一種快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的膠體金試劑板的製作方法

2023-12-08 20:43:51 1

專利名稱：一種快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的膠體金試劑板的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的膠體金試劑板，具體涉及一種檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術：
硝基呋喃類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，主要包括呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮。硝基呋喃類藥物對大多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，而且價格低、藥效好，曾經在水產養殖業中廣泛使用。但是，硝基呋喃類藥物對畜禽有一定毒性，動物大劑量或長期連續應用硝基呋喃類藥物易引起中毒性反應，表現為厭食、腹瀉、胃腸出血、周圍神經炎、興奮、驚厥、癱瘓等，中毒嚴重時可引起動物死亡。同時，硝基呋喃類藥物也是一類具有潛在致癌和誘導有機體產生突變的物質。硝基呋喃類藥物在動物體內迅速代謝，代謝產物能與蛋白結合形成穩定化合物。這些代謝物可以在人類的胃液的酸性條件下從蛋白質中釋放出來而被人體吸收，從而對人類健康造成嚴重的危害。自發現硝基呋喃類藥物可存在的遺傳毒理學毒性，1995年歐盟全面規定禁止使用硝基呋喃類抗菌藥物，在動物源性食品中硝基呋喃類藥物及代謝物殘留的限值為不得檢出。2002年美國全面禁止將硝基呋喃類藥物用於食源性動物。2004年美國食品和藥物管理局(FDA)公布了禁止在進口動物源性食品中使用的11種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我國農業部於2002年4月發布193號公告，公布了《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》，規定在所有食品動物中禁止使用硝基呋喃類抗生素，2003年又將水產品硝基呋喃類代謝物納入殘留監控計劃。目前，用於檢測此類藥物及其代謝物殘留的方法主要有:分光光度法、液相色譜-紫外檢測器法( LC-UV)、高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)、高效液相色譜-質譜/質譜聯用(HPLC-MS/MS)以及酶聯免疫法(ELISA)等。分光光度法可以判定水產品中是否存在硝基呋喃類代謝物，且不需昂貴的儀器與試劑，樣品前處理操作簡單，有較好的推廣及應用價值，缺點是測定結果準確度較低。高效液相色譜法及其聯用技術是目前國內測定硝基呋喃類代謝物應用普遍、權威的方法，靈敏度和精確度高，但樣品前處理過程複雜、設備昂貴、檢測周期長、所需試劑繁多，且操作時需要專門的技術人員，難以滿足現代檢測快速、簡捷、現場化的要求。酶聯免疫吸附法是應用抗原抗體特異性反應和酶的高效催化作用來測定硝基呋喃類代謝物的分析方法，特異性高、靈敏度高、快速、簡便，但是酶的活性易受反應條件影響，測定結果重複性較差。此外酶聯免疫吸附法所需試劑壽命短，需低溫保藏。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，除了具備酶聯免疫法的諸多優點外，還克服了酶聯免疫法的一些不足。該方法將反應所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應通常只需數分鐘至數十分鐘，檢測結果以肉眼可見的顯色條帶來判讀。此法具有簡便快速、操作簡單、特異性強、不需要額外設備等優點。

實用新型內容為了克服現有硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測分析方法檢測時間長，成本高，需配備昂貴儀器設備，不適於大量樣本的現場快速篩檢的缺陷。本實用新型針對檢測需求，對水產品中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法展開研究，提供一種用於現場快速篩檢水產品中呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃西林代謝物(SEM)及呋喃妥因代謝物(AHD)的免疫膠體金快速檢測試劑板。本實用新型試劑板操作簡單、便捷，靈敏度高，實驗結果肉眼可直觀判斷，無需儀器設備配合測定，檢測既可在實驗室中操作，也可在野外、水產市場等地進行，90min內即可完成對樣品中硝基呋喃類代謝物的定性和半定量測定。本實用新型試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測水產品中的硝基呋喃類代謝物殘留。如果樣品溶液中含有硝基呋喃類代謝物殘留，代謝物先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的硝基呋喃類代謝物佔據而無法與檢測線上的硝基呋喃類代謝物特異性抗原結合；當樣品中的硝基呋喃類代謝物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較質控線淺甚至無顯色，則判定為陽性。相反，當樣品中硝基呋喃類代謝物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與質控線相近或偏深，則判定為陰性。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板、呋喃唑酮代謝物試紙條、呋喃西林代謝物試紙條、呋喃它酮代謝物試紙條和呋喃妥因代謝物試紙條組成。每個試紙條背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。其中樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有I 2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩衝體系可以中和樣品溶液的酸鹼度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。每個試紙條的膠體金結合墊上分別包被有相應的抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次分別包被有相應的硝基呋喃類代謝物-卵清蛋白(OVA)偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。本實用新型試劑板的各部分組成成分與功能如下:塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、質控區)的作用。背襯為一面塗有不乾膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維製成，起吸收樣品溶液與緩衝樣品溶液pH值的作用。膠體金結合墊由聚酯膜製成，其上標記有抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體與膠體金的偶聯物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。吸水墊為濾紙,作為吸水部分其作用是將移動上來的多餘的溶液吸收。本實用新 型試劑板具有如下有益效果:[0021](I)特異性好、靈敏度高本實用新型試劑板的抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體與其相應的硝基呋喃類代謝物的交叉反應率均為100%，與其他三項硝基呋喃類代謝物的交叉反應率均小於0.1%,與其他種類的抗生素包括磺胺類藥物、氯黴素、孔雀石綠等沒有交叉反應。本實用新型試劑板檢測呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物及呋喃妥因代謝物的靈敏度均可達到1.0 μ g/kg (ppb)，完全可以滿足市場的檢測需求。(2)操作簡便、快速本試劑板的操作不需任何專業培訓，只需按說明進行樣品前處理，滴樣後數分鐘內即可用肉眼判讀檢測結果。本實用新型試劑板將免疫層析反應所需的大部分原料已整合到試紙條中，滴樣後抗原抗體反應在固相膜上快速進行，滴樣後3 5min內即可讀取結果，且樣品前處理方法相同，四項硝基呋喃類代謝物可同時檢測，大大縮短了檢樣時間。(3)對實驗設備的依賴性小本實用新型試劑板在檢測組織中硝基呋喃類代謝物時，除在樣品前處理過程中需要用到一些輕便的小型儀器外，其它過程均不需要使用儀器。滴樣跑板後，通過肉眼判斷硝酸纖維素膜上檢測線和質控線的顏色深淺對比來判讀結果，此優點使其便於野外及現場操作。(4)成本低，效益好本實用新型試劑板生產工藝簡單，檢測過程中需要的試劑價格低廉，既可檢測單個樣本，也適用於大批量樣品同時檢測，生產成本低，大大降低了檢測費用。

圖1為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結合墊,3為硝酸纖維素膜,4為檢測線,5為質控線,6為吸水墊,7為不乾膠，8為PVC板。圖2為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為質控區，T為檢測區。圖3、4、5為硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中T為檢測區，C為質控區；圖3為陰性結果，圖4為陽性結果，圖5為無效。
具體實施方式
本實用新型試劑板的製備包括硝基呋喃類代謝物-載體蛋白偶聯物的製備、抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的製備、膠體金溶液的製備、金標抗體的製備和硝基呋喃類代謝物試劑板的組裝。1.硝基呋喃類代謝物-載體蛋白偶聯物的製備1.1免疫原的製備在安裝有磁力攪拌裝置的燒杯中加入蒸餾水IOmL和3mLlmol/L鹽酸(HCl)，再加入對醛基苯甲酸3. 0g，緩慢滴加二甲基甲醯胺(DMF)至對醛基苯甲酸完全溶解，測試pH約為4.0，攪拌中加入1.0gAOZ，攪拌溶解，60°C下反應過夜。得到白色固體,離心棄上清並水洗3次，即得呋喃唑酮代謝物對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)，避光保存。[0037]稱取23.4mg CPAOZ 溶於 2mL DMF,攪拌加入 27.5mg 的 DCC，14.4mg 的 NHS，4°C反應過夜，4500r/min離心IOmin,取上清液標記為A液。取170mg的BSA溶於IOmL0.1mol/L的PBS (ρΗ8.0)緩衝溶液，加入ImL的DMF溶解，標記為B液。將A液逐滴加入到B液中，同時攪拌，4°C下密封反應4h。4500r/min下離心IOmin,取上清液,4°C下PBS(pH7.4)透析3d，每天換液2次。反應產物即為呋喃唑酮代謝物-牛血清蛋白偶聯物(CPAOZ-BSA)，保存於-20°C冰箱備用。採用同樣方法製備呋喃西林代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物-牛血清蛋白偶聯物。1.2包被原的製備用卵清蛋白(OVA)替代牛血清蛋白(BSA)，採用同樣方法製備硝基呋喃類代謝物-卵清蛋白偶聯物。2.抗硝基呋喃類代謝物單克隆抗體的製備2.1抗血清的製備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的CPAOZ-BSA偶聯物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之後每隔2周加強免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d用不加佐劑的抗原強化免疫I次，劑量加倍。細胞融合按常規方法進行:將Sp2/0多發性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1: 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養基懸浮，分種於96孔培養板中，37°C、5% CO2培養箱中培養。融合後，待細胞生長到培養孔面積的1/4時，採用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇50yg/L BSA包被酶聯板，被測孔加培養上清，孵育、清洗後，加入羊抗鼠IgG-HRP(l: 1000)，OPD顯色。篩選出的陽性孔再用CPAOZ-OVA偶聯物包被的酶聯板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養上清與2X 10_3mol/L CPAOZ溶液等量混合，37V反應lh，加入已包被的酶標板中。另·外用PBS (0.0lmol/L、pH7.4)替代CPAOZ溶液作對照，其餘步驟同上。若CPAOZ阻斷後的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經2 3次檢測都呈陽性的孔，用有限稀釋法進行克隆化。2.2擴大培養取6 8周齡Balb/c小鼠，腹腔注入0.5mL不完全弗氏佐劑。7 IOd後接種
0.5mL約2X106個/mL數量的陽性雜交瘤細胞，同時接種相同數量的Sp2/0細胞，作為陰性對照。接種後7 IOd可見小鼠腹部明顯膨大,用注射器抽取腹水。3000r/min離心15min,
棄去沉澱，收集上清。採用同樣方法製備抗AMOZ單克隆抗體、抗SHM單克隆抗體、抗AHD單克隆抗體。將四種單克隆抗體純化後進行抗體蛋白質量濃度測定，分裝、保存於_20°C冰箱中。3.膠體金溶液的製備在IOOmL去離子水中加入ImLl %檸檬酸三鈉，煮沸後迅速加入ImLl %氯金酸，繼續煮沸lOmin，冷卻後，4°C下保存備用。經試驗篩選，測定該膠體金顆粒的粒徑約為40nm。4.金標抗體的製備 取已製備好的膠體金溶液IOOmL,用0.lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪拌邊分別加入2mg抗AOZ單克隆抗體，攪拌20min,逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20000rpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmL ρΗ7.4 的 PBS 緩衝液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。將沉澱用IOmL ^ 2% BSA的PBS緩衝液(ρΗ7.4)溶解，用0.22 μ m無菌過濾器過濾後，4°C保存備用，即為金標抗AOZ單克隆抗體。採用同樣方法製備金標抗AMOZ單克隆抗體、金標抗SEM單克隆抗體、金標抗AHD單克隆抗體。5、硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝用點膜機把適當濃度的呋喃唑酮代謝物-卵清蛋白偶聯物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，37°C烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備好的金標抗AOZ單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。大卡組裝完畢後，乾燥箱內烘乾。然後用切割機將貼好的大卡切割成3.84mm寬的條，即為呋喃唑酮代謝物試紙條。採用同樣方法製備呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因代謝物檢測試紙條。依次將A0Z、AM0Z、SEM和AHD試紙條裝入塑料模板中製成檢測試劑板，組裝完畢後再放入帶乾燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.硝基呋喃類代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6.1樣品前處理取一定量的去脂肪組織樣本，用剪刀剪碎，稱取2g剪碎樣本於50mL離心管中，並加入4mL去離子水,0.5mLlM的鹽酸,0.1mL樣本衍生化試劑,充分混合3min。60°C水浴條件下孵育lh，取出後加入5mL0.1M的磷酸氫二鉀，0.4mLlM的氫氧化鈉，6mL提取劑，充分混合lmin, 4000r/min 離心5min。移取上層溶液3mL於5mL離心管中，65°C下空氣吹乾，向吹乾的試管中加入ImL淨化劑,加蓋振蕩lmin,然後加入0.5mL復溶液,充分混勻,4000r/min離心Imin (或靜置至明顯分層),吸取0.4mL下層溶液,待檢。6.2檢測步驟水平放置檢測板，用滴管分別吸取待檢樣品處理溶液100 μ L，滴加到加樣孔中，力口樣後開始計時；結果應在3 5min讀取,其他時間判讀無效。6.3結果判斷讀取結果時，將試劑板水平置於觀察者正面。陰性(一):T線顯色(檢測線，靠近加樣孔一端)比C線(對照線)深或一樣深，表示樣品中硝基呋喃代類謝物殘留含量低於檢測限或不含硝基呋喃類代謝物。陽性⑴:Τ線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中硝基呋喃類代謝物殘留含量等於或高於檢測限，T線顯色比C線越淺，表示樣品中硝基呋喃類代謝物含量越高。無效:未出現C線，可能是操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，並用新的試劑板重新測試。
權利要求1.一種快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的膠體金試劑板，試劑板由上下兩塊塑料模板、呋喃唑酮代謝物試紙條、呋喃西林代謝物試紙條、呋喃它酮代謝物試紙條和呋喃妥因代謝物試紙條組成，每個試紙條背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特徵在於樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間有I 2mm的重疊。
2.根據權利要求1所述的試劑板，其特徵在於硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次分別包被有相應的硝基呋喃類代謝物-卵清蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。
3.根據權利要求1所述的試劑板，其特徵在於背襯為一面塗有不乾膠的PVC板，樣品墊由玻璃纖維製成，膠體金結合 墊由聚酯膜製成，吸水墊為濾紙。
4.根據權利要求1所述的試劑板，其特徵在於膠體金顆粒的平均大小為40nm。
專利摘要本實用新型涉及一種快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的膠體金試劑板，可用於快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板、呋喃唑酮代謝物試紙條、呋喃西林代謝物試紙條、呋喃它酮代謝物試紙條和呋喃妥因代謝物試紙條組成，每個試紙條背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質控線，硝基呋喃類代謝物檢測結果能夠以肉眼可見的顏色判斷。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需90min，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利於大規模樣本篩選，適合工商部門、檢驗檢疫機構、水產養殖、加工企業對水產中的硝基呋喃類代謝物進行大規模快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK203148953SQ20132007753
公開日2013年8月21日 申請日期2013年2月19日 優先權日2013年2月19日
發明者吳光紅, 楊洪生, 吳茂生, 黃奕雯, 王偉萍, 王振國, 苑淑賓 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司