Egf修飾的pamam自組裝轉基因組合物及其製備方法與應用的製作方法

2023-12-10 03:20:46 5

專利名稱：Egf修飾的pamam自組裝轉基因組合物及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及EGF修飾的PAMAM自組裝轉基因組合物及其製備方法與應用。
背景技術：
新興的基因治療手段是通過將外源基因片段轉入細胞內部，調控基因表達以糾正人自身基因的結構或功能上的錯亂，阻止病變的進展，殺滅病變的細胞，或抑制外源病原體遺傳物質的複製，從而達到治療的目的。由於基因治療可以跨越傳統治療手段的瓶頸，因此成為重大惡性疾病治療領域(例如癌症、重大惡性傳染病、遺傳類疾病)的前沿和熱點。然而，由於基因治療藥物自身的特性使基因表達水平受限1)基因治療藥物因攜帶負電荷無法跨越表面同樣帶負電荷的細胞膜；2)在體內遞送的過程中不穩定極易被降解；3)易被非特異性免疫清除；4)體內遞送的非靶向性等。由此可見，當前體內基因治療能夠成功並實現臨床轉化應用的關鍵是如何將基因治療藥物高效地在體內進行遞送並實現其胞內功效，而解決這些問題的關鍵是設計構建合適的基因治療藥物載體系統。利用納米技術製備的藥物載體顆粒具有比表面積大、尺寸小、表面易修飾等特點， 因此，將納米顆粒包載基因治療藥物後用於重大惡性疾病的治療正成為基因治療藥物研究的新方向。以納米顆粒作為基因遞送載體，將DNA和RNA等治療性基因片段包裹在納米顆粒之中或者吸附在顆粒表面，同時利用顆粒表面偶聯特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，或納米材料自身的特殊物理化學性質，如磁性、光學性能、被動靶向性等，在細胞攝取作用下進入細胞內，實現安全有效的靶向性基因治療[Proc 28th Int Symp on Contr Rel of Bioact Mater, 2001，7095]。新型樹枝狀高分子聚醯胺-胺(PAMAM)，以其獨特的分子結構和表面性質，成為了治療性基因載體研究的熱點。以末端為胺基的PAMAM樹枝狀大分子為例，它在生理pH 條件下具有很好的溶解性；由於能夠通過其所帶的陽離子和DNA所帶的陰離子的靜電相互作用，不但可以實現更多數量基因的運載，提高轉染效率；而且體系穩定，非常適合作為 DNA的載體，能有效地在不同的細胞類型間轉移遺傳物質；可介導外源基因在宿主細胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉基因的長期、穩定表達；能夠保護目的基因不受體內血漿或組織細胞中各種酶的破壞，因而可以實現體內的有效轉染[Proc. Natl. Acad. Sci.USA,93 4897-4902]。眾多研究表明，PAMAM納米基因遞送系統在體外轉染中表現良好的應用前景，但 PAMAM作為納米基因遞送載體在體內應用尚存在以下幾個問題需要解決1)轉染效率相對較低；2)在體內環境下，PAMAM可以非特異性的結合大量的負電大分子和紅細胞，影響轉染效率並且發生溶血現象；3)如何實現PAMAM納米基因遞送系統的靶向性。為了解決上述問題，目前研究多直接在PAMAM分子上進行修飾，如在PAMAM表面修飾鳥氨酸等殘基[Int J Pharm，2010，392 :294-303]，增強PAMAM分子表面正電性以增強轉染效率，但此方法在增強過多正電性的同時，也提高了細胞毒性；另一方面，對PAMAM表面修飾PEG[Nanotechnology，2009，20 105103]，以提高生物相容性，減少非特異性的結合血漿中的負電大分子和紅細胞，另外，在PEG末端修飾特定蛋白如乳鐵蛋白[Biomaterials， 2008，29 (2) 238-246]，以實現組織靶向性，但PEG的修飾增加了 PAMAM分子和DNA分子結合的空間位阻，降低了轉染效率。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在細胞周期中起重要作用，與細胞生長、增殖、遷移有關。其編碼基因是一種原癌基因，在生理狀態下它不表達或只是有限制的表達，處於非激活狀態，不具有致癌性。如果編碼該受體的基因發生突變，將會導致多餘的表面生長因子受體產生，增強了細胞信號的傳導，便容易誘發腫瘤。EGFR的過度活化與腫瘤生長和分級(包括增殖、血管發生、浸潤和轉移)的關鍵過程有關。研究表明EGFR的過量表達和/或突變可以導致多種腫瘤發生，眾多的人類實體瘤如頭頸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮及腦部腫瘤等，都存在EGFR過表達現象。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種用於轉基因的組合物。本發明所提供的用於轉基因的組合物，由末端帶有氨基的聚醯胺_胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸複合製成。所述聚醯胺-胺樹枝狀聚合物的數均分子量為6909-28826。所述聚醯胺-胺樹枝狀聚合物的正電荷與所述核酸的負電荷的比值為 1 1-20 1。所述表皮細胞生長因子與所述核酸的質量比為2 1-20 1。所述核酸為含有待轉基因的重組質粒或待轉基因。所述表皮細胞生長因子(EGF)購自Sigma公司，產品目錄號為E4127。所述組合物是按照下述的方法製備得到的。本發明的另一個目的是提供一種製備所述用於轉基因的組合物的方法。本發明所提供的製備所述用於轉基因的組合物的方法，包括如下步驟將末端帶有氨基的聚醯胺_胺樹枝狀聚合物的水溶液與核酸混合後，再加入 opti-MEM培養基，孵育形成聚醯胺-胺樹枝狀聚合物與核酸的複合物；再向所述聚醯胺_胺樹枝狀聚合物與核酸的複合物中加入表皮細胞生長因子，孵育形成聚醯胺_胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸的複合物，即得到所述用於轉基因的組合物。所述用於轉基因的組合物在轉基因中的應用或在製備基因治療藥物中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明具有以下優點1)本發明的目的是利用表皮細胞生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)為靶點，採用表皮細胞生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)作為配體，通過自組裝的方法形成EGF修飾的PAMAM載體作為基因遞送載體，利用EGF與腫瘤細胞 EGFR介導的內吞作用，提高PAMAM載體對細胞的靶向性，最大限度地降低非靶細胞的攝入， 可在提高有效性的同時降低毒副作用；2)通過EGF對PAMAM的修飾，可降低PAMAM載體過強的正電荷強度，有利於降低細胞毒性和溶血現象的發生；
3)採用自組裝方法製備EGF/PAMAM/DNA複合物，與化學合成相比，分子自組裝方法可以更方便、靈活的對體系進行修飾，並且保持配體的生物活性。


圖1為EGF修飾對EGF/PAMAM/DNA複合物Zeta電位的影響。圖2為EGF修飾對EGF/PAMAM/DNA複合物粒度的影響。圖3為製備的EGF/PAMAM/DNA複合物的透射電鏡圖(放大倍數150000X)。圖4為製備的EGF/PAMAM/DNA複合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗結果。圖5為EGF修飾對PAMAM/DNA複合物體外轉染效果的影響。圖6為EGF修飾對PAMAM/DNA複合物細胞毒性的影響。
圖7為EGF/PAMAM/DNA複合物的跨膜轉運研究結果。圖8為EGF修飾對MCF-7細胞增殖促進作用的安全性考察結果。圖9為用EGF/PAMAM/DNA複合物轉染p53基因對細胞增殖抑制作用的考察結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。聚醯胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)末端帶有氨基，以乙二胺為核，3. 0代，(購自 Sigma-Aldrich，產品目錄號412422，規格5g，數均分子量為6909)；採用旋轉蒸發儀抽真空，去掉甲醇溶劑，獲得PAMAM G3，再用PBS緩衝液(pH7. 4)溶解，製備成10mg/mL儲存液於 4°C備用。聚醯胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)末端帶有氨基，以乙二胺為核，4. O代，(購自 Sigma-Aldrich，產品目錄號412449，規格10g，數均分子量為14215)；採用旋轉蒸發儀抽真空，去掉甲醇溶劑，獲得PAMAM G4，再用PBS緩衝液(pH7. 4)溶解，製備成10mg/mL儲存液於4°C備用。聚醯胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)末端帶有氨基，以乙二胺為核，5. O代，(購自 Sigma-Aldrich，產品目錄號536709，規格5g，數均分子量為28826)；採用旋轉蒸發儀抽真空，去掉甲醇溶劑，獲得PAMAM G5，再用PBS緩衝液(pH7. 4)溶解，製備成10mg/mL儲存液於 4°C備用。表皮細胞生長因子(EGF)購自Sigma公司，產品目錄號為E4127。實施例1、製備EGF/PAMAM/DNA複合物一、不同PAMAM代數和不同電荷比的篩選1)先將上述製成的PAMAM G3、PAMAM G4和PAMAM G5 (數均分子量分別為6909、 14215和28826) 10mg/mL儲存液溶解於消毒蒸餾水中，振蕩混勻，配製成lmg/mL的工作溶液，4°C儲存備用。轉染前取1. O μ g pGL-3. O質粒DNA (pGL-3. O質粒購自Promega公司，產品目錄號為:E1771)置於EP管中，分別加入0. 7 μ L、1. 4 μ L、3. 5 μ L、7 μ L濃度為lmg/mL的 PAMAM G3、PAMAM G4 和 PAMAM G5 工作溶液，再加入 opti-MEM 培養基(購自 invitrogen，產品目錄號為11058-021) 500uL,混勻後置室溫孵育IOmin形成PAMAM/DNA複合物。PAMAM/ DNA複合物中，PAMAM與DNA的正負電荷比分別為1 1、2 1、5 1和10 1。
2)按上述製備的不同代數、不同正負電荷比PAMAM/DNA複合物，按Promega螢光素酶檢測系統(Promega，產品目錄號為E1500)說明書檢測其體外轉染效果，結果如表1所示，結果顯示，不同代數的PAMAM對體外轉染效果影響較大，隨著代數的增加，PAMAM/DNA複合物的螢光素酶活性增加，PAMAM G5與DNA形成複合物的體外轉染效果最好。電荷比的增加也會提高複合物的轉染效果，PAMAM與DNA的正負電荷比為10 1時，PAMAM/DNA複合物的螢光素酶活性最高。表1不同代數和不同正負電荷比PAMAM/DNA複合物的螢光素酶活性檢測結果
權利要求
1.一種用於轉基因的組合物，由末端帶有氨基的聚醯胺-胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸複合製成。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於所述聚醯胺_胺樹枝狀聚合物的數均分子量為6909-28826。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特徵在於所述聚醯胺-胺樹枝狀聚合物的正電荷與所述核酸的負電荷的比值為1 1-20 1。
4.根據權利要求1-3中任一所述的組合物，其特徵在於所述表皮細胞生長因子與所述核酸的質量比為2 1-20 1。
5.根據權利要求1-4中任一所述的組合物，其特徵在於所述組合物是按照權利要求6 所述的方法製備得到的。
6.一種製備權利要求1-5中任一所述用於轉基因的組合物的方法，包括如下步驟 將末端帶有氨基的聚醯胺-胺樹枝狀聚合物的水溶液與核酸混合後，孵育形成聚醯胺_胺樹枝狀聚合物與核酸的複合物；再向所述聚醯胺_胺樹枝狀聚合物與核酸的複合物中加入表皮細胞生長因子，孵育形成聚醯胺-胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸的複合物，即得到所述用於轉基因的組合物。
7.權利要求1-5中任一所述用於轉基因的組合物在轉基因中的應用或在製備基因治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了EGF修飾的PAMAM自組裝轉基因組合物及其製備方法與應用。本發明所提供的用於轉基因的組合物，由末端帶有氨基的聚醯胺-胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸複合製成。本發明具有以下優點1)通過自組裝的方法形成EGF修飾的PAMAM載體作為基因遞送載體，利用EGF與腫瘤細胞EGFR介導的內吞作用，提高PAMAM載體對細胞的靶向性，最大限度地降低非靶細胞的攝入，可在提高有效性的同時降低毒副作用；2)通過EGF對PAMAM的修飾，可降低PAMAM載體過強的正電荷強度，有利於降低細胞毒性和溶血現象的發生；3)採用自組裝方法製備EGF/PAMAM/DNA複合物，與化學合成相比，分子自組裝方法可更方便、靈活的對體系進行修飾，並且保持配體的生物活性。
文檔編號C12N15/87GK102517332SQ201110378349
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者劉楠, 張小寧, 殷哲, 郝豔麗 申請人:清華大學