桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子及其應用的製作方法

2023-12-10 04:27:51

專利名稱：桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域，特別是涉及桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子及其應用。
背景技術：
肌動蛋白是真核生物中普遍存在的一種古老的蛋白質，它是構成細胞骨架的主要成分。在高等植物中，有肌動蛋白組成的微絲參與細胞分裂、胞質環流、延長生長等重要的生理活動。細胞器表面的肌球蛋白與微絲接觸，肌動蛋白與肌球蛋白相互作用，ATP化學能轉變為機械能，推動細胞器運動。單體肌動蛋白一般由375-377個胺基酸殘基組成，分子量約為42kDa。由於肌動蛋白基因非常保守，所以被作為一種進化研究中的分子標記廣泛採用。大部分肌動蛋白基因在植物各種組織中都有高效且穩定的表達，所以其啟動子具有高效，穩定的啟動活性。現有的桑樹轉基因研究都是採用植物通用的組成型啟動子，如CMV35s、玉米Ubi 啟動子等，由於植物中存在對外部DNA的識別及防禦機制，所以在研究中經常出現基因沉默或者表達量過低的現象。

發明內容
本發明的目的之一在於提供桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子核酸序列，以及核酸序列延長、截短或具有80%以上同源性的具有啟動活性的核酸序列。針對外源基因在轉基因植物中存在的基因沉默及表達量過低的問題，以及在植物中的報告基因需要有強啟動子來驅動的需要，提供桑樹中的一個內源性強啟動子及其在轉基因植物中的應用。本發明所述的桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子，通過下列步驟克隆得到
一、桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子5』端調控序列的分離
1)桑樹基因組的提取；
2)桑樹基因組酶切消化；
3)桑樹基因組酶切產物純化；
4)銜接頭連接到消化的桑樹基因組上；
5)採用槽式PCR方法獲得基因片段；
二、擴增的PCR產物經過切膠回收並連接到pMD19-TVector (Takara)，挑選陽性克隆並測序。本發明同時提供桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子的應用，S卩利用獲得的MaACT3啟動子構建啟動子_目的基因_終止序列的表達盒，構建成植物表達載體，並採用農桿菌感染方法進行瞬時表達檢測，具體操作如下
一、植物表達載體的構建
1)採用PCR法分別獲得MaACT3啟動子、EGFP以及Nos片段，切膠回收備用；
2)融合PCR擴增構建MaACT3啟動子-EGFP-Nos表達盒；3)含三個元件的融合片段經切膠回收、雙酶切消化及乙醇沉澱回收等步驟，插入植物表達載體PCMBIA1300的酶切位點損ο I和幻7/ I之間；
二、瞬時表達檢測
1)利用凍融法將植 物表達載體轉入農桿菌，採取PCR法鑑定陽性克隆；
2)瞬時表達具體方法採用農桿菌感染桑樹成熟葉片的方法，螢光顯微鏡觀察螢光蛋白在桑樹葉片中的表達情況。上述植物表達載體的構建中，EGFP為增強型的綠色螢光蛋白基因，常用作植物轉基因的報告基因。Nos片段為胭脂鹼合成酶的終止子，在植物啟動子活性研究中用作表達終止元件。載體PCMBIA1300是目前廣泛採用的植物雙元表達載體，其中含有潮黴素抗性的表達框，可以在植物轉基因中作為篩選標記。桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子可應用於外源基因的真核表達，同時可應用於轉基因植物。


圖ι為槽式PCR擴增桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子，1-5泳道為第一輪PCR的結果，6_10 為第二輪PCR的結果，其中8，9擴增的片段含有922bp的啟動子區域和肌動蛋白基因的5』 端區域。圖2為綠色螢光蛋白EGFP在桑樹葉片中的瞬時表達，圖中亮綠色的區域代表綠色螢光蛋白EGFP表達的區域，黑色的區域代表沒有螢光蛋白表達的區域。本發明的優點是
本發明採用桑樹內源性的強啟動子代替植物通用型啟動子，可以避免外源基因轉入桑樹中產生的基因沉默及表達量過低的問題。利用農桿菌T-DNA區將啟動子-目的基因-終止序列表達盒導入植物基因組中，可以實現外源基因的高效穩定表達，獲得組成型表達的轉基因植物，尤其在驅動篩選標記及報告基因的表達中具有重要意義，也為植物基因工程技術的研究和應用提供了重要價值的啟動子和調控元件。
具體實施例方式實施例1 桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子的克隆一、桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子5』端調控序列的分離
1)採用CTAB法提取桑樹基因組，並用核酸蛋白儀及0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA ；
2)分別取20μg用2μ L限制性內切酶Pn/ U、Dra I, Sma I, Stu I禾口 V (Takara )，酶切過夜；
3)乙醇沉澱法回收酶切產物在酶切產物中加入等體積酚氯仿(V:V=1:1)充分混勻，12 OOOx g，常溫離心5分鐘，取上清；加入1/10體積的NaAc (3M，PH5. 2)以及2. 5-3倍體積的無水乙醇，室溫靜置10分鐘，13 OOOx g常溫或者4°C離心15分鐘，棄上清；用80% 乙醇溶液清洗沉澱2次，室溫乾燥，加入TE緩衝液或無菌水溶解備用；
4)銜接頭由兩條鏈(長鏈5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGG GCTGGT-3』 ；短鏈5』 -NH2-ACCAGCCC-P04-3')退火形成，將銜接頭與酶切產物相連接，連接體系(40 μ L)基因組酶切產物 8μ L ；接頭 4μ L ； 40%PEG4000 20 μ L ；IOxLigation Buffer4 μ L，T4連接酶(Fermentas)2 μ L，無菌水2 μ L，22°C保溫4小時；連接產物在70°C保溫10 分鐘，並用上述乙醇沉澱法回收連接產物作為PCR的模板；
5)根據報導的MaACT3的mRNA設計兩條基因特異引物GSPl (5』 -CCACTGGCATAGAGGGA AAG-3，)和 GSP2 (5，-GCATCCTTTTGGCCCATAC-3』 )，根據長接頭設計兩條引物 APl (5' -TCTGTGAGGTCACG TCCAGC-3『)和 AP2(5' -TTGCCTTGGACTACGAGCAGG-3『)；先採用 GSPl和APl進行第一輪擴增，然後採用GSP2和AP2進行第二輪擴增獲得特異片段；採用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物，片段與Takara公司的pMD19_T Vector載體相連接，轉化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆，送到南京金斯瑞公司測序；
二、擴增的PCR產物經過回收並連接到pMD19-T Vector (Takara)，挑選陽性克隆並測 序。實施例2 植物表達載體的構建
一、MaACT3啟動子與螢光蛋白基因EGFP的融合
採用PCR法擴增分別回收穫得MaACT3啟動子、EGFP以及Nos的片段作為融合PCR材料；擴增片段所用引物如下
MaACT3 啟動子上遊引物5' -CCGCTCGAGACGCGTCATGGGGTCCCTAAATCAG-3『 MaACT3 啟動子下遊引物5' -TCCTCGCCCTTGCTCACCATTTTCTATTGTATTTCTGCAG-3『 EGFP 上遊引物5 『 -CTGCAGAAATACAATAGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 『 EGFP 下遊引物5 『 -ATTCGAGCTGGTCACCAATTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3 『 No s 上遊引物5 『 -ATGGACGAGCTGTACAAGTAAATTGGTGACCAGCTCGAAT-3 『 No s 下遊引物5 『 -AAAGGGCGGCCGCTATTAATTAACCCGATCTAGTAACATAGATGA-3 『 融合 PCR 擴增體系(25 μ L) IOxPCR Buffer 2. 5 μ L、MgCl2 2 μ L、MaACT3 啟動子上遊引物和Nos下遊引物各1 μ L、模板總體積2 μ L (三個片段摩爾數相等)、LA Taq酶0. 2 μ L (5U/ μ L)和無菌水14. 8 μ L ；擴增程序94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，70°C退火5分鐘，72 °C延伸2分鐘；94 V變性30秒，70 V退火30秒，72 °C延伸2分鐘，運行30個循環；72 °C 延伸10分鐘；4°C保存；
二、含三個元件的融合PCR片段經切膠回收、雙酶切消化及乙醇沉澱等步驟，插入農桿菌植物表達載體PCMBIA1300的酶切位點損ο I和幻w I之間，雙酶切及測序證實瞬時表達載體構建成功。實施例3 瞬時表達檢測
利用凍融法將植物表達載體轉入農桿菌，採取PCR法鑑定陽性克隆。陽性克隆在YEB 液體培養基中擴大培養至OD=L 5-2. 4之間，離心收集菌體，利用感染培養基(1/4MS培養基 +100 μ m乙醯丁香酮)重懸沉澱2次，最後稀釋成OD=O. 5 ；將桑樹成熟葉片切成Icm2大小， 在0. 1%升汞中消毒5分鐘，無菌水漂洗3次以上；然後將消毒後的葉片浸泡在菌液中保持 30分鐘，放在用感染培養基浸溼的濾紙上，22°C黑暗培養3天，採用螢光顯微鏡觀察螢光蛋白在桑樹葉片中的表達情況。
權利要求
1.桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子，其特徵在於如說明書序列表所示的核酸序列，以及核酸序列延長、截短或具有80%以上同源性的具有啟動活性的核酸序列。
2.權利要求1所述的桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子的克隆方法，其特徵在於包括以下步驟1)桑樹基因組的提取；2)桑樹基因組酶切消化；3)桑樹基因組酶切產物純化；4)銜接頭連接到消化的桑樹基因組上；5)採用槽式PCR方法獲得基因片段；6)擴增的PCR產物經過切膠回收並連接到pMD19-TVector (Takara)，挑選陽性克隆並測序。
3.權利要求1所述的桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子的應用，其特徵在於，利用該啟動子構建啟動子_目的基因_終止序列的表達盒，構建成植物表達載體。
4.權利要求1所述的桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子應用於外源基因的真核表達。
5.權利要求1所述的桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子應用於轉基因植物。
全文摘要
本發明涉及桑樹肌動蛋白MaACT3啟動子及其克隆、植物表達載體構建方法及應用。克隆方法包括桑樹基因組的提取、酶切消化、酶切產物純化、銜接頭連接到消化的桑樹基因組上、採用槽式PCR方法獲得基因片段、回收擴增的片段，連接到pMD19-TVector載體(Takara)上並測序等步驟。本發明採用桑樹內源性的強啟動子代替植物通用型啟動子，可以避免外源基因轉入桑樹中產生的基因沉默及表達量過低的問題。利用遺傳轉化技術將啟動子-目的基因-終止序列表達盒導入植物基因組中，可以實現外源基因的高效穩定表達，獲得組成型表達的轉基因植物。
文檔編號C12N15/82GK102220328SQ20111015424
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者餘茂德, 呂蕊花, 吳存容, 張瓊予, 李軍, 李鎮剛, 王茜齡, 趙愛春, 金筱耘, 魯成 申請人:西南大學