰劑(例如愈創甘油醚)。尤其關於嚢性纖維化，最近的方法已施用DNA酶來減少富含DNA的粘液或痰 的粘度，以更容易地從呼吸道中清除所述粘液(Shak等人，Proc. Natl. Acad, 87:9188-9192， 1990; Hubbard等人，N. Engl. J. Med" 326:812， 1991)。除 了藥療法，由拍擊法、振動療法和引流法組成的胸部理療也用於從呼吸道 中清除粘液。作為最後的依靠手段，肺移植對那些患有嚴重肺疾病的人可 以是個選擇。許多上面描述的藥療法具有嚴重的副作用。例如，吸入的皮 質類固醇能引起真菌性口炎(口部酵母感染)、咳嗽、或嘶啞並且全身的 皮質類固醇具有甚至更嚴重的副作用，如性發育延遲、月經周期改變、體 重增加及血糖增加(糖尿病)。曱基黃嘌呤的副作用包括嚴重的噁心、震 顫、肌肉顫搐、抽搐和心臟跳動不規則。例如在圖28中顯示的是病毒誘導的依賴EGFR和IL-13的途徑控制 上皮宿主和重塑的圖解。受體二聚化和受體酪氨酸激酶磷酸化作用激活 EGFR導致三條途徑的激活(1)募集Ral，隨後激活c-Src導致Statl 和Stat3的激活；(2)募集Shc/Grb2，接著激活Sos、 Ras和c-Raf導致 MEK1/2激活ERK1/2;和(3 )募集Gabl,接著激活PI3K導致產生磷脂 醯肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3，4，5-P3 ),激活PDK1/2並然後激活Akt，該Akt 使促凋亡因子(例如，Bad)失活。IL-13信號轉導也能激活ERK1/2和 PI3K及Stat6， ERK1/2、 PI3K和Stat6中的每一個促進基因(CLCA和 MUC )上調，促使纖毛轉分化為杯形細胞。IL-13信號轉導激活依賴IRS1/2 的至ERK1/2和Stat6的級聯，ERK1/2和Stat6中的每一個促進基因(CLCA 和MUC)的上調，促使纖毛轉分化為杯形細胞。在生理條件下，這些途 徑可(與Statl的依賴IFN的激活結合)導致免受病毒感染，但是如果在 敏感的遺傳背景下存在持續激活，該相同的途徑可導致纖毛細胞增生和杯 形細胞組織轉化。合理使用特異性抑制劑，例如EGFR和IL-13受體阻斷 劑，可完全恢復正常的上皮結構。已表明在大鼠中，上皮生長因子受體(EGFR)系統被其配體激活導 致在呼吸道上皮細胞中黏蛋白合成及杯形細胞組織轉化(Takeyama等人， Proc. Natl. Acad. Sci.， 96:3081-3086， 1999 )。此外，已表明健康個體的呼吸道中EGFR的表達稀少，但是所述受體在哞喘個體中表達(Burgel和 Nadel， Thorax, 59:992-996， 2004 )。刺激呼吸道上皮中EGFR表達的因子 或途徑為腫瘤壞死因子a (TNFa )途徑(Takeyama等人，Proc. Natl. Acad. Sci.， 96:3081-3086， 1999) 。 Nadel等人在美國專利號6,270,747中公開通過 施用EGFR拮抗物來治療分泌過多。白細胞介素-13 (IL-13)信號途徑與呼吸道重塑和分泌過多密切相關。 發現IL-13的誘斜受體(sIL-13Ra2-Fc )在小鼠中抑制變應原誘導的杯形 細胞的形成(Wills-Karp等人，Science, 282:2258-2261 )。已表明IL-13直 接驅動呼吸道上皮細胞中黏蛋白基因的表達，該呼吸道上皮細胞在生理條 件並在體內培養(Laoukili等人，J. Clin. Invest, 108:1817-1824， 2001 ; Kondo等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 27:536-541 ， 2002 )。也已經報 道IL-13刺激TGFa從人類呼吸上皮細胞膜上釋放，該TGFa結合到EGFR 上並激活EGFR (Booth等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 25: 739-743， 2001 ) 。 IL-13向大鼠肺的氣管內滴注通過複雜的機制引起杯形細胞的組 織轉化並增加l^蛋白產生，IL-13通過所述機制誘導產生IL-8，導致嗜中 性粒細胞募集(Shim等人，Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.， 280: L134-L140, 2001)。發明概述本發明的多個方面提供用於呼吸道分泌過多的改進治療。呼吸道分泌 過多的發病原理涉及EFGR和IL-13信號途徑，兩者都在杯形細胞形成中 起作用。因此，通過抑制EFGR和IL-13信號途徑，所述呼吸道上皮可更 接近它最初的結構。簡單而言，因此，本發明涉及治療個體呼吸道分泌過多的方法，所述方法包括施用EGFR信號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑。本發明還涉及治療呼吸道分泌過多的組合物，該組合物包含EGFR信號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑和藥學上可接受的載體。 其他目的和特徵將在下文中部分地明確並部分地指出。附圖簡述


圖1A、 1B、 1C、 1D、 1E和1F為C57BL/6J小鼠呼吸道切片的代表 性顯微照片，其中用SeV或等量UV滅活的SeV (SeV-UV)接種後21天 獲得所述C57BL/6J小鼠切片，然後進行EGFR和磷酸-EGFR ( p-EGFR) 免疫染色並用50倍抗原過剩竟爭。標尺-20jim。在實施例1中進一步描 述方法學。圖2A、 2B、 2C、 2D、 2E、 2F、 2G、 2H和21為小鼠呼吸道切片的代 表性顯微照片，該切片在用SeV接種後21天獲得，然後進行EGFR、卩 微管蛋白、CCSP和MUC5AC單獨和組合的免疫螢光染色。用抗CY3的 抗體(紅色螢光)檢測主要的抗EGFR抗體結合，用抗FITC的抗體(綠 色螢光)檢測其他。標尺-20jim。在實施例1中進一步描述方法學。圖3A、 3B、 3C和3D為呼吸道切片的代表性顯微照片，該呼吸道切 片在用SeV或SeV-UV接種後21天並然後用蘇木精/曙紅染色，進行卩微 管蛋白IV(綠色螢光)和CCSP(紅色螢光)免疫熒光染色，和進行MUC5AC 免疫染色後獲得。用非免疫IgG進行免疫染色在背景上不產生信號(數據 未顯示)。標尺-20pm。在實施例2中進一步描述方法學。圖4A和4B為條形圖，顯示的是圖3的條件下及SeV接種後第12天 不加處理和SeV接種後在第12天用EKB-569處理10-21天下對應的定量 數據。數值代表均值士SEM,並用(*)標明與SeV-UV對照的顯著差異。在 實施例2中進一步描述方法學。圖5A、 5B和5C為C57BL/6J和Balb/cJ小鼠中獲得的呼吸道切片的 代表性顯微照片，該小鼠在用SeV接種後指定天內獲得，並然後進行BrdU (圖5A)、磷酸EGFR (圖5B)和MUC5AC (圖5C )免疫染色。標尺= 20jim。在實施例2和3中進一步描述方法學。圖6為條形圖，顯示的是在圖5A的條件下對應的定量數據。數值代 表均值士SEM，並用(*)標明與O天的顯著差異。在實施例2和3中進一步 描述方法學。圖7為條形圖，顯示的是對從Balb/cJ小鼠中獲得的呼吸道切片的對應的定量形態計量，用SeV或SeV-UV接種該小鼠後21天，然後進行p 微管蛋白、CCSP和MUC5AC免疫染色。數值代表均值士SEM，並用(*) 標明與SeV-UV對照的顯著差異。在實施例2和3中進一步描述方法學。圖8A、 8B和8C為呼吸道上皮細胞(mTEC )培養物的代表性顯微照 片，該培養物置於氣液界麵條件下IO天，接著進行EGFR(上)免疫染色 或雙免疫螢光，接著對卩微管蛋白和EGFR或者p-EGFR的共焦顯微術。 在實施例2中進一步描述方法學。圖9是mTEC培養物的蛋白質印跡分析圖像，該培養物置於基礎培養 基中1天並然後在有或無伴隨抑制劑下用EGF (1或10 ng/ml)處理10 分鐘。在向兩個室中加入EGF前，將每種抑制劑以最高有效濃度加入到下 層室中6小時並在上層室中持續2.5小時。對於每一種情況，細胞裂解物 具有抗EGFR、 p- EGFR、磷酸Akt ( p-Akt)或磷酸—ERK1/2 ( p-ERK1/2 ) 抗體並通過增強的化學發光來檢測。在實施例2中進一步描述方法學。圖IOA、 IOB、 10C和10D為mTEC培養物的代表性顯微照片，用載 體或PD153035 (0.3 fiM)在37°C下處理該培養物7天，並然後進行p微 管蛋白和Hoechst 33432免疫螢光染色。標尺=20^111。在實施例2中進一 步描述方法學。圖ll為一系列條形圖，顯示的是用指示劑量的PD153035、 LY294002 和PD98059處理和不用其處理7天，p孩i管蛋白染色的細胞(以總Hoechst 染色細胞的a。/。表示)的定量分析。用(*)標明顯著差異。在實施例2中進 一步描述方法學。
圖12A、 12B、 12C、 12D、 12E、 12F、 12G和12H為mTEC培養物 的代表性顯樣吏照片，用載體、PD153035 (0.3 jiM) 、 LY294002 (50 jiM) 和PD98059 ( 50 jiM )在37°C下處理該mTEC培養物3天並然後進行活 性胱天蛋白酶3 (Act-C-3)剪切片段的免疫螢光染色或TUNEL反應。標 尺-20nm。在實施例3中進一步描述方法學。
圖13A和13B為條形圖，顯示的是使用
圖12的處理條件及PD15305 力口zVAD-fmk (lOOfiM)對
圖12中活性胱天蛋白酶3染色的細胞的定量8分析(以總Hoechst染色細胞的a。/o表示)。數值代表均值士 SEM，並用 (*)標明與僅僅載體的顯著差異。在實施例3中進一步描述方法學。
圖14為使用
圖12的處理條件對來自mTEC培養物的細胞裂解物中活 性胱天蛋白酶3 (Act-C-3)和胱天蛋白酶9 (Act-C-9)的免疫印跡分析圖 像。抗胱天蛋白酶9的抗體識別前體(C-9 )和活性胱天蛋白酶9 (Act-C-9 ) 的剪切片段。在實施例3中進一步描述方法學。
圖15為條形圖，顯示的是使用
圖12的處理條件對mTEC培養物的 JC-1染色的流式細胞術分析。數值代表線粒體膜電位(AYm)降低的細胞 的百分比，該線粒體膜電位的降低通過從FL2向FL1的偏移來檢測。數 值代表均值士SEM，並用(*)標明與僅僅載體的顯著差異。在實施例3中進 一步描述方法學。
圖16為mTEC培養物的代表性顯微照片，該mTEC培養物在有或無 IL-13 (100ng/ml, 5天)並隨後在有或無PD153035 (0.3 jiM, 3天)下 進行處理並進行MUC5AC (紅色)和活性胱天蛋白酶3 (綠色)免疫螢光 染色，並用Hoechst染料復染(藍色)。在實施例4中進一步描述方法學。
圖17A和17B為條形圖，顯示的是
圖16的對應定量數據。數值代表 活性胱天蛋白酶3陽性杯形細胞百分比(MUC5AC+活性胱天蛋白酶 3+/MUC5AC+細胞)和非杯形陽性細胞百分比(總TUNEL染色細胞/總 Hoechst染色細胞)的均值士SEM。用(*)標明與載體對照的顯著差異。在 實施例4中進一步描述方法學。
圖18A、 18B、 18C和18D為培養的mTECs在處理前(
圖18A)和用 IL-13 (100 ng/ml，在37。C下2天)處理後(
圖18B-18D )的代表性透射 電鏡顯微照片。用在細胞表面可見的纖毛鑑定早期纖毛-杯形細胞(也含有 少量粘液顆粒)(
圖18B);晚期纖毛-杯形細胞在細胞質中呈現更多數目 的粘液顆粒(
圖18C);並且成熟的杯形細胞含有特徵性的粘液顆粒並且 沒有纖毛(
圖18D)。在實施例4中進一步描述方法學。
圖19A、19B和19C是從小鼠中獲得的呼吸道切片的代表性顯微照片， 該切片在用SeV接種後第21天時獲得並進行p微管蛋白(綠色)和免疫螢光顯微術。箭頭指示的是P微管蛋白染色的 纖毛細胞(c) 、 MUC5AC染色的杯形細胞(g)及p微管蛋白和MUC5AC 均染色的細胞(cg)。在實施例4中進一步描述方法學。圖20A、 20B和20C為
圖19中獲得呼吸道切片的代表性顯微照片， 但是將p-EGFR (紅色)和MUC5AC (綠色)免疫染色。箭頭指示的是 p-EGFR染色的阡毛細胞(c) 、 MUC5AC染色的杯形細胞(g)及p-EGFR 和MUC5AC均染色的細胞(cg)。在實施例4中進一步描述方法學。圖21 A、 21 B和21 C為
圖19中獲得呼吸道切片的代表性顯^:照片， 但是將CCSP (綠色)和MUC5AC (紅色)免疫染色。箭頭指示的是CCSP 染色的(cc)或CCSP和MUC5AC均染色的細胞(ccg)。在實施例4中 進一步描述方法學。圖22為條形圖，顯示的是對表達MUC5AC的細胞(其CCSP或卩微 管蛋白也4皮免疫染色)的定量分析。數值代表均值士SEM，並用(*)標明與 相應的SeV-UV對照的顯著差異。在實施例4中進一步描述方法學。圖23 A、23 B和23 C為條形圖，顯示的是肺IL-13(圖23A )、mCLCA3 (圖23B )和MUC5AC (圖23C) mRNA水平(在用SeV接種後指定時 間由GAPDH對照水平校正)的實時PCR結果。數值代表均值士 SEM， 並用(*)標明與相應的SeV-UV對照的顯著差異。在實施例4中進一步描述 方法學。圖24為條形圖，顯示的是在接種後第12、 14、 17和20天受SeV感 染並用sIL-13受體拮抗劑(sIL-13Ra2-Fc)或對照IgG處理的小鼠呼吸道 中p微管蛋白(纖毛細胞)、CCSP (克拉拉細胞)和MUC5AC (杯形細 胞)免疫染色的定量分析。標尺-20nm。用(*)標明與相應的IgG處理的顯 著差異。在實施例4中進一步描述方法學。圖25A、 25 B和25 C為肺切片的代表性顯微照片，該肺切片從COPD 患者中獲得並進行p微管蛋白、MUC5AC或CCSP免疫染色並用免疫熒 光觀察(圖25A )，或者進行p微管蛋白和MUC5AC或CCSP和MUC5AC 免疫染色並用雷射共聚焦掃描顯樣i鏡觀察(分別為圖25B和圖25C)。箭頭和輪廓線指示的是表達MUC5AC的杯形細胞(g)、表達CCSP的克拉 拉細胞(cc)、共表達卩微管蛋白和MUC5AC的纖毛杯形細胞(cig)或 共表達CCSP的杯形細胞(ccg)。圖26 A、 26 B和26 C為人大呼吸道上皮細胞(hLAECs)的代表性顯 微照片，該人大呼吸道上皮細胞(hLAECs )從COPD患者中培養獲得， 用IL-13(100ng/ml)溫育5天，然後進行y微管蛋白(紅色)(圖26A )、 MUC5AC (綠色)(圖26B)及y微管蛋白和MUC5AC (圖26C )免疫 染色。箭頭指示的是y微管蛋白和MUC5AC免疫染色的細胞。圖27A、 27B、 27C和27D為hLAECs的代表性顯微照片，該hLAECs 從對照(非COPD )受試者中培養獲得，用IL-13溫育1天，如圖26中進 行免疫染色，然後用雷射共聚焦掃描顯微鏡在x-y軸(圖27A)和z軸視 圖上(圖27B-27D)進行觀察。箭頭指示的是y微管蛋白和MUC5AC均 免疫染色的細胞。圖28表示的是病毒誘導的依賴EGFR和IL-13的途徑的圖解，所述 途徑控制上皮宿主反應和重塑。圖29A、 29B、 29C和29D為從健康對照和哮喘受試者中獲得的支氣 管內活組織檢查切片的代表性顯微照片。用
圖1和圖2中相同的方法對切 片進行EGFR和磷酸化EGFR免疫染色。標尺-20jim。在實施例2中進一 步描述方法學。圖30A和30B為蛋白質印跡分析圖像，顯示的是在體外(圖30A)和 在體內(圖30B) EKB-569處理的影響。圖30A為人氣管支氣管上皮細胞 (hTECs)細胞裂解物的蛋白質印跡圖像，在氣液界麵條件下培養該 hTECs並在存在或不存在EKB-569 (1 jiM， 37°C下10分鐘)時，有或無 EGF (100ng/ml)或者有或無IL-13 (lOOng/ml)下溫育並用指定抗體進 行印跡。圖30B為肺裂解物的蛋白質印跡圖像，從C57BL/6J小鼠中獲得 該肺裂解物，其中C57BL/6J小鼠用SeV或SeV-UV接種並在接種後第 10-21天用或不用EKB-569處理。用指定抗體進行印跡。在實施例1和2 中進一步描述方法學。發明詳述如果未加檢查，免疫信號可導致慢性呼吸道疾病特有的上皮表型。尤 其是，導致慢性哞喘/支氣管炎疾病表型的持續的杯形細胞組織轉化依賴於纖毛上皮細胞依賴EGFR的存活和纖毛細胞依賴1L-13的轉分化為杯形細 胞(見例如實施例1和2 )。可通過定向抑制EGFR和IL-13信號途徑中 的信號轉導步驟來校正這種異常。用EGFR抑制劑處理允許所述纖毛細胞 向程序性細胞死亡前進，而IL-13阻斷阻止纖毛細胞向杯形細胞轉化(見 例如實施例2和3)。因此，如此處描述，阻斷EGFR和IL-13信號途徑 可將所述呼吸道上皮恢復到其最初的結構(見例如實施例4)。因此，本發明的一方面通過靶定所述EGFR和IL-13信號途徑來預防 性或治療性治療上皮增生和組織轉化。本發明的另一方面是靶定所述 EGFR和IL-13信號途徑的組合物，其可用於治療此處描述的上皮增生和 組織轉化。此類治療例如可用作預防性的治療來全部或部分保護免受慢性 哮喘和/或支氣管炎。所述組合物和治療也可用於例如治療性改善在哮喘、 支氣管炎、細支氣管炎、和/或相關炎症和感染性疾病(其特徵在於具有 EGFR激活、IL-13表達和杯形細胞組織轉化的相似模式)中改變的上皮 結構。所述組合物和治療也可用來治療呼吸道疾病或特徵為粘液分泌過多 的疾病。表明需要用EGFR和IL-13信號轉導抑制劑治療的疾病狀態和易於用 EGFR和IL-13信號轉導抑制劑治療的疾病狀態包括，例如慢性阻塞性肺 疾病、鼻分泌過多疾病(例如鼻變態反應)、炎性疾病(例如哞喘、支氣 管擴張和肺纖維化)和慢性阻塞性肺部疾病(例如慢性支氣管炎)及遺傳 疾病，包括嚢性纖維化、呼吸道的家族性非嚢性纖維化粘液濃縮、卡塔格 內症候群、a-l抗胰蛋白酶缺乏和觸發或引起分泌過多疾病的上呼吸道或 下呼吸道感染(例如病毒性細支氣管炎或鼻炎)。需要治療的確定將通常通過如下評估病史和體檢(其同過量產生粘 液(例如產生粘液的咳嗽)相一致)、呼吸道的放射照相或其他成傳^f究 (其指出過量產生粘液的疾病或狀況)或者肺功能檢測(指出呼吸道阻塞和/或高反應性證據)。在本發明的一個方面，所述方法包含通過施用EGFR信號轉導抑制劑 和IL-13信號轉導抑制劑降低上皮組織中EGFR和IL-13信號轉導的水平。 施用的量至少足夠預防纖毛細胞增加並且也預防纖毛細胞轉分化為杯形細 胞。在一項典型的研究中，在病毒感染後第12、 14、 17和20天用阻斷IL-13 的誘斜受體進行處理可有效預防病毒誘導的杯形細胞組織轉化，而從感染 後10-20天，用EGFR信號轉導的選擇性抑制劑每天處理引起纖毛細胞不 成比例的劑量依賴性損失，導致總的上皮細胞減少(見例如實施例4)。 這些結果表明用EGFR和IL-13信號轉導抑制劑進行處理可校正特徵在於 EGFR激活、IL-13表達和杯形細胞組織轉化的炎性疾病中的上皮結構。信號抑制劑EGFR或IL-13信號途'徑的抑制劑可直接或間接靶定與生物級聯相關 的任何因子或組分，該生物級聯可分別引起促進纖毛細胞的增加和杯形細 胞的組織轉化。EGFR信號轉導抑制劑包括靶定EGF、 EGFR、 EGFR配體(例如雙 調蛋白、HB-BGF和TGF-a) 、 EGFR表達的刺激物、EGFR的組分(例 如hev-l和hev-2 )和EGFR下遊信號組分的抑制劑。例如，EGFR信號 轉導抑制劑可靶定EGFR激活(例如受體二聚化或受體酪氨酸激酶磷酸化) 或可靶定激活觸發的一條或多條途徑(i) Ral募集，c-Src激活和隨後Statl 和Stat3激活；(ii)Shc/Grb2募集，Sos、 Ras和c-Raf激活和隨後ERK1/2 的MEK1/2激活；或(iii) Gabl募集，PI3K激活，隨後產生磷脂醯肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3，4,5-P3 )、激活PDK1/2並然後激活Akt (其失活促凋亡因子) (見例如圖8、 9、 lO和ll)。作為另一實例，可使用TNFa (呼吸道上皮中EGFR表達的刺激物) 的抑制劑來抑制所述EGFR信號途徑。類似地，所述抑制劑可靶定TNFa 下遊組分並實現抑制EGFR信號轉導。可通過依賴配體或不依賴配體的機 制激活EGFR，分別導致自磷酸化作用或轉磷酸作用。EGFR信號轉導的依賴配體的激活物包括氧化脅迫(見例如Takeyama等人，Am" J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.， 280:L165-L172， 2001)、紫外線和滲透脅迫、內皮 素l對G蛋白偶聯受體的刺激、溶血磷脂酸和凝血酶、ml毒萆鹼乙醯膽 鹼受體和人生長激素。IL-13信號轉導的抑制劑包括，例如靶定IL-4Ra、 IL-13Ral、 IL-4Ra 配體、IL-13Ral配體和下遊IL-13信號轉導組分的抑制劑(見例如圖4)。 例如，可通過靶定IL-4/IL-13受體來抑制IL-13信號轉導。或者，刺激所 述IL-4/IL-13受體表達的因子或途徑(例如IL-13 )是IL-13信號途徑抑制 劑的靭，標。IL-13途徑的其他激活劑包括IL-4和IL-9。作為另外的實例， IL-13信號轉導的抑制劑可靶定(i)IRSl/2募集，Grb2/Sos激活，Ras/c-Raf 激活和隨後ERK1/2和PI3K激活和/或(ii) Stat6激活，其中每一個Stat6 促進基因(例如CLCA和MUC)上調，促進纖毛轉分化為杯形細胞(見 例如圖4s)。 IL-13信號轉導的抑制劑也可靼定IRSl/2募集，PI3K激活， 隨後磷脂醯肌醇-3，4，5-磷酸(PI-3,4，5-P3)的產生，PDK1/2的激活和然後 Akt的激活，其失活促凋亡因子(見例如圖8、 9、 lO和ll)。也可使用EGFR和IL-13激動劑來抑制各信號途徑。EGFR和IL-13 的激動劑是分別模擬與EGFR和IL-13信號途徑相關受體相互作用的分 子。此類激動劑可以是信號分子類似物或片段、或針對受體上配體結合位 點表位的免疫肽、或針對特定免疫肽(其結合到與受體相互作用的部分) 的抗獨特型免疫肽。拮抗劑可以是蛋白質或結合分子(例如免疫肽)的形 式，其中蛋白質與受體結合竟爭但缺少激活受體的能力。抗IL-13信號轉 導激動劑的實例包括重組的可溶性IL-13受體cx2 Fc融合蛋白 sIL-13Ra2-Fc，其作為誘辨受體特異地阻斷IL-13的作用(見例如實施例 4)。EGFR和IL-13信號轉導抑制劑通常包括免疫肽、作為竟爭性或不可 逆的拮抗劑的小分子、反義寡核苷酸和小幹擾RNAs。免疫肽抑制劑EGFR和IL-13信號轉導的免疫肽抑制劑包括，例如多克隆抗體、單 克隆抗體和抗體片段。可通過本領域技術人員已知的任何合適的方法來產 生此類抗體；也可使用商業生產的抗體。本領域普通技術人員可從溫血動物如馬、奶牛、多種家禽、兔、小鼠 或大鼠容易地產生多克隆抗體。簡單而言，利用抗原與佐劑如弗氏完全或 不完全佐劑，通過經腹膜內、肌內、眼內或皮下注射來免疫所述動物。幾 次加強免疫後，收集血清樣品並檢測其對預期乾標的反應性。尤其優選的 多克隆抗血清將在一項這些測定中給出高於背景至少3倍的信號。 一旦所 述動物的效價在其反應性方面已達平臺，更多數量的抗血清可容易地通過 每周取血或對所述動物放血來獲得。可使用單克隆抗體(MAb )技術來獲得能夠幹擾EGFR和/或IL-13 信號途徑的MAbs 。作為EGF拮抗劑起作用的抗體的實例包括所述中和 抗EGFR的單克隆抗體C225( Kawamoto等人(1983) Proc. Nat，l. Acad. Sci. (USA) 80:1337-1341 ; Petit等人(1997) J. Path. 151 :1523-153，由ImClone Systems New York, N.Y.生產)和所述抗EGFR的單克隆抗體EMD55卯0(也被稱為Mab425) ( Merck， Darmstadt,德國)。簡單而言，使用來自 抗原免疫過的小鼠的脾細胞來產生雜交瘤。例如使用聚乙二醇融合方法(Galfre， G.和Milstein， C.， Methods Enzymol" 73:3-46 (1981))將每隻,皮免 疫過的小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0細胞融合。使用標準方法學(Galfre， G.和Milstein, C.， Methods Enzymol" 73:3-46 (1981))進行雜交瘤 的生長、HAT培養基上的選擇、克隆和篩選抗抗原的克隆。將在HAT選 擇的克隆注射到小鼠中，在其腹水中產生大量的MAb,如Galfre，G.和 Milstein, C.在Methods Enzymol.， 73:3-46 (1981)中描述，該MAb可通過使 用蛋白A柱層析法(BioRad， Hercules, Calif.)來純化。基於它們的(a)特 異性、(b)高結合親和力、(c)同種型和(d)穩定性來選擇MAbs。可使用多種 標準技術中任何技術包括蛋白質印跡(Koren，E.等人，Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))和酶聯免疫吸附測定法(ELISA) (Koren等人， Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))來篩選MAbs或檢測其特異性。這些單克隆抗體通常將以至少約lmM,更通常至少約300 jiM，通常至少 約10 jiM，更通常至少約30 nM,優選至少約10 jiM，並更優選至少約3jiM 或更多的Kd結合。希望生產並使用功能性抗體片段，例如Fab、 F(ab')2、 Fc和單鏈Fv (scFv)片段。這些片段將通常包括含有作為互補性決定區的氨基^列 段的高變區，其負責所述抗體對抗原分子上一個特定位點的特異性。用木 瓜蛋白酶進行的蛋白酶剪切產生兩個分開的抗原結合片段，稱為Fab片段， 其含有完整的輕鏈，該輕鏈通過二硫鍵連接鄰近重鏈的氨基末端部分。用 木瓜蛋白酶對典型的IgG分子進行蛋白酶剪切產生F(ab')2片段(實驗免疫 學手冊Vol 1 : Immunochemistry， Weir， D. M.,編者，Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986))。同樣，重組DNA方法允許產生並選擇重組 免疫球蛋白肽，其為單鏈抗原結合多肽，稱作scFv抗體(Lowman等人(1991) Biochemistry, 30， 10832-10838; Clackson等人(1991) Nature 352， 624-628; 和Cwirla等人(19卯)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87， 6378-6382 )。免疫肽抑制劑可以以例如每次注射約0.05 mg至約2.5 mg的量施用。 作為另外的實例，免疫肽抑制劑可以以每次注射約0.1 mg至約1 mg的濃 度注射。優選地，免疫肽抑制劑可以以每次注射約0.3mg至約0.5mg的濃 度注射。小分子抑制劑EGFR信號轉導的小分子抑制劑包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑。許多 此類EGFR酪氨酸激酶抑制劑為本領域已知並包括PD153035、 EKB-569 和AG1478 (4-(3-氯代苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)；非酚酪氨酸磷酸化 抑制劑類似物EGFR抑制劑RG-14620; EGFR受體激酶抑制劑酪氨酸磷 酸化抑制劑23 (RG-50810)、酪氨酸磷酸化抑制劑25 (RG-50875)、酪 氨酸磷酸化抑制劑46、酪氨酸砩酸化抑制劑47 (RG-50864; AG-213 )、 酪氨酸磷酸化抑制劑51 ( BIOMOL Research Laboratories, Plymoth Meeting, PA; BioSource International, Camarillo CA ) ; BIBX1522(Boehringer Ingelheim， Inc., Ingelhdm,德國)；CGP59326B (Novartis Corporation, Basel,瑞士 ) ； 4-氨基喹唑啉EGFR抑制劑(在美國專利號 5,760,041中描述)；取代的苯乙烯化合物，其也可以為萘、1，2-二氫化茚 或苯並嗜、溱，包括腈和molononitrile化合物(在美國專利號5,217,999有 描述)；在美國專利號5，773，476中公開的抑制劑；馬鈴薯羧肽酶抑制劑(PCI)、具有三個二硫鍵的39胺基酸蛋白酶抑制劑(Blanco-Aparicio等 人(1998) J Biol Chem 273(20): 12370-12377);鈴蟾肽拮抗劑RC-3095(Szepeshazi等人(1997)ProcNatlAcadSci USA 94:10913-10918);吡啶 並嗜咬、嘧，定並嘧咬、吡咯並嘧咬，如CGP 59326、 CGP 60261和CGP 62706及吡唑並嘧咬(Strawn和Shawver (1998) Exp.畫Opin. Invest. Drugs 7(4)， 553-573 ) ; 4-(苯氨基)-7H-吡咯並[2，3-d嗜啶(Traxier等人(1996) J. Med. Chem 39:2285-2292);薑黃色素(Korutla等人(1994) Biochim Biophys Acta 1224:597-600 ); (Laxmin arayana (1995)， Carcinogen 16:1741-1745); 等等。EGFR信號轉導的小分子抑制劑也包括G蛋白解偶聯劑蘇拉明鈉 (BIOMOL Research Laboratories, Plymoth Meeting, PA; BioSource International, Camarillo )。IL-13信號轉導的小分子抑制劑包括那些靶定下遊信號轉導抑制劑如 PD98059 (靼定MEK 1/2 — ERK 1/2 )和LY294002 (靼定P13K—AKT )。小分子抑制劑可以以每次給藥每kg受試者體重約0.1 fig至約100 mg 的量施用。衝支術人員將容易地理解劑量水平作為特定化合物、症狀的嚴重 程度和所迷受試者對副作用的敏感程度的函數而變化，如下文更全面的討 論。反義抑制劑反義寡脫氧核苷酸通過與互補的mRNA雜交並降低蛋白質表達以高 選擇性和特異的方式來抑制基因表達。反義寡核苷酸EGFR信號轉導抑制劑和它們的生產方法包括，例如那些在Kronmiller等人(1991) Dev Biol. 147(2)， 485-8; Hu等人(1992) lnt J Dev Biol. 36(4)， 505-16; Roy和Harris (1994) Molecular Endocrinology 8， 1175-1181; Casamassimi等人(2000)Ann畫Onco111(3)， 319-325; Normanno 等人(1996) Cancer Detection and Prevention 20(5); He等人(2000) World J Gastroentero 6(5)， 747-749; Riedel等人，Int J Oncol (2002) 21 ， 11-16; Zeng 等人(2002) J Exp Ther Oncol 2(3)， 174-186; Deng等人(2003) Di Yi Jim Yi Da Xue Xue Bao 23(9)， 877-81; Li等人(2002) Clin Cancer Res 8， 3570-3578 中描述的。反義寡核苷酸EbFR信號轉導抑制劑也包括那些通過與上面那 些方法相似的方法生產的抑制劑。在Zeng等人(2002) J Exp Ther Oncol 2(3)， 174-186中討論了 EGFR反義基因療法的安全與功效。反義寡核苷酸IL-13信號轉導抑制劑和它們的生產方法包括，例如那 些在Mousavi等人(2004) Iran. Biomed. J. 8(4)， 185-191中描述的。反義寡核苷酸可以以每天約10 jig至每天約3 mg的濃度通過玻璃體內 注射施用。例如，給藥劑量可為每天約30jtg至每天約300 ng。作為另外 的實例，反義寡核苷酸可以以每天約100jig施用。反義寡核苷酸的給藥可 作為單次事件或在治療時間過程內發生。例如，可以每日一次、每周一次、 兩周一次或每月 一次注射反義寡核苷酸。治療時間過程可以從約一周到約 一年或更多。在一個實例中，每天注射反義寡核苷酸，持續一年。在另外 的實例中，每6周注射反義寡核苷酸，持續48周。RNA幹擾可通過對患者施用治療有效量的小幹擾RNAs (siRNA)通過RNA幹 擾下調EGFR和IL-13信號途徑，該小幹擾RNA對這些途徑的組分如 EGF、EGFR、IL-13、IL-4Ra或L-13Ral是特異的。可從如Ambion( Austin, TX)的來源通過商業途徑獲得siRNA。所述siRNA可以通過適合於將織轉化和/或分泌過多區域處或其附近。例如，所述siRNA可通過基因槍、 電穿孔或通過其他合適的腸胃外或經腸給藥途徑如玻璃體內注射施用。RNA幹擾為通過雙鏈RNA ( dsRNA)特異地抑制帶有其互補序列的 基因表達的方法。所述基因的抑制抑制了對應蛋白質的產生。引入時，所 述長dsRNAs進入細胞途徑，該途徑通常被稱作RNA幹擾(RNAi)途徑。 首先，所述dsRNAs通過稱為切丁酶的RNA酶III樣酶加工為20-25個核 苷酸(nt)的小幹擾RNAs (siRNAs)(起始步驟)。然後，所述siRNAs 裝配到含有內切核糖核酸酶的複合體(稱為RNA誘導的沉默複合體 (RISCs))中，在該過程中進行解鏈。所述siRNA鏈隨後將該RISCs引 導至互補的RNA分子，在那裡它們剪切並破壞同源RNA (效應步驟)。 同源RNA的剪切發生在siRNA鏈結合的區域中間附近。優選地，所述 siRNA包含長度約17個核苷酸到約29個核苷酸、優選長度為約19到約 25個核苷酸的短雙鏈RNA，該siRNA可耙定到目的mRNA上。例如，所述siRNA的有效量為足夠引起目的mRNA的RNAi介導的 降解的量，或足夠抑制受試者中所述EGFR或IL-13信號途徑的量。通過 考慮因素如受試者的大小和體重；新血管形成或疾病侵入的程度；受試者 的年齡、健康和性別；給藥途徑；和所述給藥是局部的還是全身的，本領 域技術人員可容易地確定對指定受試者施用的本發明siRNA的有效量。通 常，siRNA的有效量包含在上皮細胞增生和組織轉化位點或其附近的細胞 間濃度為約1納摩爾(nM)至約100 nM，優選從約2 nM至約50 nM， 更優選從約2.5 nM至約10 nM。可考慮施用更多量或更少量的siRNA。所述siRNA可把定到任何mRNA目的序列中的任何一段大約19-25 個連續的核苷酸上。可進行人類基因組資料庫搜索(BLAST)來保證選擇 的siRNA序列不靶定其他基因轉錄物。例如在Elbashir等人((2001 ) Nature 411 ，494-498)中給出了選擇siRNA的目的序列的技術。因此，本siRNA的 有義鏈含有與EGF、 EGFR、 IL-13、 IL-4Ra或IL-13Ral的目標mRNA 中任何一段約19至約25個核苷酸連續序列同一的核苷酸序列。通常，目 標mRNA上的目的序列可選自對應於所述目標mRNA的給定的cDNA序 列，優選從起始密碼子下遊(即3'方向)50至100nt開始。然而所述目的 序列可定位在5'或3'非翻譯區，或定位在起始密碼子附近區域。治 療劑量和時間過程當用於此處描述的治療時，治療有效量的本發明化合物可以以純的形 式使用或此形式存在時，以藥學上可接受的鹽形式使用，有或無藥學上可接受的賦形劑。例如，本發明的組合物可以以足夠抑制EGFR信號轉導和 IL-13信號轉導或以減少EGFR和IL-13信號級聯引起的產物形成的量以 適用於任何醫學治療的合理的益處/風險比例施用。每種類型抑制劑的特定 劑量在上面有更全面的討論。然而，應了解本發明化合物和組合物的總的 每日使用將由主治醫師在合理醫學判斷範圍內決定。任何特定患者的特定治療有效劑量水平將依賴於多種因素，包括治療 的疾病和所述疾病的嚴重性；使用的特定化合物的活性；使用的特定組合 物；所述患者的年齡、體重、 一般健康、性別和飲食；給藥時間；給藥途 徑；使用的特定化合物的排洩速率；治療持續時間；組合使用或與使用的 特定化合物同時使用的藥物及其他醫學領域熟知的因素。例如，本領域技 術人員熟知的是化合物的開始劑量低於實現渴望的治療效果所需的水平並 逐漸增加所述劑量直至達到渴望的效果。如果需要的話，為給藥目的，可 將所述有效日劑量分成多次劑量。結果， 一次劑量組合物可含有此量或其 因數來組成日劑量。施用EGFR和IL-13信號轉導抑制劑可作為單個事件或在治療時間過 程內發生。例如，可每日一次、每周一次、每兩周一次或每月一次施用抑 製劑。對於治療急性疾病，所述治療時間過程將通常為至少幾天。某些疾 病的治療可延長几天到幾周。例如，治療可延長超過一周、兩周或三周。 對於更多的慢性疾病，治療可延長几周至幾個月或甚至一年或更長。根據此處給出的方法，通過施用EGFR和IL-13信號轉導途徑的抑制 劑阻斷、減少或下調EGFR和IL-13信號轉導來實現炎性疾病的預防性和 治療性治療，所述炎性疾病的特徵在於EGFR激活、IL-13表達和杯形細 胞組織轉化。治療給藥所述EGFR和IL-13信號轉導抑制劑可治療性作為外源性物質或內源 性物質使用。外源性物質是在體外產生或生產並施用於身體的那些。內源 性物質是通過某種類型的裝置(生物學的或其他)在體內生產或製備以向 體內或體內其他器官遞送的那些。外源治療EGFR和IL-13信號轉導抑制劑的安全並有效量是例如可在患者中導 致所希望的治療效果同時將不想要的副作用降到最少的量。所述劑量方案 將由熟練的臨床醫師基於如治療疾病的準確性質、所述疾病的嚴重程度、 所述患者的年齡和一般健康情況等等因素來確定。本發明組合物將包括一種或更多的EGFR和IL-13信號轉導抑制劑和 所述化合物的藥學上可接受的載體。可使用多種類型的載體。所述載體性 質可為含水的。所述化合物也可容易地摻進其他類型的組合物中，如懸浮 液、粘性或半粘性的凝膠或其他類型的固體或半固體組合物。懸浮液優選 為相對不溶於水的物質。本發明組合物也可包括多種其他成分，如緩沖劑、 防腐劑、共溶劑和粘性建立劑(viscosity building agent)。根據本領域技術人員已知的配製技術，在多種類型的藥物組合物中可 包含所述EGFR和IL-13信號轉導抑制劑。所選製劑的特定類型將依賴於 多種因素，如使用的EGFR和IL-13信號轉導抑制劑、劑量頻率和治療的 部位。例如，在溶液劑、混懸劑和其他適合局部應用於相關組織的劑型， 如組織灌洗液或對相關組織的注射劑中包含所述物質。可加入合適的緩沖 體系(例如磷酸鈉、乙酸鈉或硼酸鈉)來預防在l&存條件下的pH變動。因此通常需要防腐劑來預防在使用過程中微生物汙染。合適的防腐劑 的實例包括苯扎氯銨、硫柳汞、氯代丁醇、對羥基苯甲酸曱酯、對羥基 苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二鈉、山梨酸、polyquaternium-1或 其他本領域技術人員已知的試劑。此類防腐劑通常以基於所述組合物總重 量按重量計約百分之0.001至約1.0的水平使用。一些EGFR和IL-13信號轉導抑制劑可能在水中的溶解度有限並因此在所述組合物中需要表面活性劑或其他合適的共溶劑。此類共溶劑包括 聚乙氧基化蓖麻油、聚山梨醇酯20、 60和80; Pluronic註冊的TM F48、 F畫84和P-103 (BASF Corp.， Parsippany NJ.，美國)；環糊精；或本領域 技術人員已知的其他共溶劑。此類共溶劑通常以從約0.01至約2 wt. %的 水平使用。生理學上平衡的灌洗液可用作EGFR和IL-13信號轉導抑制劑的藥物 載體。如此處所用，術語"生理學上平衡的灌洗液"指適於在侵入的或非侵 入的醫學操作中保持組織的生理結構和功能的溶液。該類型的溶液將通常 含有電解質，如鈉、鉀、鈣、鎂和/或氯化物；能源，如葡萄糖；和維持所 述溶液的pH在生理水平或其附近的緩衝劑。多種該類型溶液為已知的(例 如乳酸鹽林格溶液)。BSS註冊的TM無菌灌洗液和BSS+註冊的TM無 菌眼內灌洗液(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex.，美國)為生理 學上平衡的眼內灌洗液的實例。期望用高於簡單的水溶液粘度的粘度增加所述活性化合物的組織吸 收，降低在配製製劑中的可變性，減少製劑懸浮液或乳液成分的物理分離 和/或另外改善眼科製劑。此類粘性建立劑包括，例如，聚乙烯醇、聚乙烯 吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素、羥乙基纖維素、羧曱基纖維 素、羥丙基纖維素或本領域技術人員已知的其他試劑。此類試劑通常以從 約0.01至約2 wt. %的水平^[吏用。本發明組合物可以包裝成多劑量形式。內源療法用於生產治療產物的基因治療的原理可用於遞送EGFR和IL-13信號 轉導抑制劑。在臨床環境中，可通過許多方法中任何一種方法(每種方法 為本領域已知)將治療性EGFR和IL-13信號轉導抑制劑的基因送遞系統 引入患者(或非人動物)。例如可通過遞送運載工具(稱為載體)引入EGFR 和IL-13反義核酸信號轉導抑制劑，其中所述載體可以為非病原病毒變種 (例如複製缺陷型鼠的逆轉錄病毒載體和腺伴隨病毒載體)、脂嚢泡(例22如脂質體、脂轉染和細胞轉染劑)、碳7jC化合物和/或編碼治療蛋白質或物 質的核苷酸序列的其他化學綴合物。作為另外的實例，可通過物理(例如 顯微注射、電穿孔和氣動"基因槍，，)、化學或細胞受體(例如基於受體的 內吞作用)介導的攝入將載體引入身體的細胞中。 一旦進入細胞內，所述 核苷酸序列在細胞(游離型)或核(細胞核)環境中可產生治療性物質。 游離基因通常在有限的時間內產生預期產物，然而核摻入的核苷*列可 長期，包括永久產生治療性產物。基因治療構建體的藥物製劑可基本上由在可接受的稀釋劑中的基因遞 送系統組成，或可包含緩釋基質，其中包埋所述基因送遞載體。或者，當 從重組細胞完整產生完整的基因送遞系統，例如逆轉錄病毒載體時，所述 藥物製劑可包含一種或更多產生基因送遞系統的細胞。也可通過遞送位點描述基因治療方法學。遞送基因的基本方法包括先 體外後體內基因轉移、體內基因轉移和體外基因轉移。在先體外後體內基因轉移中，從所述患者中取得細胞並在細胞培養基中生長。將所述DNA 轉染進入細胞中，並且使所述轉染細胞在數目上增多並然後再植入患者內。 在體外基因轉移中，所述轉化細胞為培養生長的細胞，如組織培養細胞， 並且不是來自特定患者的特定細胞。這些"實驗室細胞"經過轉染，並且選 擇所述轉染細胞並將其擴大用於植入患者或用於其他用途。體內基因轉移 涉及當細胞在患者體內內將DNA導入患者細胞。體內基因轉移也涉及使 用含有內皮特異性啟動子的基因治療載體將所述DNA特異性導入患者眼 睛內皮細胞。上迷所有三種廣義分類可用於實現體內、先體外後體內和體 外基因轉移。基因治療也考慮蛋白質或多肽的產生，其中細胞已經用編碼所述蛋白 質的天然存在的基因的遺傳序列轉化，即內源基因激活技術。已詳盡描述了本發明，顯然在不背離附加權利要求中定義的本發明範 圍下可以進行修改和改變。此外，應理解在本公開的所有實施例為非限定 性實施例。實施例下面的非限定性實施例用於進一 步闡述本發明。本領域技術人員應理行良好的方法，並因此認為構成了其實施的模式實施例。然而，考慮到本 公開內容，本領域技術人員應理解在公開的特定實施方案中可做許多修改， 並在不背離本發明精神和範圍的情況下仍得到同樣或相似的結果。 以下實施例中使用的方法儘管下述實施例使用的一些方法包含在所述實施例本身，也使用額外 的技術並且下面立即進行描述。 增殖標i己對於BrdU免疫染色，小鼠在安樂死前48小時、24小時和4小時經 腹膜內接受BrdU (100mg/kg)。根據製造商的方案，用抗BrdU染色試 劑盒(Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA )檢測BrdU。寸吏用與 EGFR免疫染色相同的方案用抗Ki67抗體(Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK)進行Ki67免疫染色，只是使用抗原暴露溶液(Vector Laboratories)預處理熱誘導的抗原回收。使用ABC方法(Vector Laboratories )用生物素化的抗小鼠PCNA抗體(DAKO公司，Carpinteria, CA)進行PCNA染色。呼吸道上皮細胞培養與處理如先前描述來建立小鼠氣管上皮細胞(mTECs)的主要氣液界面培養 物(You等人(2002) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283:L1315-1321)。從進行移植的COPD患者肺外植體中和從無肺疾病的 肺移植供體中採集氣管支氣管樣本並使用相同的培養條件建立人呼吸道上皮細胞培養物。在所有情況下，細胞在上層和下層隔室中補充了 lO^ig/ml 胰島素、10fig/ml轉鐵蛋白、0.1 ng/ml霍亂毒素、5 ng/ml EGF ( Bectin Dickinson, Bedford, MA) 、 30將/ml牛垂體浸膏和5% FBS的基本培養基 (含有30mMHEPES、 4mML-穀氨醯胺、3.5mMNaHC03、 0.01 %兩 性黴素B和青黴素/鏈黴素的DMEM/Ham，s F-12 )中生長。在所述細胞發展到跨膜電阻〉1000Ohn.cm2後，通過用PBS洗滌所述膜並將下層隔室中 的培養基更換成補充有2% NuSerum (BD Biosciences, San Diego, CA )的 基本培養基來建立氣-液界麵條件。為了刺激EGFR， 37°C下細胞在基本 培養基中溫育24小時並然後在含有向上層和/或下層隔室加入的EGF (1-100 ng/ml， Upstate Biotechnology, Lake placid, NY )的基本培養基中溫 育10分鐘。對於長期實驗，每天向下層隔室加入EGFR信號轉導抑制劑 或載體對照(0.1%DMSO),或者對於短期實驗，將其加入到向上層和 下層隔室中持續1.5到6小時。EGFR酪氨酸激酶抑制劑PD153(B5、 MEKl/2抑制劑PD98059、 EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478和PI3K抑 製劑LY294002來自Calbiochem ( La JoIIa， CA )，並且z-Val畫Ala-Asp氟 代曱基酮(z畫VAD-fmk)來自Enzyme Systems Products (Livermore, CA )。 在氣液界麵條件前24小時將來自Preprotech (Rocky Hill, NJ)的重組人 或小鼠IL-13加入到上層和下層隔室中並在整個實驗過程中將其維持在下 層隔室中。免疫細胞化學在4°C下用PBS洗塗培養的細胞兩次，25。C下在4%的多聚甲醛中固 定10分鐘，用PBS洗滌，並在-20。C用乙醇乙酸(2: 1，體積/體積) 透化處理5分鐘來進行TUNEL反應或在25。C下用0.2%的Triton-X透化 處理5分鐘來進行免疫染色。然後用PBS洗滌透化處理的細胞並進行所述 TUNEL反應(Intergen， Purchase, NY )或用2%的魚凝膠在25。C下封閉 1小時並與兔抗活性胱天蛋白酶3 (BD Biosciences, San Diego, CA)、兔 抗EGFR( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA )、兔抗p畫EGFR( Cell Signaling Technology, Inc.， Beverly, MA)、小鼠抗卩微管蛋白IV或兔抗 P微管蛋白(Sigma, St. Louis, MO )抗體在4。C下溫育過夜。用山羊抗小 鼠或驢抗兔FITC或CY3 二級抗體檢測一級抗體的結合。用4 pg/ml Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR)復染細胞來檢測核形態， 然後如上描述進行成像。25流式細胞術如上培養小鼠氣管上皮細胞並使用含有0.25%胰蛋白酶和0.1 % EDTA的細胞解離溶液(Sigma， St. Louis， MO)將其從Transwell培養物 中分離。用含有0.2% BSA的HBSS洗滌細胞並與5照/ml JC-l( Molecular Probes, Eugene, OR)在25。C下溫育15分鐘。使用FACSCalibur流式細 月包4義和CellQuest軟體(Becton Dickinson, Mountain View, CA)通過綠色 螢光(FL1)從低發射到高發射的移動來檢測線粒體膜去極化的細胞。電子顯微術如先前描述準備透射電子顯微術(TEM )用的膜上細胞(You等人(2004) Am.丄Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 286:L650畫657 )。簡單而言，用2.5% 戊二醛將樣品固定並用1.25%四氧化鋨染色。用2.0%鞣酸將細胞復染，封 閉用於切片，並在Zeiss 902型顯微鏡下成像。統計分析使用析因實驗沒計的單向方差分析法(ANOVA)對小鼠組織的組織 化學數值進行分析。如果單向分析能達到顯著性，可使用ScheffeF檢驗進 行ANOVA後平均值的比較。實施例1:纖毛上皮細胞上EGFR的持續激活由於常見人類副粘病毒(例如，呼吸道合胞病毒或間質肺病毒)通常 在小鼠中複製不充分，因此用小鼠副流感病毒(仙臺病毒；SeV)接種的小 鼠來評估小鼠呼吸道上皮中的EGFR行為。在該模式系統中，接種導致在 細支氣管黏膜內高效複製並隨後誘導免疫應答基因表達、免疫細胞滲透和 上皮的破壞(Walter等人(2001) J.Exp. Med. 193,339-352)。該宿主應答 允許接種後10-12天徹底清除SeV (Walter等人(2002). J. Clin. Invest. 110:165-175; Tyner等人(2005) Nat. Med. 11 :1180-1187 )。在一些小鼠品 系中所述損傷伴隨上皮修復並恢復正常呼吸道結構，但在C57BL/6J小鼠 中接種約21天後出現長期(可能永久性的)杯形細胞組織轉化(Walter 等人(2002) J. Clin. Invest. 110， 165-175 )。從Jackson實驗室(Bar Harbor, Maine)獲得C57BL/6J和Balb/cJ 小鼠並在無病原體條件下保持和監測，用於在如前述7周齡時進行研究 (Walter等人(2001); Walter等人(2002); Tyner等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321)。在含胚雞蛋中生長並收集SeV (Fushimi品系52) 用於提供病毒貯存液，使得5000 EID50( 50%雞蛋感染劑量)等同於2 x 105 PFU (空斑形成單位)。在氯胺酮/甲苯瘞喚麻醉下用30jilPBS將該接種 物或等量UV滅活的SeV鋒鼻遞送。在這些條件下，病毒組織水平在感染 後3-5天達到最高並且在第12天時病毒被徹底清除(Walter等人(2001); Walter等人(2002); Tyner等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321 )。崗 哨小鼠和實驗對照小鼠進行和接種小鼠同樣的處理並且未顯示接觸11種 齧齒動物病原體(包括SeV)的血清學和組織學證據。對於EGFR阻斷， 用EKB國569 (從Lee Greenberger， Wyeth Ayerst Pharmaceuticals, Pearl River, NY獲得;通過管飼法以20 mg/kg (在pH 2.0水中)給予)或用從感 染後10-21天每日給予的載體對照處理小鼠。對於IL-13阻斷，將可溶性 的融合Fc的鼠IL-13Ra2經皮下注射處理小鼠(sIL實施例2: EGFR的 抑制減少重塑上皮的13Ra2-Fc的方面；從Deborah Donaldson, Wyeth Ayerst獲得；在PBS中200 fig/小鼠)或用對照Fc在感染後12、 14、 17 和20天經皮下注射該小鼠(Donaldson(1998) J. Immunol. 161 ， 2317 )。對於全肺分析，將小鼠肺的左葉在含磷酸酶抑制劑混合物(Sigma ) 的RIPA緩沖液Page 16 (含1 % NP-40、 0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS的 PBS)中勻漿。在含有20 mM Tris-HCl、 150 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1 mM EGTA、 l%Triton-X100、 1.0 jig/ml亮抑蛋白酶肽、10fig/ml抑酶肽、0.2 mM苯甲基磺醯氟、lmM原釩酸鈉、0.1 mM氟化鈉、2.5 mM焦磷酸鈉 和ImM p甘油磷酸的細胞裂解緩衝液中收集氣管組織和mTECs。通過離 心除去細胞裂解物，並且將上清液蛋白質在4-15%梯度SDS-PAGE上分離 並轉移到PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA )。用抗EGFR、磷酸EGFR、 磷酸ERK1/2、活化的胱天蛋白酶3、磷酸-Stat6( Cell Signaling Technology Beverly, MA)、褲酸Akt ( BD Biosciences, San Diego， CA)、胱天蛋白酶9 ( Stressgen， San Diego, CA )和p肌動蛋白(Chemicon， Temecula， CA ) 的抗體印跡所述膜。用綴合辣根過氧化物酶的二級抗體和增強的化學發光 檢測一級抗體的結合(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)。在25-cm水壓下通過氣管內滴入4%多聚甲醛將小鼠肺固定。組織在 4。C固定過夜後，包埋於石蠟中，切成3-nm厚的切片用於蘇木精/曙紅染 色或免疫染色。對於人類組織，招募譯喘受試者(經過或未經過糖皮質激素治療)和 健康對照受試者，描述其特徵並如先前所述進行支氣管內活組織檢查 (Walter等人(2001); Sampath等人(1999) J. Clin. Invest. 103:1353-1361 ; Taguchi (1998) J. Exp. Med. 187， 1927-1940 )。簡而言之，對哮喘受試者 用吸入的丙酸氟替卡松(1760 jig/天)處理30天後進行支氣管內活組織檢 查，隨後中斷氟替卡松6周或直至呼氣流量峰值已降低25%並且1秒內強 壓呼氣量降低15%時進行支氣管內活組織檢查。所有受試者在之前三個月 內無呼吸系統感染史。用PBS洗滌支氣管內活組織檢查樣品並將其用10 %中性緩衝福馬林在25°C下溫育18小時，隨後進行如上述的組織化學。 此外，從經歷肺切除或肺移植的COPD患者中獲得肺組織樣品並對其進行 上述處理。對於免疫染色，將組織切片脫蠟，用梯度乙醇再水化並用疏水性膜 (ImmEdge PEN, Vector laboratories, Burlingame， CA)包圍。為進4亍抗 原回收，切片用終濃度為40 ng/ml(在PBS中)的蛋白酶K( Sigma， St. Louis, MO)消化5分鐘，並然後在3%過氧化氫(蒸餾水中)處理10分鐘來淬 滅內源過氧化物酶的活性。用含0.2% Tween 20的Tris緩衝鹽溶液(pH 8 ) (TBST )中的3% BSA和2%的山羊血清封閉非特異性蛋白質結合1小時。 在封閉緩沖液中稀釋一級抗體並對於人和小鼠組織切片以終濃度0.05或 0.1 ng/ml分別在4。C溫育過夜。使用來自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA )的兔抗人EGFR抗體SC-03檢測EGFR，該抗體針對 與鼠EGFR對應序列相同的胺基酸殘基1005-1016。使用來自Cell SignalingTechnology Inc. ( Beverly, MA )的兔抗砩酸EGFR ( Tyr845 )抗體#2231 檢測磷酸化的EGFR (p-EGFR)，該抗體針對砩酸化的Tyr84S。對於該抗 體，0.16和0.32 jig/ml終濃度分別用於人和小鼠組織。分別使用小鼠抗p 微管蛋白IVmAb (Sigma)、山羊抗克拉拉細胞分泌蛋白質(CCSP)抗 體(Santa Cruz Biotechnology)和小鼠抗人MUC5AC mAb 45M1 (Lab Vision Corp., Fremont, CA )鑑定纖毛細胞、克拉拉細胞和杯形細胞。為 了驗證特異性，切片也與用10倍過量的多肽抗原預吸收的一級抗體或非免 疫兔IgG (Santa Cruz)溫育。 一級抗體結合後，用TBST洗滌切片並然 後用生物素化的山羊抗兔IgG (2 fig/ml)溫育。4艮據生產商的方案(Vector Laboratories )用Elite ABC法和3，3'二氨基聯苯胺色原放大信號。切片經 蘇木精復染、脫水並用Cytoseal 60 ( St印hens Scientific, Riverdale， NJ)封 固。用與光學顯微術的免疫染色相同的方式進行免疫螢光檢測，只是在 Tissue-Tek OCT ( Sakura Finetek, Torrance, CA )中冰凍組織，用2%驢 血清(Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA )封閉切片，在250C 使用CY-3或FITC綴合的抗體(Jackson ImmunoResearch Labs )檢測一 級抗體的結合30分鐘，並用Hoechst染料33432( Molecular Probes, Eugene, OR)將切片復染。切片在接有數字顯微照相系統(Optronix CCD照相機 和Magnafire v2軟體)的光學或免疫螢光顯微鏡(Olympus Model BX-51) 下成像。如前所迷(Walter等人(2001); Walter等人(2002); Sampath等人 (1999))，在Macintosh電腦上使用公共區域NIH圖傳^呈序(由美國國立衛 生研究院開發並可從rsb.info.nih.gov/nih-image網址獲得)分析，通過對 肺部呼吸道中每mm基膜上的纖毛細胞進行計數來定量報導子。使用帶有 LSM-510軟體的Zeiss雷射掃描系統(Zeiss， Thornwood， NY)進行共焦顯微 術。識別呼吸道組織樣品中所述受體(結果未顯示)。抗EGFR抗體對呼吸道 組織的免疫染色結果表明EGFR表達主要集定位於纖毛上皮細胞頂膜 (epical membrane ),儘管其他細胞類型(例如，基細胞和呼吸道平滑肌細胞)也被;微弱地免疫染色(
圖1)。在SeV感染的小鼠和接種SeV-UV 的對照小鼠之間未觀察到抗EGFR免疫染色模式和水平上的顯著差異。與 "M目對，磷酸-EGFR的免疫染色(使用識別磷酸化Tyi^s的抗磷酸-EGFR抗體)表明與未接種或接種SeV-UV的對照小鼠相比，接種SeV後 約21天活化的EGFR水平持續升高。與EGFR表達模式類似，磷酸-EGFR 也主要定位於纖毛上皮細胞頂端表面，但在該情況下，頂端細胞染色也伴 隨在相同纖毛細胞群中對應的核染色(
圖1)。其他細胞類型(例如，基 細胞)也在核及胞質溶膠部位被微弱地免疫染色。該發現與活化的EGFR 核轉運的報導相一致(Lin等人(2001) Nature Cell Biol. 3:302-808)。該免疫 染色模式說明原始EGFR抗體主要識別非磷酸化受體。對於兩種抗體，通 過用對應抗原的預吸收可使免疫染色完全去除。此外，用正常兔IgG做為 陰性同種型對照並且未顯示高於背景的明顯信號。雙標記和用雷射掃描共 聚焦顯孩史鏡檢測的免疫焚光結果說明在小鼠呼吸道中EGFR與纖毛上皮細 胞的標記(如p微管蛋白)共定位，而不與克拉拉細胞的標記(如CCSP) 或杯狀細胞的標記(如MUC5AC )共定位(圖2 )。這與EGFR表達主 要定位於纖毛上皮細胞是一致的。小鼠中發現的EGFR免疫染色模式與人類受試者中結果類似。尤其是， EGFR表達也定位於正常受試者和哮喘受試者纖毛上皮細胞的頂細胞膜， 並且在也顯示杯狀細胞組織變形的哮喘受試者中磷酸EGFR增加(圖29)。 磷酸-EGFR的表達類似地定位於纖毛上皮細胞的頂端部分，並且表達伴 隨有在相同纖毛細胞中對應的核染色。此外，在正常受試者和哮喘受試者 的基細胞中也存在較弱的磷酸-EGFR免疫染色。實施例2:纖毛上皮細胞上EGFR信號轉導的功能作用 為定義持續的EGFR信號轉導在纖毛上皮細胞上的功能作用，用纖毛上皮細胞、克拉拉細胞和杯形細胞的標記對肺部切片進行免疫染色。組織製備和免疫染色如上描迷。在呼吸道上皮中發現的細胞類型的定量分析表明與接種SeV-UV的對照小鼠相比，SeV感染的小鼠在接種後第21天呈現(但到第12天未出現) 纖毛細胞和杯形細胞增加並伴隨細克拉拉細胞減少(圖3-4)。隨後確定 EGFR信號轉導對上皮結構中觀察到這些改變是否是必須的。從感染後第 10到21天每天使用口服施用的不可逆的EGFR抑制劑EKB-569來處理小 鼠，感染後第21天在整個小鼠肺部Akt的激活被完全抑制(圖30 )，表 明在這些條件下有效阻斷EGFR的促存活信號轉導。使用新的不可逆的 EGFR抑制劑(EKB-569)用於這些研究，該抑制劑選擇性抑制體外呼吸 道上皮細胞中EGFR信號轉導(圖30)。為實現體內阻斷，從接種後第 10天(為不幹擾病毒清除或上皮修復)到第21天(發生了重塑反應)每 天口服施用EKB-569。在這些處理條件下，EKB-569也阻斷體內的EGFR 信號轉導(圖30 )。還觀察到EGFR抑制劑處理幫助校正上皮重塑的所有三個方面。特別 是，觀察到纖毛細胞增加和克拉拉細胞減少的完全阻斷，和杯形細胞組織 轉化的部分但顯著地抑制(圖6) 。 EKB-569處理對呼吸道上皮細胞的總 數目沒有影響(在接種後笫21天用栽體處理後細胞角蛋白染色細胞為133 ±3，用藥物處理後每mm基膜為137±5),與其他上皮細胞(例如基細 胞和克拉拉細胞)群體中補償性變化一致。基於免疫組織化學數據(顯示 了在相同的纖毛細胞群體中EGFR的定位和卩微管蛋白的表達)，期望 EGFR阻斷可以影響纖毛細胞超常增生。然而，基於在任一種這些細胞類 型中相對缺少活化的EGFR表達，在克拉拉細胞或杯形細胞水平上中斷 EGFR信號的影響是不可預料的。設計進一步的實驗來更好地理解EGFR在慢性上皮重塑中的作用機 制。上皮增生可以是增加的'增殖或減少的細胞死亡的結果。因此，尋找在 上皮重塑的小鼠中增殖增加的證據。如先前所指出的，在感染後第5-12天 內有短暫的上皮增殖(由BrdU標記法標記)(圖5A和圖6; ( Look等 人(2001) Am. J. Pathol. 159， 2055- 2069 ))。為Ki-67和PCNA增殖標記 發現相同的免疫染色圖式(數據未顯示)。該增殖反應很可能允許替代那 些遭受直接細胞病變效應並且在病毒複製後緊接著發生免疫介導的細胞死亡的宿主細胞(Tyner，J.W.等人(2006) J. Clin. Invest. 116:309-321 )。並不驚奇的是，該修復期伴隨有EGFR在上皮細胞(通常為基細胞)及上 皮下(可能為免疫)細胞中的激活(圖5B)。然而，截至接種後第21天， 不再有進行中的增殖反應的證據，因為細胞增殖與未接種的對照小鼠沒有 差別(圖3A和3B )。此外，該替代期(由基細胞區域中BrdU攝入和EGFR 激活為標誌)在不產生長期的上皮重塑的小鼠品系(Balbc/J)中是相同的 (圖5A-5C、 6和7)。因此，該短暫增殖反應不能解釋隨後的只在遺傳敏 感的小鼠(C57BL6J)中發現的長期重塑。此外，缺乏進行中的上皮增殖 反應暗示纖毛細胞超常增生可能反映了基於在該上皮細胞亞群中細胞死亡 的抑制的依賴EGFR細胞的存活的選擇性增加。實施例3:培養物中的EGFR信號轉導和纖毛細胞存活 為確定EGFR是否為纖毛上皮細胞提供必要的存活信號，在組織培養 物中分析EGFR的阻斷，其中巨噬細胞的清除將不會使凋亡細胞的檢測變 得模糊並且其中可更好的定義信號轉導事件。初始實驗旨在確定EGFR是 否如在體內發現的那樣定位在培養物中的纖毛上皮細胞。使用從小鼠氣管 採集的呼吸道上皮細胞的氣液界面培養物在體外重構上皮系統。在該系統 中，纖毛細胞(p微管蛋白陽性)佔總細胞群體的45±1%,該水平與正常 小鼠呼吸道(大尺寸呼吸道佔36% )及以前報導的小鼠氣管樣品的數值相 似(Pack等人(1980) Cell Tissue Res. 208， 65-84 )。如在體內的情況，培 養物中纖毛上皮細胞呈現EGFR和磷酸-EGFR沿頂端細胞膜組成型表達 並且在該位置及細胞核(被配體激活後)發現磷酸-EGFR (圖5和數據 未顯示)。其他人^JlEGFR也可定位在培養的呼吸道上皮細胞中基底外 側的細胞膜上(Vermeer等人(2003) Nature 422， 322-326 ),但是任何差 別取決於培養條件、影響不同抗體識別的受體異質性或受體豐度(可影響 頂端與基底外側定位)(Kuwada等人(1998) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 275， C1419-C1428 )。隨後使用選擇性抑制劑處理來定義EGFR信號轉導在纖毛上皮細胞生長和存活中的作用。初始實驗使用培養物驗證抑制劑的特異性，首先從完全培養基中取出該培養物並然後用EGF刺激來將依賴EGFR的信號最大 化。在這些條件下，發現用PD153035抑制EGFR酪氨酸激酶阻斷了所有 的下遊信號，同時用LY294002抑制PI3K阻斷Akt的磷酸化作用並且用 PD98059抑制MEK1/2阻斷ERK1/2的磷酸化作用(圖5和圖6)。然後， 確定這些EGFR信號對纖毛細胞存活的影響。發現用PD153035處理引起 纖毛細胞不成比例的劑量依賴性損失，導致總上皮細胞減少(圖6和圖7)。 用另 一的EGFR特異性抑制劑AG1478獲得相似的結果(數據未顯示)。 確認EGFR的激活觸發若干下遊信號途徑，然後用PI3K和MEK1/2的抑 製劑處理小鼠氣管上皮細胞(mTEC)培養物並發現只有用LY294002處 理才引起纖毛上皮細胞相似的損失(
圖11)。由於該培養體系不顯示顯著 的高密度細胞生長，很可能顯得纖毛上皮細胞的損失是由於細胞存活降低造成o隨後檢測EGFR信號轉導的阻斷是否導致在程序性細胞死亡水平上一 致的變化。與纖毛上皮細胞損失平行的是，在相同的細胞損失模式中觀察 到胱天蛋白酶3的快速激活和TUNEL陽性細胞(6小時內)，即當EGFR 或PI3K而不是MEK1/2信號轉導蜂皮阻斷時(圖8 )。在該背景中，TUNEL 陽性細胞進行程序性細胞死亡，因為該過程通過胱天蛋白酶抑制劑 z-VAD-fmk處理4皮阻斷(圖9 )並與胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9剪切/ 激活(圖IO)及線粒體膜電位喪失(圖ll)相關。這些結果因此確定EGFR 信號途徑，該途徑通過選擇性的PI3K信號轉導至下遊因子(其阻止線粒 體功能異常和因此程序性細胞死亡)保護纖毛細胞免受程序性細胞死亡。 這些發現與對EGFR和ERK1/2的其他受體信號(在其他環境中預防細胞 死亡)的報導有些對立(Tyner等人(2005) Nat. Med. 11 :1180-1187; Monick等人(2005) J. Biol. Chem. 280:2147-2158; Roux等人(2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68:320-344)。實施例4:體外和體內的EGFR信號轉導和杯形細胞的組織轉化如上面指出，EGFR信號轉導對纖毛細胞的作用不能容易地解釋 EGFR阻斷對體內杯形細胞組織轉化的影響。選擇性EGFR的表達和隨後 在纖毛細胞的存活功能解釋了纖毛細胞增生的抑制作用，但是不直接解釋 杯形細胞組織轉化的阻斷。隨後質疑的是EGFR是否仍對杯形細胞存活具 有相似的功能影響。利用伴隨的研究檢測這種可能性，該研究確定病毒感 染後杯形細胞組織轉化的IL-13依賴性(未發表的觀察結果，EY Kim和 MJHoltzman)。該效應器途徑因此與變應原攻擊後黏蛋白產生的研究中 確定的途徑重疊(Grunig等人(1998) Science 282， 2261-2263; Wills-Karp 等人(1998) Science 282， 2258-2261 )。此外，認識到IL-13處理能夠刺激 呼吸道上皮細胞中杯形細胞的形成，該呼吸道上皮細胞從豚鼠和人 (Laoukili等人(2001) J. Clin. Invest. 108:1817-1824; Kondo等人(2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:536-541; Atherton等人(2003) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285:L730- L739 )及小鼠(未發表的觀察， JD Morton和MJ Holtzman )中獲得。用IL-13處理培養的小鼠氣管上皮 細胞，並通過MUC5AC的表達來標記杯形細胞的隨後發展(Nakanishi 等人(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98， 5175-51809; Zhou等人 (2001) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25， 486-491 )。因為TUNEL反應的程 序減少黏蛋白含量，所以用胱天蛋白酶3的激活追蹤細胞死亡。與纖毛細 胞相反，發現杯形細胞不顯示出響應EGFR抑制引起的細胞死亡率增加(圖 12)。對MUC5AC陽性相對於MUC5AC陰性群體中活性胱天蛋白酶3 細胞的水平進行定量表明在EGFR阻斷或未阻斷的杯形細胞中程序性細胞 死亡的水平相似，然而在這些處理條件下非杯形細胞(如纖毛上皮細胞) 顯示出顯著的胱天蛋白酶陽性染色(圖5C)。此外，用IL-13處理或未處 理的非杯形細胞死亡的水平相似，表明對杯形細胞形成的依賴IL-13的作 用沒有影響纖毛細胞中的死亡途徑。由於EGFR阻斷沒有引起對體外杯形細胞存活的影響，可以推論的是 EGFR阻斷對體內杯形細胞組織轉化的強烈影響可能是在纖毛細胞增生的 EGFR阻斷的下遊。對這種可能性的支持來自下一步的發現IL-13處理導致短暫具有纖毛細胞和杯形細胞特徵的細胞的A艮。因此，mTEC培養 物的電子顯孩支鏡術提供了在IL-13影響下保持纖毛和逐漸產生粘液顆粒的 纖毛-杯形細胞亞群的證據(
圖18 )。在IL-13處理的起始後早期(1-2天) 這些過渡型細胞最顯著，而沒有纖毛的成熟杯形細胞在處理晚期(5天) 最多。在這些條件下纖毛-杯形細胞的形態特徵與含粘液顆粒的纖毛細胞相 似，該粘液顆粒在變應原激發的小鼠呼吸道中通過電子顯微術發現 (Hayashi等人(2004) Virchows Arch. 444:66-73 )。由於在利用IL-13處理來促進杯形細胞形成的條件下在否則將產生纖 毛細胞的環境中建立了呼吸道上皮培養物，這些纖毛-杯形細胞可能是通過 IL-13轉向以從纖毛細胞轉分化為杯形細胞表型。用切片證實在體內也發 生相似的轉分化可能性，該切片從SeV接種後顯示杯形細胞組織轉化的小 鼠中獲得。共聚焦顯微鏡術顯示，儘管大多數纖毛細胞或杯形細胞分別表 達P微管蛋白或MUC5AC，但是存在上皮細胞亞群表達p微管蛋白和 MUC5AC (
圖19)。類似地，共聚焦圖像也顯示， 一般而言纖毛細胞表達EGFR而杯形細胞不表達EGFR，但 是額外的細胞亞群表達EGPR和MUC5AC (圖20)。在每種情況中，使 用沿z軸多個共聚焦切片和三維重建來證實在單個細胞中的共定位。表達 MUC5AC和p微管蛋白和/或MUC5AC和EGFR的亞群似乎處於過渡中， 因為它們在黏膜上皮層中不像在成熟杯形細胞中發現的那樣能經常達到它 們特徵性的形狀和位置。此外，在這些過渡型細胞中，相對於完全分化的 杯形細胞的更頂端定位，所述粘液顆粒通常定位在細胞的更基底隔室。該 形態行為也暗示這些纖毛-杯形細胞代表杯形細胞的前體。如先前對變應原 誘導的杯形細胞組織轉化指出的，也在檢測纖毛-杯形細胞(圖23 )可相當 的水平上檢測到共表達CCSP和MUC5AC的上皮細胞亞群(圖21)。下一步目標是確定IL-13是否如已在體外觀察到的那樣也促使纖毛細 胞在體內形成杯形細胞。這些實驗利用重組的可溶性IL-13受體a2 Fc融 合蛋白(命名為sIL-13Rai-Fc)，其被遞送給小鼠時作為誘鉺受體特異阻 斷IL-13作用(Grunig等人(1998) Science 282， 2261-2263; Wills畫Karp等人(1998) Science 282， 2258-2261 )。選擇與那些用於EGFR阻斷相似的處 理條件，所以在病毒接種後將處理從第12天延長至第21天。該時間範圍 也與IL-13、 mCLCA3和MUC5AC基因表達的誘導一致，其與杯形細胞 組織轉化的發生一致(圖22 )。在這些條件下，我們發現sIL-13Ra2-Fc 處理高效預防病毒誘導的杯形細胞組織轉化(圖23)。然而，與EGFR阻 斷相比，sIL-13Ra2-Fc處理也引起纖毛細胞增生水平的進一步提高(與它 們向杯形細胞移動的阻斷一致)並且在克拉拉細胞水平上沒有變化(符合 杯形細胞的形成至少部分來自纖毛細胞而不是克拉拉細胞亞群這一可能 性)。不能完全排除在該環境中其他細胞來源(例如克拉拉細胞或基細胞) 也促進杯形細胞組織轉化的可能性，但是在IL-13阻斷後纖毛細胞增加和 杯形細胞減少之間的密切匹配提示在這些條件下，纖毛細胞群體的轉分化 是杯形細胞組織轉化的重要途徑。實際上，連同克拉拉細胞表達黏蛋白基 因的先前的和現在的證據，本結果可能簡單地提供上皮細胞分化具有額外 可塑性的證據。在最後兩組實驗中，所述發現再次從小鼠擴展到人類受試者。在第一 組實驗中，分析來自COPD患者的呼吸道組織，所述COPD患者顯示出 呼吸道杯形細胞水平顯著的提高並且在肺移植時提供足夠的肺組織用於分 析。通過應用與為小鼠模型應用的相同的免疫螢光和共聚焦顯微術免疫染 色方案，發現來自COPD患者的肺外植體的切片也顯示在呼吸道上皮細胞 亞群中p微管蛋白-MUC5AC共表達的證據(圖25)。沒有檢測到人(或 小鼠)呼吸道中p微管蛋白的腔內染色，與纖毛可能通過內體降解而不是 脫落來加工的提議一致。如先前指出(Boers等人(1999) Am. J， Respir. Crit. Care Med. 159)，在上皮細胞亞群中也發現CCSP-MUC5AC的共表 達。在第二組實驗中，再次應用用於小鼠研究的策略並且分析人呼吸道上 皮細胞在氣液界面培養條件下，無或有IL-13時的行為。在該情況下，發 現來自COPD患者的培養的呼吸道上皮細胞導致在IL-13影響下共表達p 微管蛋白和MUC5AC的細胞亞群的發展。如先前指出，P微管蛋白定位 在纖毛細胞的基體內(You等人(2004) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol.)，並且因此提供與粘液顆粒中發現的MUC5AC甚 至更靠近的共定位。在來自其他健康肺外植體供者的培養的呼吸道上皮細 胞中發現纖毛細胞標記和杯形細胞標記的IL-13誘導的共表達的相同^=莫式 (甚至在IL-13處理後第一天內)(圖27)。對於小鼠和人組織的研究， 檢測沿z軸和三維重建的多個共聚焦圖像來確立纖毛細胞和杯形細胞標記 在單個細胞中的共定位。因此，類似於在人類受試者中經歷的EGFR激活， 發現在小鼠模式中發現的杯形細胞組織轉化的下遊機制，即IL-13驅動的 纖毛到杯形細胞的轉分化似乎在分泌過多的人類疾病中具有副本。
權利要求
1. 用於治療呼吸道分泌過多的組合物，其包含EGFR信號途徑的抑制劑、IL-13信號途徑的抑制劑和藥學上可接受的載體。
2. 權利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為免疫肽。
3. 權利要求l的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為免疫肽。
4. 權利要求2的組合物，其中所述免疫肽為多克隆抗體、單克隆抗體 或抗體片段。
5. 權利要求3的組合物，其中所述免疫肽為多克隆抗體、單克隆抗體 或抗體片段。
6. 權利要求2的組合物，其中所述抗EGFR信號轉導免疫肽為C225 或EMD55900。
7. 權利要求3的組合物，其中所述抗IL-13信號轉導免疫肽為 sIL-13Ra2-Fc。
8. 權利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為降低 EGF或EGFR表達的反義核酸。
9. 權利要求l的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為降低 IL-13、 IL-13R或IL- 4R表達的反義核酸。
10. 權利要求l的組合物，其中所述EGFR信號途徑的抑制劑為酪氨 酸激酶抑制劑。
11. 權利要求10的組合物，其中所述酪氨酸激酶抑制劑為PD153035、 EKB-569、 4-(3-氯代苯胺基)-6;7-二曱氧基喹唑啉、RG-14620;酪氨酸磷 酸化抑制劑23、酪氨酸磷酸化抑制劑25、酪氨酸磷酸化抑制劑46、酪氨 酸磷酸化抑制劑47或酪氨酸磷酸化抑制劑51。
12. 權利要求1的組合物，其中所述EGFR信號途徑或IL-13信號途 徑的抑制劑為PI3K的特異性抑制劑。
13. 權利要求12的組合物，其中所述PI3K抑制劑為LY294002。
14. 權利要求1的組合物，其中所述IL-13信號途徑的抑制劑為PD98059或LY294002。
15. 治療個體中呼吸道分泌過多的方法，所述方法包括施用EGFR信 號途徑的抑制劑和IL-13信號途徑的抑制劑。
16. 權利要求15的方法，其中同時施用所述EGFR信號途徑的抑制劑 和所述IL-13信號途徑的抑制劑。
17. 權利要求15的方法，其中作為權利要求1的組合物同時施用所述 EGFR信號途徑的抑制劑和所述IL-13信號途徑的抑制劑。
18. 權利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為以(i)約0.05 mg至約 2.5 mg; (ii)約0.1 mg至約1 mg;或(iii)約0.3 mg至約0.5 mg的量施用的 免疫肽。
19. 權利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為以(i)約10 ng/天至約 3 mg/天；(ii)約30 ng/天至約300 fig/天；或(iii)約100 fig/天的量施用的反義 抑制劑。
20. 權利要求15的方法，其中至少一種抑制劑為每次施用以每kg約 0.1 jig至約100 mg的量施用的酪氨酸激酶抑制劑。
21. 權利要求15的方法，其中通過注射、吸入、口服、脂質體或逆轉 錄病毒載體施用所述兩種抑制劑。
全文摘要
本發明一般涉及治療肺部疾病的領域。更具體地，本發明涉及通過施用表皮生長因子受體(EGFR)信號途徑抑制劑和白細胞介素-13(IL-13)信號途徑抑制劑組合來治療呼吸道分泌過多，及其組合物。
文檔編號A01N61/00GK101282650SQ200680037655
公開日2008年10月8日 申請日期2006年10月10日 優先權日2005年10月11日
發明者M·J·霍爾茨曼 申請人:華盛頓大學