一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑及其製備方法
2023-12-10 10:30:57 2
一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑及其製備方法
【專利摘要】本發明一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑及其製備方法，從採自福建省廈門市海滄、同安等港口的淤泥樣品中篩選分離得到降解亞硝酸鹽效果最佳的一菌株，並從福建省寧德市灘涂淤泥樣中篩選得到降解亞硝酸鹽效果最佳的另一菌株；兩菌株分別為沼澤紅假單胞菌菌株PSB20（ Rhodopseudomonas palustris ）、枯草芽孢桿菌菌株ND04（ Bacillus subtilis ）；利用兩菌株製備所得的微生物製劑，能夠降解水產養殖水環境中的氨氮、亞硝酸，且對餌料殘留有機質也具有較好的分解效果，同時還能一定程度上對養殖水體中治病弧菌起到抑制生長的效果，即具有較好的生產應用前景；此外，該生物製劑還具備製備方法簡單的特點。
9632
20140902
9545
20140825
【專利說明】一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於水產養殖水質改良【技術領域】，尤其涉及一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑及其製備方法。
【背景技術】
[0002]隨著水產養殖業的發展，池塘逐年老化，養殖水質、底質受到嚴重汙染，導致養殖病害頻繁發生，水質改良成為健康養殖的主要措施之一。
[0003]近年來，水質改良劑的研宄也在不斷的發展中。傳統的水質改良劑利用物理和化學的原理，通過吸附或增加水體溶氧來改善水質，效率較低，無法解決目前高密度養殖模式下的水質淨化的要求，因此目前在養殖水質改良方面使用較多的是生物水質改良劑，主要成分為:光合細菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、硝化細菌、反硝化細菌、酵母菌、假單胞菌、雙歧桿菌等，其中光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌、反硝化細菌為常見的微生態水產養殖水質改良劑製劑；如專利號為CN200910044291.3、名稱為「一種水質改良劑或飼料、肥料增效劑及其生產方法」的中國發明專利中就揭露了以芽孢桿菌、光合細菌、硝化細菌、乳酸菌、放射菌和酵母菌組成的微生物製劑，該微生物製劑中生物生長促進劑的含量為50-100億個/克，功效是:1、可促進浮遊動植物的生長繁殖速度，提高浮遊植物對水體中的氮、磷、鉀等物質的轉化吸收能力，從而提高肥料效果，提高漁業效益。2、可提高氮、磷、鉀等物質向浮遊植物的轉化效率，促進浮遊植物生長，預防藻類水華的發生。
[0004]目前世界上普遍認為生物防治可能是解決水產養殖病害較為行之有效的途徑之一，但國內外還暫未發現專門防水產養殖中各種病害的生物殺菌藥劑，所以，研發出一種能夠有效防治水產養殖病害的微生物菌劑是本領域技術人員所迫切希望地。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題在於提供一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑，並同時揭露了該微生物製劑的製備方法。
[0006]本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的:
一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑，其由以下質量百分數的組分組成: 經培養、濃縮及固化後的菌株PSB20 5-25% ；
經擴培、固化後的菌株ND0410-25% ；
餘量為載體；
其中:
所述載體為硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎細度均為120-250目；
所述菌株PSB20為沼澤紅假單胞菌菌株PSB20 (Rhodopseudomonas palustris)，於2014年09月02日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC No: 9632 ；
所述菌株ND04為枯草芽抱桿菌菌株ND04 (BaciIlus subtilis)，於2014年08月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC No: 9545。
[0007]同時揭露了上述應用於水產養殖環境改良的微生物製劑的製備方法，該製備方法的具體步驟為:
(1)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的培養:取所述的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於25-35°C、2500-35001x下光照培養72_144h，當培養液的0066(|達
1.5-2.2時即製得種子液；接著按5-20%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C、並利用太陽光光照進行塑料薄膜培養，培養時間3~5天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成；
(2)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的濃縮及固化:往步驟(I)培養好獲得的菌液中添加絮凝劑，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加保護劑、權利要求1所述的載體，然後於30-40 °C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用；
其中，絮凝劑的添加量為步驟(I)培養好獲得的菌液體積的5-15% ;保護劑的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加保護劑0.1-0.5g ;載體的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加載體50-2000g ;且載體為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉；
(3)枯草芽孢桿菌菌株ND04的擴培及固化:取所述的枯草芽孢桿菌菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於30-40°C、150-200rpm下培養24_48h，製得種子液；接著將所得種子液按5-10%接種量接種至發酵培養基，於30-40°C、pH6.5-8,50-200 rpm條件下發酵培養24-48h ;發酵結束後的發酵液於50-70°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用；
(4)復配:先按照下列質量百分數稱取組分:5-25%步驟(2)所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、10-25%步驟(3)所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、餘量為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，之後進行分裝包裝即得所述的微生物製劑。
[0008]進一步地，所述絮凝劑為濃度為0.5-1.0g/L的硫酸鋁鉀溶液，保護劑為固體海藻糖。
[0009]進一步地，所述培養基I的組分為:醋酸鈉3.3g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化銨1.0g、硫酸鎂0.3g、氯化鈣0.05g、氯化鈉1.0g、酵母膏1.0g、硫酸錳0.023g、硫酸亞鐵0.005g、水lOOOmL，pH7.5-8.5 ;所述塑料薄膜培養所用的培養基為PSB培養基，其組分為:氯化銨l.0g、醋酸鈉3.5g、氯化鎂2.0g、氯化鈣0.lg、磷酸二氫鉀0.6g、磷酸氫二鉀0.4g、酵母膏0.1gdK lOOOmL、pH 7.2 ;所述培養基II為牛肉膏蛋白腖培養基，其組分為:牛肉膏3.0g、蛋白腖10.0g、氯化鈉5.0gj lOOOmL, pH7.2-7.4 ;所述發酵培養基的組分為:糖蜜 1-3%、大豆柏 0.1-0.3%、玉米粉 0.1-0.3%、硫酸鎂 0.05-0.15%、磷酸氫二鉀 0.03-0.06%、碳酸鈣0.05-0.15% ;且培養基中的百分比均為質量百分比。
[0010]本發明的有益效果在於:
通過利用沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、枯草芽孢桿菌菌株ND04(feci77m備所得的微生物製劑，能夠降解水產養殖水環境中的氨氮、亞硝酸，且對餌料殘留有機質也具有較好的分解效果，同時還能一定程度上對養殖水體中治病弧菌起到抑制生長的效果， 即具有較好的生產應用前景；此外，該生物製劑還具備製備方法簡單的特點。
【具體實施方式】
[0011]本發明中涉及兩菌株即沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、及枯草芽胞桿菌菌株DN04 ;其中，沼澤紅假單胞菌菌株PSB20是從採自福建省廈門市海滄、同安等港口的淤泥樣品中篩選分離得到的對改良水體環境有促進作用的功能菌株，枯草芽胞桿菌菌株DN04是從福建省寧德市灘涂淤泥樣中篩選得到的對改良水體環境有促進作用的功能菌株；並分別採用16s rDNA法對這兩菌株進行測序分析，最終鑑定它們分別為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的一個菌株、及枯草芽抱桿菌subtilis)的一個菌株。
[0012]1、第一個菌株的分離:
Cl)初篩:稱取1g灘涂淤泥樣品，並加至10mL 0.85%NaCl中，攪拌後取上層濁液置於富集培養基，且於34°C、30001x光照富集培養至菌液變紅；取紅色菌液進行梯度稀釋後在分離培養基上用雙層平板法進行分離操作，挑取分離培養基上長起的紅色菌落，保存備用。
[0013](2)復篩:取初篩得到的不同紅色菌落並置於富集培養基中，34°C、30001x光照培養至菌液變紅、且0066(|為1.5，接著按10%接種量接種至含有初始濃度為500mg/L亞硝酸鈉的富集培養基中，34°C、30001x光照培養5天，使用N-(1-萘基)_胺光法測量其亞硝酸鹽含量，比較其降解效果進而篩選出降解亞硝酸鹽效果最佳的菌株，將該菌株標記為菌株PSB20。
[0014]2、第一個菌株的鑑定:
將篩選所得菌株PSB20接種至分離培養基，於34°C、30001χ光照培養，觀察菌落形態，並做部分生理生化特性的測定，結果如下:紅色菌落，表面光滑，邊緣整齊，不透明，無芽孢，革蘭氏陰性。同時對該菌株進行16S rDNA測定，得其16s rDNA序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。
[0015]需要說明的是，上述富集培養基的組分均為:氯化銨0.lg，碳酸氫鈉0.lg，磷酸氫二鉀0.02g，醋酸鈉0.3g，硫酸鎂0.02g，氯化鈉0.2g，生長因子lmL，微量元素溶液lmL，蒸餾水97mL，pH7.0 ;分離培養基的組分均為:氯化銨1.0g，醋酸鈉3.5g，硫酸鎂0.lg，氯化鈣0.lg，磷酸二氫鉀0.6g，磷酸氫二鉀0.4g，酵母膏0.lg，瓊脂20g，蒸飽水lOOOmL，ρΗ7.0。
[0016]將測得的16s rDNA序列輸入NCBI進行同源性搜索，發現其相似度最高的為沼澤紅假單胞菌則結合生理生化測定結果及16s rDNA序列資料庫比對結果，確定該菌株PSB20為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的一個菌株。
[0017]3、第二個菌株的分離:
(I)初篩:稱取1g灘涂淤泥樣品，並加至10mL 0.85%NaCl中，攪拌後取上層濁液置於LB培養基，且於37 °C、180rpm下富集培養，富集培養30h後，將菌液置於75°C水浴20min，水浴後的菌液進行梯度稀釋及平板塗布法進行分離操作，之後挑取LB平板上長起的不同菌落形態的芽孢桿菌，保存備用。
[0018](2)復篩:挑取初篩得到的不同菌落形態的芽孢桿菌並置於LB培養基中，於37°C、ISOrpm條件下進行活化，活化6h後，按5%接種量接入含有初始濃度為0.5g/L亞硝酸鈉的無機鹽培養基中，並於37°C、180rpm下搖床震蕩培養30h，使用N- (1-萘基)-胺光法測量其亞硝酸鹽含量，比較其降解效果進而篩選出降解亞硝酸鹽效果最佳的菌株，將該菌株標記為菌株ND04。
[0019]其中，無機鹽培養基的組分為:磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.lg，氯化鈉0.2g，硫酸錳0.005g，亞硝酸鈉0.5g，水lOOOmL，pH7.0。
[0020]4、第二個菌株的鑑定
將篩選所得的菌株ND04接種至LB固體培養基，37°C培養，觀察菌落形態，並做部分生理生化特性的測定，結果如下:菌落白色微黃，表面粗糙，不透明，革蘭氏陽性，產芽孢，葡萄糖發酵陽性，水解澱粉陽性。同時對該菌株進行16S rDNA測定，得其16s rDNA序列如SEQID NO:2 所示。
[0021]將測得的16s rDNA序列輸入NCBI進行同源性搜索，發現其相似度最高的為枯草芽孢桿菌(ifeciBiAs subtil is);則結合生理生化測定結果及16s rDNA序列資料庫比對結果，確定該菌株ND04為枯草芽孢桿菌subti I is)的一個菌株。
[0022]5.一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑，其由以下質量百分數的組分組成:
經培養、濃縮及固化後的菌株PSB20 5-25% ；
經擴培、固化後的菌株ND0410-25% ；
餘量為載體；
所述載體為硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎細度均為120-250目。
[0023]且該微生物製劑製備方法的具體操作步驟如下:
(I)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的培養:取沼澤紅假單胞菌菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於25-35°C、2500-35001x下光照培養72_144h，當培養液的0066(|達1.5-2.2時即製得種子液；接著按5-20%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C、並利用太陽光光照培養3~5天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成；
(2)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的濃縮及固化:往步驟(I)培養好獲得的菌液中添加絮凝劑，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加保護劑、權利要求1所述的載體，然後於30-40°C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用；
其中，絮凝劑的添加量為步驟(I)培養好獲得的菌液體積的5-15% ;保護劑的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加保護劑0.1-0.5g ;載體的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加載體50-2000g ;且載體為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉；
(3)枯草芽孢桿菌菌株ND04的擴培及固化:取所述的枯草芽孢桿菌菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於30-40°C、150-200rpm下培養24_48h，製得種子液；接著將所得種子液按5-10%接種量接種至發酵培養基，於30-40°C、pH6.5-8,50-200 rpm條件下發酵培養24-48h ;發酵結束後的發酵液於50-70°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用；
(4)復配:先按照下列質量百分數稱取組分:5-25%步驟(2)所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、10-25%步驟(3)所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、餘量為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，之後進行分裝包裝即得所述的微生物製劑。
[0024]其中，所述培養基I的組分為:醋酸鈉3.3g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化銨1.0g、硫酸鎂0.3g、氯化鈣0.05g、氯化鈉1.0g、酵母膏1.0g、硫酸錳0.023g、硫酸亞鐵0.005g、水lOOOmL，pH7.5-8.5 ;所述塑料薄膜培養所用的培養基為PSB培養基，其組分為:氯化銨l.0g、醋酸鈉3.5g、氯化鎂2.0g、氯化鈣0.lg、磷酸二氫鉀0.6g、磷酸氫二鉀0.4g、酵母膏0.1gdK lOOOmL、pH 7.2 ;所述培養基II為牛肉膏蛋白腖培養基，其組分為:牛肉膏3.0g、蛋白腖l0.0g、氯化鈉5.0gj lOOOmL, pH7.2-7.4 ;所述發酵培養基的組分為:糖蜜 1-3%、大豆柏 0.1-0.3%、玉米粉 0.1-0.3%、硫酸鎂 0.05-0.15%、磷酸氫二鉀 0.03-0.06%、碳酸鈣0.05-0.15% ;且培養基中的百分比均為質量百分比。
[0025]需要說明的是，本發明中所涉及到的:LB培養基的組分均為:蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g,H2O 1000 mL ;固體LB培養基、SLB培養基的組分均為:蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂15g，H20 1000 mL。絮凝劑還可以選擇殼聚糖或甲殼素；保護劑還可選明膠或甘油。
[0026]為了更好的對本發明中微生物製劑進行進一步闡述說明， 申請人:例舉了如下實施例。
[0027]實施例一
菌株PSB20的培養:取菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於27°C、25001x下光照培養72h，當培養液的00_達1.5時即製得種子液；接著按10%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C (噹噹天溫度過高時則採用噴水進行降溫)、並利用太陽光光照培養3天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成。
[0028]菌株PSB20的濃縮及固化:往菌株PSB20培養好獲得的菌液中添加濃度為0.5g/L的硫酸鋁鉀溶液，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加固體海藻糖、硅藻土 (粉碎細度120目)，然後於30°C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用；
其中，硫酸鋁鉀溶液的添加量為菌株PSB20培養好獲得的菌液體積的5% ;固體海藻糖的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加固體海藻糖0.1g ;硅藻土的添加量為:每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加硅藻土 1000g。
[0029]菌株ND04的擴培及固化:取菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於30°C、150rpm下培養24h，製得種子液；接著將所得種子液按5%接種量接種至發酵培養基，於30°C、pH6.5、100 rpm條件下發酵培養24h ;發酵結束後的發酵液於50°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用。
[0030]復配:先按照下列質量百分數稱取組分:10%所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、15%所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、75%粉碎細度120目的硅藻土 ；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，即得所述的微生物製劑。
[0031]實施例二
菌株PSB20的培養:取菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於30°C、30001x下光照培養96h，當培養液的00_達1.7時即製得種子液；接著按5%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C (噹噹天溫度過高時則採用噴水進行降溫)、並利用太陽光光照培養5天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成。
[0032]菌株PSB20的濃縮及固化:往菌株PSB20培養好獲得的菌液中添加濃度為0.7g/L的硫酸鋁鉀溶液，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加固體海藻糖、沸石粉(粉碎細度250目)，然後於40°C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用；
其中，硫酸鋁鉀溶液的添加量為菌株PSB20培養好獲得的菌液體積的10% ;固體海藻糖的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加固體海藻糖0.3g ;沸石粉的添加量為:每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加沸石粉1000g。
[0033]菌株ND04的擴培及固化:取菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於35°C、170rpm下培養30h，製得種子液；接著將所得種子液按7%接種量接種至發酵培養基，於35°C、pH6.5、130 rpm條件下發酵培養36h ;發酵結束後的發酵液於60°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用。
[0034]復配:先按照下列質量百分數稱取組分:15%所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、20%所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、65%粉碎細度250目的沸石粉；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，即得所述的微生物製劑。
[0035]實施例三
菌株PSB20的培養:取菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於34°C、35001x下光照培養120h，當培養液的0066(|達1.9時即製得種子液；接著按15%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C (噹噹天溫度過高時則採用噴水進行降溫)、並利用太陽光光照培養4天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成；
菌株PSB20的濃縮及固化:往菌株PSB20培養好獲得的菌液中添加濃度為1.0g/L的硫酸鋁鉀溶液，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加固體海藻糖、硅藻土(粉碎細度1800目)，然後於35°C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用；
其中，硫酸鋁鉀溶液的添加量為菌株PSB20培養好獲得的菌液體積的15% ;固體海藻糖的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加固體海藻糖0.5g ;沸石粉的添加量為:每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加沸石粉1500g。
[0036]菌株ND04的擴培及固化:取菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於37°C、170rpm下培養48h，製得種子液；接著將所得種子液按5%接種量接種至發酵培養基，於35°C、pH7.0,150 rpm條件下發酵培養48h ;發酵結束後的發酵液於70°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用；
復配:先按照下列質量百分數稱取組分:20%所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、25%所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、55%粉碎細度180目的硅藻土 ；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，即得所述的微生物製劑。
[0037]6.對水產養殖環境的改良試驗
試驗一:實施例一製備所得微生物製劑對水產養殖環境的改良試驗
(I)試驗方法:取實施例一製備所得微生物製劑在養殖南美白對蝦蝦塘使用:設計一組對照組，一組實驗組；實驗組中每立方米水體每次使用2g實施例一製備所得微生物製劑，使用時兌水稀釋10倍後進行全池潑灑，且每周使用一次；對照組為空白對照，即不使用實施例一製備所得微生物製劑；一個月後取蝦塘水樣檢測其氨氮、亞硝酸、弧菌總數及有機質含量。
[0038](2)試驗結果:沒有使用實施例一製備所得微生物製劑的對照組氨氮測量值為0.6mg/L、亞硝酸測量值為0.lmg/L、弧菌總數為850個/ml、有機質含量為1.3% ;而實驗組的氨氮測量值為0.2mg/L、亞硝酸測量值為0.0 lmg/L、弧菌總數為570個/ml、有機質含量為0.79% ;即試驗組蝦塘的水質明顯得以提高。
[0039]試驗二:實施例二製備所得微生物製劑對水產養殖環境的改良試驗
(I)試驗方法:取實施例二製備所得微生物製劑在養殖南美白對蝦蝦塘使用:設計一組對照組，一組實驗組；實驗組中每立方米水體每次使用2g實施例二製備所得微生物製劑，使用時兌水稀釋10倍後進行全池潑灑，且每周使用一次；對照組為空白對照，即不使用實施例三製備所得微生物製劑；一個月後取蝦塘水樣檢測其氨氮、亞硝酸、弧菌總數及有機質含量。
[0040](2)試驗結果:沒有使用實施例二製備所得微生物製劑的對照組氨氮測量值為0.6mg/L、亞硝酸測量值為0.lmg/L、弧菌總數為850個/ml、有機質含量為1.3% ;而實驗組的氨氮測量值< 0.2mg/L、亞硝酸測量值為0.01mg/L、弧菌總數為480個/ml、有機質含量為0.73% ;即試驗組蝦塘的水質明顯得以提高。
[0041]試驗三:實施例三製備所得微生物製劑對水產養殖環境的改良試驗
(I)試驗方法:取實施例三製備所得微生物製劑在養殖南美白對蝦蝦塘使用:設計一組對照組，一組實驗組；實驗組中每立方米水體每次使用5g實施例二製備所得微生物製劑，使用時兌水稀釋10倍後進行全池潑灑，且每周使用一次；對照組為空白對照，即不使用實施例三製備所得微生物製劑；一個月後取蝦塘水樣檢測其氨氮、亞硝酸、弧菌總數及有機質含量。
[0042](2)試驗結果:沒有使用實施例三製備所得微生物製劑的氨氮測量值為0.6mg/L、亞硝酸測量值為0.lmg/L、弧菌總數為850個/ml、有機質含量為1.3% ;而實驗組的氨氮測量值為< 0.2mg/L、亞硝酸測量值為0.05mg/L、弧菌總數為440個/ml、有機質含量為
0.67% ;即試驗組蝦塘的水質明顯得以提高。
[0043]綜上可知，本發明利用沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、枯草芽孢桿菌菌株ND04{Bacillus subtilis)製備所得的微生物製劑，能夠降解水產養殖水環境中的氨氮、亞硝酸，且對餌料殘留有機質也具有較好的分解效果，同時還能一定程度上對養殖水體中治病弧菌起到抑制生長的效果，即具有較好的生產應用前景。
【權利要求】
1.一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑，其特徵在於:由以下質量百分數的組分組成: 經培養、濃縮及固化後的菌株PSB20 5-25% ； 經擴培、固化後的菌株ND0410-25% ； 餘量為載體； 其中: 所述載體為硅藻土或沸石粉，且硅藻土、沸石粉的粉碎細度均為120-250目； 所述菌株PSB20為沼澤紅假單胞菌菌株PSB20 (Rhodopseudomonas palustris)，於.2014年09月02日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No: 9632 ； 所述菌株ND04為枯草芽抱桿菌菌株ND04 (BaciIlus subtilis)，於2014年08月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No: 9545。
2.一種權利要求1所述應用於水產養殖環境改良的微生物製劑的製備方法，其特徵在於:具體步驟為: (1)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的培養:取權利要求1中所述的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20並將其接種至培養基I中，且於25-35°C、2500-35001x下光照培養72_144h，當培養液的(》66(|達1.5-2.2時即製得種子液；接著按5-20%接種量將種子液接種至透明塑料農膜，於30~35°C、並利用太陽光光照進行塑料薄膜培養，培養時間3~5天，且陰天、及夜晚時採用60W/25L白熾燈照射，當菌液呈現深紅則培養完成； (2)沼澤紅假單胞菌菌株PSB20的濃縮及固化:往步驟(I)培養好獲得的菌液中添加絮凝劑，靜置過夜絮凝，去上清；接著依次添加保護劑、權利要求1所述的載體，然後於.30-40°C下風乾，得固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20，備用； 其中，絮凝劑的添加量為步驟(I)培養好獲得的菌液體積的5-15% ;保護劑的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加保護劑0.1-0.5g ;載體的添加量為--每IL經絮凝後得到的濃稠菌液中添加載體50-2000g ;且載體為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉； (3)枯草芽孢桿菌菌株ND04的擴培及固化:取權利要求1中所述的枯草芽孢桿菌菌株ND04並將其接種至培養基II中，且於30-40 °C、150-200rpm下培養24_48h，製得種子液；接著將所得種子液按5-10%接種量接種至發酵培養基，於30-40°C、pH6.5-8,50-200 rpm條件下發酵培養24-48h ;發酵結束後的發酵液於50-70°C下烘乾，得固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04，備用； (4)復配:先按照下列質量百分數稱取組分:5-25%步驟(2)所得的固化後的沼澤紅假單胞菌菌株PSB20、10-25%步驟(3)所得的固化後的枯草芽孢桿菌菌株ND04、餘量為粉碎細度120-250目的硅藻土或沸石粉；接著將稱取好的各組分混合併攪拌均勻，之後進行分裝包裝即得所述的微生物製劑。
3.根據權利要求2所述一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑的製備方法，其特徵在於:所述絮凝劑為濃度為0.5-1.0g/L的硫酸鋁鉀溶液，保護劑為固體海藻糖。
4.根據權利要求2所述一種應用於水產養殖環境改良的微生物製劑的製備方法，其特徵在於:所述培養基I的組分為:醋酸鈉3.3g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化銨1.0g、硫酸鎂0.3g、氯化鈣0.05g、氯化鈉1.0g、酵母膏1.0g、硫酸錳0.023g、硫酸亞鐵0.005g、水100mL, pH7.5-8.5 ;所述塑料薄膜培養所用的培養基為PSB培養基，其組分為:氯化銨.1.(^、醋酸鈉3.58、氯化鎂2.0g、氯化鈣0.lg、磷酸二氫鉀0.6g、磷酸氫二鉀0.4g、酵母膏0.1gdK lOOOmL、pH 7.2 ;所述培養基II為牛肉膏蛋白腖培養基，其組分為:牛肉膏.3.0g、蛋白腖l0.0g、氯化鈉5.0gj 100mL, pH7.2-7.4 ;所述發酵培養基的組分為:糖蜜 1-3%、大豆柏 0.1-0.3%、玉米粉 0.1-0.3%、硫酸鎂 0.05-0.15%、磷酸氫二鉀 0.03-0.06%、碳酸鈣0.05-0.15% ;且培養基中的百分比均為質量百分比。
【文檔編號】C12R1/125GK104498382SQ201410517092
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】徐長安, 唐旭, 劉源森, 林凌, 方衛東, 黃仕新 申請人:國家海洋局第三海洋研究所