小麥粒重主效基因位點QGw.nau‑4B的分子標記引物及其應用的製作方法

2023-12-10 04:08:56 3

本發明屬於作物育種學領域，涉及小麥粒重主效基因位點QGw.nau-4B的分子標記引物及其應用。

技術背景

小麥是最早被人類馴化的糧食作物之一，提供全球人口五分之一的能量攝入。提高小麥產量一直是小麥育種的最主要目標。小麥產量最終是由畝穗數、單穗粒數以及粒重決定。在高產栽培條件下，由於穗數和單穗粒數收到限制時，粒重是影響產量的主要因素，增加粒重成為提高小麥產量潛力的關鍵。在過去的一個世紀中，不管是在中國還是其他國家，在新培育的品種中粒重都得到了顯著的增加。高粒重品種的選育和應用是提高小麥產量的有效方法。粒重基因的發掘是高產育種的前提和基礎，而開發與粒重基因緊密連鎖的分子標記更是應用粒重基因的關鍵。

目前小麥對粒重的研究主要集中在QTL定位及精細定位階段。利用重組自交系、雙單倍體及回交群體等不同定位群體，在小麥21染色體上已經監測到超過110個控制粒重的QTL。其中位於4B染色體上的粒重QTL存在於許多種質中，效應較強，並且在多個環境下表現較穩定(McCartney et al 2005；Wang et al 2011；Peleg et al 2011；Jia et al 2013；Xie et al 2015)。此外，Guo et al(2015)通過關聯分析在自然群體中也檢測到了4B染色體上的粒重QTL。

小麥粒重性狀屬於數量性狀，在產量構成要素中受遺傳特性的影響最大，其遺傳主要受加性效應基因控制，廣義遺傳率高達59％-80％，因而對粒重可以進行比較有效的遺傳選擇。儘管粒重遺傳力最高，所受環境影響相對於其它二者較小，但在實際生產中，即使是同一品種，在不同年份、不同環境條件下，千粒重也會出現較大差異。分子標記輔助選擇育種與傳統育種相比，可以通過目標基因型進行選擇，不受基因表達及環境條件的影響，能夠提高選擇的準確性，從而加快育種進程(Collard and Mackill 2008)。連鎖累贅影響目標基因在育種中的選擇，因此有必要開發與目標基因更緊密連鎖的分子標記，減少選擇時的連鎖累贅，提高對粒重基因的應用效率。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供與小麥粒重主效基因位點QGw.nau‐4B更加緊密連鎖的分子標記方法及分子標記引物。

本發明的另一個目的是提供該小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子標記引物的應用。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子標記，用標記引物WGRC1334‐F：SEQ ID NO.1，WGRC1334‐R：SEQ ID NO.2擴增小麥品種基因組DNA，獲得的擴增片段為220bp，即為小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B連鎖的的分子標記WGRC1334，該標記為共顯性標記，與QGw.nau‐4B緊密連鎖；

用標記引物WGRC1083‐F：SEQ ID NO.5，WGRC1083‐R：SEQ ID NO.6擴增小麥品種DNA，獲得的擴增片段為265bp，即為小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B連鎖的分子標記WGRC1083，該標記為共顯性分子標記，與QGw.nau‐4B緊密連鎖。

小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子標記方法，分別用上述的兩對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，並檢測擴增產物，如果用分子標記WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能夠擴增出220bp的擴增片段，同時用分子標記WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R能夠擴增出265bp的擴增片段，則標誌著待檢小麥存在粒重主效基因QGw.nau‐4B。

小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子標記引物，分子標記引物WGRC1334‐F序列如SEQ ID NO.1所示，WGRC1334‐R序列如SEQ ID NO.2所示；分子標記引物WGRC1083‐F序列如SEQ ID NO.3所示，WGRC1083‐R序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明所述的分子標記引物在小麥種質資源中粒重主效基因QGw.nau‐4B的鑑定中的應用。

本發明所述的分子標記引物在篩選高千粒重小麥中的應用。

本發明所述的應用優選：利用所述的分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，並檢測擴增產物，如果用分子標記WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能夠擴增出220bp的擴增片段，並且用分子標記WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R擴增出265bp的擴增片段，則標誌著待檢小麥為存在粒重主效基因QGw.nau‐4B的具有高千粒重潛力的小麥。

有益效果：

本發明提供了與QGw.nau‐4B緊密連鎖的分子標記WGRC1334和WGRC1083的引物，可以加速粒重主效基因QGw.nau‐4B在小麥高產育種中的應用。

本發明獲得了與QGw.nau‐4B緊密連鎖的分子標記WGRC1334和WGRC1083。標記定位於QGw.nau‐4B兩側，遺傳距離為1.3cM，物理距離53.6Mb，能夠幫助該基因向推廣品種中轉移以及與其它產量相關基因聚合。

2、鑑定方便。這兩個分子標記都為共顯性標記，其引物具有檢測方便、擴增穩定、簡便等優點。用標記WGRC1334和WGRC1083的引物檢測QGw.nau‐4B基因，可以確定QGw.nau‐4B的存在與否以及存在狀態，並預測小麥的千粒重特性，進而快速篩選攜有QGw.nau‐4B的植株並用於小麥品種的改良。

3、提高品種改良的選擇鑑定效率，節約成本。在傳統的品種改良過程中，需要將不同品種或品系進行一系列雜交，在後代群體中選擇穩定單株進行表型鑑定，需要多年多點的表型鑑定；並且粒重表型鑑定易受環境的影響，鑑定結果有一定的誤差。因此品種的改良不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測與抗粒重主效基因QGw.nau‐4B緊密連鎖的分子標記，可以將表型鑑定的工作大大減少，並且在苗期就可鑑定出攜有粒重主效基因基因QGw.nau‐4B的單株，從而淘汰非目標植株。因此，利用通過檢測與粒重主效基因QGw.nau‐4B緊密連鎖的分子標記WGRC1334和WGRC1083，不僅節約育種成本，而且大大提高品種改良的選擇效率。

4、減少連鎖累贅。由於小麥的粒重性狀往往和一些不良的其他農藝性狀有一定的相關。在分子標記輔助育種中，由於QTL初步定位的區間比較大，致使選擇導入的區間比較大，會造成連鎖累贅。利用與粒重主效基因QGw.nau‐4B緊密連鎖的分子標記可以減少選擇時的連鎖累贅，提高選擇效率。

附圖說明

圖1 WGRC1334和WGRC1083與小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的遺傳連鎖圖，右邊為遺傳連鎖圖的標記，左側數據為標記間的遺傳距離。

圖2 WGRC1083擴增帶型。M為PUC19/MspI，左側是分子量標記條帶大小(bp)。1為南大2419，2為溫麥6號，3為QGw.nau‐4B近等基因系，4為不含QGw.nau‐4B近等基因系對照。箭頭所指為特異擴增條帶。

圖3 WGRC1334擴增帶型。M為PUC19/MspI，左側是分子量標記條帶大小(bp)。1為南大2419，2為溫麥6號，3為QGw.nau‐4B近等基因系，4為不含QGw.nau‐4B近等基因系對照。箭頭所指為特異擴增條帶。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1

小麥粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子標記通過以下方法獲得：

根據QGw.nau‐4B的邊界標記Xgwm495和Xgwm149(Jia et al 2013)，利用公布的小麥基因組序列位於QGw.nau‐4B區段(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)和望水白BAC克隆序列開發的SSR分子標記對南大2419、溫麥6號和望水白進行多態性篩選，最終得到2個在親本間有多態的標記，即WGRC1334和WGRC1083這兩個分子標記。

PCR反應體系為12.5μl，其中10×buffer 1.25μl，25mM MgCl2 0.75μl，2.5mM dNTPs 1μl，上、下遊引物各0.2μM，Taq酶(5u/μl)0.1μl，模板DNA 10ng，加水至12.5μl；

PCR擴增程序為94℃預變性3min後，94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，循環35次，最後72℃延伸8min；在PE9600擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離，然後在紫外透射儀上照相，記錄結果。

利用在親本間有多態的分子標記WGRC1334和WGRC1083分析溫麥6號背景的純合重組體、近等基因系及其輪迴親本。結果表明WGRC1334和WGRC1083在遺傳上分別與Xgwm495和Xgwm149共分離，物理距離為53.6Mb，分別位於Xgwm495和Xgwm149區間的內側。

實施例2分子標記輔助QGw.nau‐4B區段轉育提高小麥粒重

以溫麥6號背景的純合近等基因系基因組DNA作為模板，以兩對分子標記引物PCR擴增並檢測擴增產物，用分子標記WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能夠擴增出220bp的擴增片段，並且用分子標記WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R擴增出265bp的擴增片段，說明在近等基因系DNA中檢測到QGw.nau‐4B區段。分子標記引物擴增帶型見圖2和圖3。根據基因型，鑑定近等基因系及其受體親本的粒重表型。結果表明，以溫麥6號為對照，近等基因系百粒重得到顯著提高(表1)。

表1含QGw.nau‐4B近等基因系和溫麥6號在QGw.nau‐4B區段的基因型和表型

N代表南大2419基因型，W代表溫麥6號基因型，CK代表對照溫麥6號。＊＊代表在P＝0.01水平上與對照溫麥6號的百粒重表型差異顯著。