一種擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGF1的耐乾旱應用的製作方法

2023-12-03 13:51:36

專利名稱：一種擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGF1的耐乾旱應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種擬南芥鋅指蛋白基因的應用。
背景技術：
植物的生長發育和它們所存在的環境息息相關。植物通常在不利的環境條件下生長，如鹽鹼、貧瘠、乾旱的土地，寒冷、冰凍的氣候，各種病原微生物的侵害等等。研究植物在逆境條件下的生長發育特性，是培育能在逆境條件下正常生長發育的植物的重要基礎；尤其在分子水平揭示這種特性，更是利用現代生物技術改良植物獲得抗逆性強的植物的先決條件。
環境脅迫已極大的限制了全世界糧食產量的提高。乾旱是限制農業生產的最主要因素。因此，認識植物對乾旱的反應機制，提高植物的抗旱性，是農業增產的重要基礎。乾旱對植物的影響主要引起滲透脅迫並抑制植物的生長、損傷植物細胞，最終引起DNA的降解而導致植物細胞的死亡。乾旱對植物的影響，僅有一部分可能是植物的一種適應反應，許多反應是因脅迫而致的生理損傷結果。這一過程與植物對高鹽及低溫引起的滲透脅迫的反應相似。乾旱等逆境均可導致植物產生脫落酸(ABA)，因此也經常把ABA與乾旱等逆境結合在一起進行研究。
現有的研究表明，當遇到乾旱時，植物會對乾旱做出反應，包括信號傳遞、基因表達及各種代謝變化，建立滲透調節平衡，保護植物免受傷害，以適應乾旱的環境，維持植物的生長及發育。在真核單細胞酵母中，其滲透調節途徑起始於獨立的雙組分信號組氨酸激酶Sln1或含SH3結構域的膜蛋白Sho1，通過激活共同的Hog1激酶而導致合成及積累滲透調節物質。在動物細胞中，滲透脅迫至少要激活p38，JNK，ERK5三種蛋白激酶。受這些研究的啟發，科學家也在植物中尋找能被滲透激活的蛋白激酶。目前在植物中，已發現有許多激酶基因或激酶可被滲透脅迫誘導或激活，但所有這些基因或激酶的確切功能尚不清楚。乾旱可調控植物中許多基因的表達，這些基因可分為ABA依賴型及非ABA依賴型兩類。一些直接調控乾旱誘導基因的調控因子已經被克隆。在植物中高表達某些調控因子，即使在非乾旱的條件下也可以調控一些乾旱誘導基因的表達，不同程度地提高植物的抗旱性。
泛素蛋白(Ubiquitin)是一種存在於各種真核生物中的非常保守的遍在蛋白。研究顯示，泛素蛋白介導引起的蛋白質降解是生物體維持自身正常生長發育和在逆境條件下生長的重要生理生化過程。泛素蛋白通過泛素蛋白系統起作用，該系統由3部分組成泛素蛋白(Ub)，蛋白泛素蛋白化(Ubiquitination)酶系(E1泛素激活酶，E2泛素結合酶，和E3泛素連接酶)和泛素蛋白循環酶系(Ub-C末端水解酶)，泛素蛋白化蛋白降解酶系(26S蛋白酶複合體)。通常，多聚泛素蛋白與靶蛋白結合轉運到26S蛋白體使其降解。目前，在擬南芥中，對參與蛋白降解調控的泛素連接酶研究取得一些進展，其中以COP1環指蛋白參與光調控途徑、單個亞基蛋白SINAT5參與生長素信號調控等具有深入的研究；而複合蛋白作為泛素連接酶的則以SCF-TIR1複合物降解IAA/AUX家族蛋白及SCF-COI1參與茉莉酸信號途徑調節研究較深入。

發明內容
本發明的目的是提供一種擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGFl在提高植物耐乾旱能力上的應用。
本發明採用基因晶片的方法從乾旱、冷和鹽誘導處理的擬南芥cDNA文庫中篩選發現擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGFl，其在GenBank中的編號是AT3G55530，該基因的cDNA長822bp，編碼273aa的蛋白。用SMART程序來分析預測AtRINGFl基因所編碼的蛋白，發現其C-端(211-252位)具有一個保守環指(RING FINGER)結構域(C3H2C3)，其N-端具有兩個跨膜區(35-52位，62-81位)。
本發明發現所述擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGFl的表達蛋白具有泛素蛋白系統中泛素連接酶(E3)活性；通過將AtRINGFl基因與GUS基因融合後轉化擬南芥，試驗結果發現乾旱處理不僅提高了根和葉片GUS的表達，而且還提高了氣孔保衛細胞及周圍葉肉細胞GUS的表達。該AtRINGFl基因可用於提高農作物對乾旱的耐受程度，降低農作物生長過程中水灌溉的成本，並可增加農作物的產量，具有重要的經濟意義和應用前景。
本發明的有益效果本發明通過基因晶片的方法發現了受乾旱脅迫誘導基因AtRINGFl，利用體外實驗鑑定發現其具有泛素蛋白系統中泛素連接酶(E3)活性；通過將AtRINGFl基因與GUS基因融合後轉化擬南芥，試驗結果發現乾旱處理不僅提高了根和葉片GUS的表達，而且還提高了氣孔保衛細胞及周圍葉肉細胞GUS的表達。AtRINGFl基因可用於提高農作物對乾旱的耐受程度，降低農作物生長過程中水灌溉的成本，並可增加農作物的產量，具有重要的經濟意義和應用前景。


圖1為SMART程序分析顯示AtRINGFl蛋白的兩個跨膜區；圖2為AtRINGFl蛋白及其突變後蛋白的體外泛素連接酶活性；圖3為ABA和乾旱處理下AtRINGFl基因的表達；圖4為AtRINGFl基因在擬南芥植物不同組織中的表達結果；圖5為AtRINGFl基因在不同的發育階段及不同脅迫處理下的表達結果；圖6為35S-AtRINGFl植株過量表達和突變體atringfl植株的分子鑑定及其表型；圖7為35S-AtRINGFl及atringfl突變體對ABA的敏感性；圖8為35S-AtRINGFl及atringfl突變體對乾旱的響應情況。
其中，在圖2中，左分別在E1，E2和32P-標記的泛素的作用下，MBP-AtRINGFl融合蛋白的泛素連接酶活性；右MBP-AtRINGFl融合蛋白及AtRINGFl蛋白的234位胺基酸突變後融合蛋白的泛素連接酶活性。在圖3中，上ABA處理；下乾旱處理。在圖5中，A為不同發育時期GUS的表達模式(a.發芽1天種子，b.發芽2天種子，c.3天齡幼苗，d.4天齡幼苗，e.5天齡幼苗，f.花，g.種莢)；B.NaCl和乾旱處理後的轉AtRINGFl啟動子-GUS的擬南芥幼苗中GUS表達(a.對照；b.300mM NaCl處理5小時；c.乾旱處理5小時)；C.乾旱處理後轉基因擬南芥保衛細胞中的GUS的表達(a.對照；b.乾旱處理30分鐘)(標尺20μm.)。在圖6中，AT-DNA插入突變體的葉片PCR設計示意圖；BT-DNA插入突變體的葉片PCR檢測的電泳圖(第1、2道野生型；第3、4道T-DNA插入突變體的F2代；M分子量標記)；C野生型、35S-AtRINGFl和atringfl植物Northern-blot分析；(28S rRNA為上樣量對照；第1、2道野生型；第3～7道5條35S-AtRINGFl的轉基因植株；第8、9道突變體atringfl)；D轉入土中生長3周的野生型、35S-AtRINGFl的轉基因植株和突變體atringfl植物的表型。在圖8中，(A)乾旱處理16天後植物的生長狀況及再澆水1天後恢復狀況；(B)離體葉片失水情況統計(剪取相同生長狀況的葉片於不同的時間點對其進行稱重)(n＝8)；(C)植物在超淨臺脫水處理4小時後的萎蔫情況；(D)野生型(a)，35S-AtRINGFl(b)和atringfl突變體(c)的氣孔電鏡圖。
具體實施例方式
實施例1 AtRINGFl蛋白的泛素連接酶活性採用體外表達AtRINGFl蛋白方法來考察其是否具有泛素蛋白連接酶活性，以pMal-C2為載體構建表達MBP-AtRINGFl融合蛋白的表達載體，並在大腸桿菌中表達，通過Amylose Resin純化後進行了AtRINGFl蛋白的泛素連接酶活性分析。在體外蛋白反應中，純化的MBP-AtRINGFl在合適的E1、E2、ATP和Ub的共同作用下，由於Ub是32P標記而便於檢測，32P-Ub可以與MBP-AtRINGFl連接，並且隨著32P-Ub的不斷增加，形成多聚鏈，從圖2左圖可以看出，MBP-AtRINGFl蛋白隨著32P-Ub的增加，其分子量也隨之增加，出現多條信號帶，而對照則沒有任何信號帶，該結果表明AtRINGFl蛋白具有泛素連接酶活性，能催化單體或多聚泛素的形成。
實施例2 AtRINGFl蛋白環指結構域為了研究環指結構域的完整性是否是AtRINGFl蛋白具有泛素連接酶活性所必需因素，通過對環指蛋白AtRINGFl蛋白的保守鋅連接配體進行點突變，構建了234位點的H(組氨酸)突變成Y(酪氨酸)的AtRINGFl蛋白突變體，研究發現該突變蛋白沒有泛素反應，如圖2右圖所示。該結果表明環指結構域的完整性決定了AtRINGFl蛋白的泛素連接酶活性。
實施例3 受乾旱誘導的擬南芥AtRINGFl基因微陣列(Microarray)分析的結果分析表明擬南芥AtRINGFl基因是一個受乾旱誘導的基因。為了進一步驗證該結果，我們進行了Northern雜交分析。用生長2周的擬南芥幼苗通過乾旱脅迫處理後，提取總RNA，作Northern分析。從圖3可見，乾旱處理，AtRINGFl基因的表達隨著時間的延長，其表達量也相對增加。該結果與微陣列分析的結果是相一致的，表明AtRINGFl基因在植物乾旱脅迫信號傳導過程具有重要的作用。
實施例4 AtRINGFl基因的體內表達分別提取生長了4周後的擬南芥的根、莖、葉、花和果莢的總RNA，採用AtRINGFl基因特異引物和Actin的特異引物進行RT-PCR，檢測AtRINGFl在擬南芥各個器官的表達。結果顯示擬南芥的根、莖、葉、花和果實均能檢測到AtRINGFl基因的表達，表明AtRINGFl基因的表達無組織特異性，在擬南芥各個器官均能表達，如圖4所示。
實施例5 AtRINGFl基因在發育過程中表達為了研究AtRINGFl在發育過程中的表達情況，我們根據擬南芥已公布的序列，設計一對引物(5』-AAGCTTCCCAACCAGAACATCAAAC-3』HindIII；5』-GGATCCGTCTTCCAAATTCACAAGAG-3』BamH I)，通過PCR擴增並克隆了AtRINGFl基因ATG上遊(不包括起始密碼子ATG)的啟動子區1.3Kb片斷，經HindIII和BamH I雙切後與酶切後的pBI101載體連接使其與GUS基因融合，該載體通過真空滲透法轉化野生型的擬南芥，通過組織化學染色觀察擬南芥各個生育階段GUS的表達情況。萌發2天後，在剛長出來的胚軸能檢測到較強的GUS；而萌發3天後，在根尖、根毛區和根毛具有強的GUS表達，而下胚軸則沒有；5天後，除了下胚軸不能檢測到GUS表達，其它部位均能檢測到；而在花中的柱頭和花葯具有強的GUS表達；在果莢中主要在其頂端和基部；葉片表面的氣孔也能檢測到較強的GUS表達。經300mM NaCl和乾旱處理5小時後，提高了葉片和根的GUS表達，見圖5B；乾旱處理還提高氣孔保衛細胞及周圍葉肉細胞GUS的表達，見圖5C。這與AtRINGFl基因是一個受鹽和乾旱誘導的基因是相一致的。
實施例6 AtRINGFl過量表達及突變體的分子及表型鑑定為了進一步研究AtRINGFl的功能，我們從SALK得到了其T-DNA插入突變體，其插入位置位於第5個外顯子中，見圖6A。首先我們通過觀察T2代的遺傳分離比，發現後代出現沒有分離的植株；為了進一步鑑定這些突變體是純合體，我們設計了兩對引物P1+P2和P1+P3(P1，正義；P2，反義；P3，反義，與T-DNA插入區的左側配對)，見圖6B。採用葉片PCR方法，用WT和突變體atringfl T2代的葉片同時擴增，結果發現用引物P1、P2擴增後，WT有一條650bp左右的帶，而atringfl則沒有。用P1、P3，則得到相反的結果，見圖6B。因此我們得到了T-DNA插入突變體是純合體。
通過將AtRINGFl基因的全長cDNA序列同強的啟動子35S融合，構建了正義表達載體並通過農桿菌介導真空滲透法轉化野生型的擬南芥。通過在含有Basta抗性的MS平板上篩選，得到了15株轉基因植株。並對其中的5株進行Northern雜交分析，其AtRINGFl表達水平均大大提高，圖6C。將過量表達AtRINGFl植株，WT(野生型)和其突變體atringfl植物種在土壤中，觀察其表型，三者之間沒有差異，見圖6D。
實施例7 35S-AtRINGFl植物及其突變體atringfl對ABA的敏感性實驗利用正向和反向遺傳學揭示植物ABA信號傳導中作用，種子萌發的抑制實驗是一種非常有用的方法(Giraudat，1995)。為了比較35S-AtRINGFl，WT和突變體atringfl對ABA的敏感性。我們將WT、35S-AtRINGFl和atringfl植物的種子播在包含各種濃度(分別為0μM，0.5μM，1μM，2μM和5μM)的ABA的MS培養基上萌發，當ABA濃度等於或高於0.5μM時，與WT和atringfl相比，35S-AtRINGFl植株對ABA較敏感，其種子萌發和根的生長受到嚴重的抑制，如圖7A。同時將在沒有ABA的MS培養基上萌發4天的幼苗，移到包含5μM ABA的MS培養基上垂直板上生長，8天後，觀察發現35S-AtRINGFl植株葉片最小、根最短，而其突變體atringfl植株葉片最大、根最長，見圖7B。此結果表明35S-AtRINGFl的萌發和其後生長均對ABA敏感。
實施例8 35S-AtRINGFl及atringfl突變體對乾旱的響應乾旱脅迫下，植物感應脅迫的器官合成並輸送某些信號物質到響應脅迫的器官，使之做出保護植物的反應。氣孔關閉則是重要的應答反應之一。ABA在乾旱脅迫誘導氣孔關閉的過程中起著信號轉導作用。為了研究AtRINGFl基因與水分吸收及氣孔的關係，我們將MS板上生長14天的WT、AtRINGFl和atringfl幼苗移到小盆中，正常生長10天後，持續乾旱處理16天後，WT、35S-AtRINGFl和atringfl植株均出現萎焉，澆水恢復1天後發現，AtRINGFl植株75％能恢復正常生長，WT植株50％能恢復正常生長，而atringfl植株只有20％能恢復正常生長，如圖8A所示。這表明AtRINGFl基因的過量表達提高了植物耐水分虧缺能力。
轉基因植物能提高耐水分虧缺能力，部分是由於具有較低的水分蒸發速率。因而我們也測定WT、35S-AtRINGFl和atringfl植物葉片失水的速率，失水150分鐘後，35S-AtRINGFl葉片的鮮重下降至65％左右，而atringfl葉片的鮮重下降至35％左右，如圖8B所示，這表明35S-AtRINGFl具有較慢的失水速率，而atringfl葉片具有更快的失水速率。為了進一步驗證三者之間的失水速率，將生長2周且在同一塊MS板上WT、35S-AtRINGFl和atringfl植株，連同培養基置於超淨臺上，發現atringfl的最快出現萎蔫症狀，脫水處理4小時後，atringfl幼苗的77％出現萎蔫症狀，WT幼苗的46％出現萎蔫症狀，而35S-AtRINGFl幼苗只有23％出現萎蔫症狀，如圖8C所示。
由於氣孔關閉是水分脅迫最重要的應答反應。我們觀察了WT、35S-AtRINGFl和atringfl生長於土壤中且灌溉良好和光照正常條件下的氣孔變化，如圖8D所示。發現發現轉35S-AtRINGFl植物的氣孔關閉的直徑及氣孔關閉的數量＞WT＞atringfl。
權利要求
1.一種擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGF1在提高植物耐乾旱能力上的應用，其特徵在於所述基因AtRINGF1來源於擬南芥cDNA文庫，其在GenBank中的編號是AT3G55530，編碼273個胺基酸。
全文摘要
本發明公開了一種擬南芥鋅指蛋白基因AtRINGF1的耐乾旱應用。本發明所述的AtRINGF1基因是用基因晶片的方法從乾旱、冷和鹽誘導處理的擬南芥cDNA文庫中篩選發現的，其在GenBank中的編號是AT3G55530，該基因的cDNA長822bp，編碼273 aa的蛋白。用SMART程序來分析預測AtRINGF1基因所編碼的蛋白，發現其C－端(211－252位)具有一個保守環指(RING FINGER)結構域(C3H2C3)，其N－端具有兩個跨膜區(35－52位，62－81位)。該AtRINGF1基因可用於提高農作物對乾旱的耐受程度，降低農作物生長過程中水灌溉的成本，並可增加農作物的產量。
文檔編號C12N15/82GK1614020SQ200410052370
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者謝旗, 陽成偉, 黎茵 申請人:中山大學