白念珠菌ctd蛋白激酶基因及其用途的製作方法

2023-12-08 20:05:31

專利名稱：白念珠菌ctd蛋白激酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼白念珠菌CTD蛋白激酶基因CaSRB10的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。CaSrb10是一種白念珠菌菌絲生長和毒性相關因子。
背景技術：
白念珠菌也稱為白色念珠菌(Candida albicans)，它是一種臨床上分離到的一種機會性人體致病真菌，在免疫下調的病人中，如器官移植病人，愛滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等疾病，也可以侵入表皮和內皮細胞進入血液到達內臟器官，如腎臟，腦部等，導致敗血症，嚴重可以導致死亡(Odds，F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31S2-S5.)。
白念珠菌在不同的生長條件下，呈現不同的生長形態，包括菌體(yeast form)，假菌絲(pseudohyphae)和菌絲(hyphae)。各種形態之間的相互轉化能力直接影響白念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.1245-93；Brown，A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7334-338.)，而形態轉換缺陷的菌株其系統感染能力下降或消失(Lo，H.J.et al，1997.Cell.90939-949；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.204753-61；Hwang，C.S.et al.2003.Mol Microbiol.471029-43)。
最近有些實驗室利用減毒菌株作為疫苗來免疫小鼠，取得了比較好的效果，並對其進行了深入的生物化學上的分析，為將來疫苗的發明提供了相應的理論基礎(Elena FA et al，Proteomics 2004，4，3007-3020；Elena FA et al，Proteomics 2004，4，1204-1215)。
許多培養條件可以引起白念珠菌的形態轉換，包括血清，溫度，pH值，氮源利用以及氧壓等等。細胞內調節白念珠菌形態轉換的分子機制主要有MAPK途徑(mitogen-activaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途徑(cAMP-dependentprotein kinase A pathway)。同時還發現Cph2介導的，Efg1介導的以及pH應答的信號途徑也都和白念珠菌的形態發生相關(Lane，S.et al.2001.Mol Cell Biol.216418-28；Stoldt，V.R.，et al.1997.EMBO J.161982-1991；El Barkani，A.et al.2000.Mol CellBiol.204635-4647.)。
在白念珠菌中還存在抑制效應的信號途徑，主要是Tup1介導的信號途徑，依靠特異性DNA結合抑制因子Rfg1，Nrg1等來發揮作用(Kadosh，D.et al.2001.MolCell Biol.212496-2505；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.204753-4761.)。
由於白念珠菌會嚴重威脅人們的身體健康，因此，本領域迫切需要開發與白念珠菌的生長、感染過程或毒性有關的各種蛋白或因子，以便更好地防治白念珠菌引起的感染。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的與白念珠菌毒性有關的CTD蛋白激酶CaSrb10蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種新穎的、分離出的白念珠菌CTD蛋白激酶CaSrb10多肽，它包括具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個(如1-50個，較佳地1-20個，更佳地1-10個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，並且具有調控白念珠菌絲狀生長的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選白下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述白念珠菌CaSrb10多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(i)具有SEQ ID NO1中1-1824位的序列；(ii)具有SEQ ID NO1中1-1827位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有白念珠菌CaSrb10蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達白念珠菌CaSrb10蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有白念珠菌CaSrb10蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的白念珠菌CaSrb10多肽特異性結合的抗體。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗白念珠菌CaSrb10多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaSrb10多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是白念珠菌CaSrb10多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaSrb10蛋白的方法，它包括將樣品與CaSrb10蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaSrb10蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與白念珠菌CaSrb10多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。本發明多肽可被用於篩選促進白念珠菌CaSrb10多肽活性的激動劑，或者篩選抑制白念珠菌CaSrb10多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的白念珠菌CaSrb10蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
在一個優選例中，白念珠菌CaSrb10多肽或基因被用於製備檢測白念珠菌的試劑，或者篩選抑制CaSrb10表達或活性的抑制劑或拮抗劑，或作為篩選抑制CaSrb10表達或活性的靶點。
在一優選例中，提供了一種CaSRB10基因的用途，它用於製備casrb10/casrb10缺失株。這種casrb10/casrb10缺失株能使小鼠對野生型的白念珠菌產生免疫力，可在此基礎上開發有用的疫苗。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt％)的本發明的白念珠菌CaSrb10多肽的拮抗劑或抑制劑或抗體以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可抑制白念珠菌的毒性進而防止白念珠菌的感染。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1A顯示了白念珠菌CaSRB10基因開放閱讀框的脫氧核糖核苷酸序列。
圖1B顯示了白念珠菌CaSrb10蛋白的胺基酸序列。
圖1C顯示了白念珠菌CaSrb10與釀酒酵母ScSrb10胺基酸序列比較。羅馬數字表示的是11個保守的激酶亞結構域。
圖2A顯示了在白念珠菌中敲除CaSRB10基因的策略及其染色體上的酶切位點。
圖2B顯示了在白念珠菌CaSRB10基因的敲除過程中各種菌株的Southern雜交圖譜。所用探針為CaSRB10編碼框3』端的1.2kb片段(如圖所示)。
圖3A顯示了白念珠菌casrb10/casrb10缺失株在菌體生長條件下在固體培養基和液體培養基上的形態，培養條件為SD固體培養基30℃培養5天；YPD液體培養基，30℃培養12個小時。
圖3B顯示了白念珠菌casrb10/casrb10缺失株在菌體生長條件下對菌絲特異性基因表達的影響。YPD液體培養基，30℃培養12個小時。
圖4顯示了casrb10/casrb10缺失株與tup1/tup1缺失株形態的比較圖5A顯示了在小鼠系統感染實驗中，CaSRB10基因的敲除使白念珠菌毒性降低，注射液濃度為5×107細胞/毫升，每隻小鼠尾靜脈注射100μl菌液，共注射8隻小鼠。
圖5B顯示了在小鼠系統感染實驗中，注射過casrb10缺失株的小鼠對野生型的白念珠菌產生了一定的免疫力。
具體實施例方式
本發明人通過廣泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一種CTD蛋白激酶。具體地，本發明人利用生物信息學比較分析和PCR技術，從白念珠菌的基因組克隆了一個新基因，該基因編碼的產物和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的SRB10基因編碼的蛋白具有一定的同源性，同源性達50％，它們的激酶亞結構域也非常相似，因此命名為CaSRB10。利用同源重組原理，在白念珠菌中敲除CaSRB10基因，構建了casrb10/casrb10缺失株，該缺失株在YPD，30℃的培養條件下，生長狀態為伸長的假菌絲。同tup1/tup1缺失株相比，它的這種假菌絲狀態不是很均勻，中間混雜了30％左右的酵母形態的菌體。在Lee’s培養基，37℃菌絲誘導的培養條件下，casrb10/casrb10缺失株可以形成菌絲，而tup1/tup1缺失株依然以長的假菌絲形態生長。小鼠系統感染實驗表明casrb10/casrb10缺失株相對於野生型來講毒性減低。在接種casrb10/casrb10缺失株後，存活下來的小鼠對野生型白念珠菌有一定的免疫力。這些結果表明，CaSrb10在白念珠菌中是一個重要的毒性因子。在此基礎上完成了本發明。
在本發明中，術語「CaSrb10蛋白」、「CaSrb10多肽」或「CTD蛋白激酶CaSrb10」可互換使用，都指具有白念珠菌CTD蛋白激酶CaSrb10胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的CTD蛋白激酶CaSrb10。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的CaSrb10蛋白或多肽」是指CaSrb10多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化CaSrb10蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括白念珠菌CaSrb10蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然白念珠菌CaSrb10蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「白念珠菌CaSrb10多肽」指具有白念珠菌CaSrb10蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與白念珠菌CaSrb10蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括白念珠菌CaSrb10蛋白的活性片段和活性衍生物。該術語還包括與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％序列相同性，並且具有QQ功能的多肽。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與白念珠菌CaSRB10 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaSrb10多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaSrb10多肽或其片段的融合蛋白(如與GST、6His等形成的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了白念珠菌CaSrb10多肽的可溶性片段。通常，該片段具有白念珠菌CaSrb10多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
本發明發明還提供白念珠菌CaSrb10蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然白念珠菌CaSrb10多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「白念珠菌CaSrb10蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ IDNO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼CaSrb10蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的白念珠菌CaSRB10核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明的CaSrb10蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明的CaSrb10蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或CaSrb10蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的CaSrb10多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼白念珠菌CaSrb10多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，白念珠菌CaSRB10多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含白念珠菌CaSRB10編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的白念珠菌CaSrb10蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)用於篩選促進或對抗CaSrb10蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組白念珠菌CaSrb10蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制白念珠菌CaSrb10蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對白念珠菌CaSRB10 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。「特異性」是指抗體能結合於白念珠菌CaSRB10基因產物或片段。較佳地，指那些能與白念珠菌CaSRB10基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制白念珠菌CaSrb10蛋白的分子，也包括那些並不影響白念珠菌CaSrb10蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的白念珠菌CaSRB10基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的白念珠菌CaSRB10基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達白念珠菌CaSrb10蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷白念珠菌CaSrb10蛋白功能的抗體以及不影響白念珠菌CaSrb10蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用白念珠菌CaSRB10基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與白念珠菌CaSRB10基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗白念珠菌CaSrb10蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的白念珠菌CaSrb10蛋白。
本發明中的抗體可用於治療或預防與白念珠菌CaSrb10蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷白念珠菌CaSrb10蛋白的產生或活性。
抗體也可用於設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如白念珠菌CaSrb10蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅表達CaSrb10蛋白的白念珠菌。
多克隆抗體的生產可用白念珠菌CaSrb10蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
利用本發明的CaSrb10蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與CaSrb10蛋白發生相互作用的物質，如抗體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明的CaSrb10蛋白的抗體、抑制劑、或拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)口腔內、陰道內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
例如，本發明的CaSrb10蛋白的抗體、抑制劑、或拮抗劑可直接用於疾病治療，例如，用於抑制白念珠菌的正常生長，進而減輕白念珠菌造成的感染。在使用本發明CaSrb10蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如其他抗真菌劑氟康唑等。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的抗CaSrb10多肽的抗體或其拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CaSrb10蛋白的拮抗劑或抗體施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
能與白念珠菌CaSrb10蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，宜對白念珠菌CaSrb10蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測白念珠菌CaSrb10蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的白念珠菌CaSrb10蛋白水平，可以用作判斷白念珠菌是否會造成嚴重的感染。
一種檢測檢測樣品中是否存在CaSrb10蛋白的方法是利用CaSrb10蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CaSrb10蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaSrb10蛋白。
CaSrb10蛋白的多聚核苷酸可用於CaSrb10蛋白相關疾病的診斷。在診斷方面，CaSrb10蛋白的多聚核苷酸可用於檢測CaSrb10蛋白的表達與否。如CaSRB10 DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷CaSrb10蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CaSrb10蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測CaSrb10蛋白的轉錄產物。
檢測CaSRB10基因的突變也可用於診斷CaSrb10蛋白相關的疾病。CaSrb10蛋白突變的形式包括與正常野生型CaSRB10 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從白念珠菌基因組文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1827個鹼基，其開放讀框位於1-1824位，編碼全長為608個胺基酸的白念珠菌CaSrb10蛋白(SEQ ID NO2)。CaSrb10蛋白為預防和治療白念珠菌感染提供新的治療途徑，具有潛在的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例材料限制性內切酶、T4 DNA連接酶、探針標記試劑盒均購自美國Invitrogen公司；消解酶(Zymolyase 100T)購自日本Seikagaku公司；用於PCR擴增的KOD plus購自日本的Toyobo公司。
通用方法(1)白念珠菌基因組DNA抽提白念珠菌培養過夜用ddH2O洗1次，懸浮在500μl溶液A中(1M山梨醇，100mMEDTA pH8.0)，加入5μl 20mg/ml的消解酶(Zymolase)，37℃放置1小時後，高速離心去上清，細胞用500μlTE緩衝液(20mM Tris.HCl pH7.5，1mM EDTA)洗一次，懸浮在350μlTE緩衝液中，並加入90μl溶液B(250mM EDTA pH8.0，400mM Tris.HClpH8.0，2％SDS)，65℃放置30分鐘，加入80μl5M KAc，冰上放置1小時，高速離心5分鐘，吸取上清並加入1ml的無水乙醇，-20℃放置20分鐘，高速離心5分鐘，沉澱用70％乙醇洗一次，離心後烘乾。
(2)Southern分析白念珠菌基因組DNA抽提後，基因組DNA用BamHI和SstI完全酶切，電泳完成後的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min，尼龍膜用雙蒸水或10×SSC浸透，搭好轉膜平臺，膠與膜間用Parafilm封閉，加一個500g砝碼。以10×SSC為轉膜液轉移過夜，第二天漂洗晾乾交聯。交聯後的膜裝入雜交管，加入10ml預雜交液(6×SSC，5×denhardt’s Reagent，0.5％SDS，100μg/ml魚精DNA於42℃預雜交12h，探針在100℃變性5min，加入150μl(約1/3所標記的探例)42℃雜交10-16h。0.1×SSC，0.1％SDS洗兩到三次，每次40min，取出膜，晾乾，室溫或-70℃壓片。探針標記用Invitrogene公司的隨機引物標記試劑盒，照其說明操作。將含25ng DNA的溶液於100℃加熱變性5-10min，置於冰浴中，再依次加入隨機引物緩衝液混合物(Random Primers Buffer Mixture)，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-32p]-dATP(10μCi/μl)，混勻後加入1μl Klenow酶，於25℃保溫1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm離心4min，收集離心液，即為純化後的探針溶液。探針於100℃變性5min冰上冷卻後加入雜交體系中。
(3)Northern分析用熱酚法抽提白念珠菌總RNA，以及Northern雜交分析方法按以下方式進行各菌株在YPD，30℃中培養至對數生長期後期，再轉接至YPD培養基，起始OD＝0.05，並在相應溫度下培養指定時間，用熱酚法抽提白念珠菌總RNA。20μl上樣量包括RNA樣品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10×MOPS，2μl上樣緩衝液、65℃加熱10min，0℃冷卻2min，離心5s，上樣。電泳在含甲醛的變性膠上進行(1g瓊脂糖，10ml 10×MOPS，87mI DEPC處理水，加熱融化稍冷後加入2.7ml 37％甲醛)。電泳條件為100mA，50-70V，5-7h電泳完成後同樣用毛細法轉膜，轉膜液用5×SSC。轉膜過夜後，取出膜，不能使膜幹透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3 protocol紫外交聯，加入10ml預雜交液，65℃，2h後更換為10ml雜交液，加入探針65℃雜交過夜，用2×SSC，0.1％SDS，65℃洗膜兩次，每次30min。雜交好的膜不要晾乾，用保鮮膜包好後-70℃壓片。重雜交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加熱5-10min，或按照Clontech推薦用0.5％SDS，90-100℃加熱10min後讓其自然冷卻10min後取出備用，若不立即使用，用保鮮膜包好後置於-20℃保存。
(4)白念珠菌和釀酒酵母的轉化準備PEG/LiAc溶液(pH7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入質粒(如果轉釀酒酵母，質粒0.1μg，如果轉白念珠菌，線形化質粒大約5μg)，10μl 10mg/ml魚精DNA，混勻；加入0.1ml感受態細胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混勻；30℃200rpm培養30min；加入70μl DMSO，輕輕混勻；42℃熱衝擊15min，期間不時輕輕搖勻；冰浴～2min高速離心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重懸細胞；塗布於適當的營養篩選SD平板上。
(5)小鼠系統感染實驗。
以體重在16-18g ICR雄性小鼠為實驗對象，通過尾靜脈注射100μl白念珠菌各菌株，並培養觀測25天。各個菌株注射濃度為5×107細胞/毫升。
實施例1白念珠菌CaSRB10基因的獲得及序列分析利用同源序列搜索的方法，在白念珠菌(Candida albicans)基因組序列中(http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB/)進行搜索。
根據搜索結果，合成以下引物上遊引物ATGAGTTATAGTTCAGCTTC(SEQ ID NO3)下遊引物CTACCCACGTTTCTTTCTAAT(SEQ ID NO4)以野生型白念珠菌基因組DNA為模板，通過常規的PCR反應獲得長度約2.0Kb的擴增產物。
通過合成一系列引物對擴增產物所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，該擴增產物所含的全長DNA是一個新的DNA序列(如SEQ ID NO1和圖1A所示)，編碼一個新的608個胺基酸的蛋白質(如SEQ ID NO2和圖1B所示)。
利用BLAST結構域搜索和同源性比較分析，發現該基因編碼產物和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的SRB10基因編碼產物具有一定的同源性，同源性達50％，因此把這個基因命名為CaSRB10，其對應的編碼蛋白產物為CaSrb10。
結構域分析表明CaSrb10和ScSrb10的激酶亞結構域非常相似(圖1C)。從序列比較分析得知，白念珠菌CaSRB10基因是釀酒酵母ScSRB10基因的同源基因，白念珠菌CaSrb10是釀酒酵母ScSrb10的同源蛋白。
白念珠菌CaSRB10基因的核苷酸序列已送GenBank登錄，在本申請之前尚未公開。
實施例2白念珠菌基因CaSRB10的敲除為了研究CaSRB10基因在白念珠菌形態發生中的功能和作用，本實施例首先在白念珠菌中敲除CaSRB10基因。敲除策略見圖2A體外構建了CaSRB10基因敲除質粒，把CaSRB10開放閱讀框(open reading frame，ORF)中約1.7kb DNA片段用HisG-URA3-HisG替代，通過同源重組的方法，可以把染色體上的CaSRB10基因中的1.7kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG給替換掉，從而敲除染色體上的CaSRB10基因。篩選標誌URA3和一個拷貝HisG序列可以在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上通過兩個同向HisG同源序列在同一條染色體上的重組而環出，丟失了URA3篩選標誌的重組子可以在5-FOA平板上通過負向篩選得到(Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197345-346.)，從而可以進行下一輪的轉化進而敲除另一條染色體上的CaSRB10基因。
具體方法如下
利用5』引物CGGAATTCTTGGTGCTGGTAATAACGACAAGGA(SEQ ID NO5)和3』引物CGAGATCTCCATAAGTACCAGCAGCAATATATC(SEQ ID NO6)從野生型白念珠菌株基因組DNA中用PCR的方法擴增大約0.8kb的片段，連接到質粒pCUB6(Praveen Singh等人，Infect Immun.2001 December；69(12)7898-7903)的EcoRI-BglII位點，利用5』引物CAGGATCCGACAATGATATAATGACCACTGCA(SEQ ID NO7)和3』引物ACGCATGCTGGAAGACTGAAATCTTCATCAAC(SEQ ID NO8)從野生型白念珠菌株基因組DNA中用PCR的方法擴增大約0.6kb的片段，繼續連接到質粒pCUB6的BamHI-SphI位點，從而體外構建了CaSRB10基因敲除質粒pCaSRB10-KO，在此質粒中CaSRB10開放閱讀框(open reading frame，ORF)中約1.7kb DNA片段被HisG-URA3-HisG替代。質粒pCaSRB10-KO用PstI和SphI酶切並轉化白念珠菌ura-營養缺陷型菌株，在缺少尿嘧啶的合成培養基上可以篩選到轉入質粒的轉化子。通過0.8kb和0.6kb兩個同源片段和基因組上的CaSRB10同源片段重組，可以把染色體上的CaSRB10基因中的1.7kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG給替換掉，從而破壞染色體上的CaSRB10基因，正確插入的轉化子通過Southern雜交分析確定。然後將正確插入的轉化子塗在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上，由於5-氟乳清酸對含有URA3的菌株來說是具有毒性的，所以可以通過兩個同向HisG同源序列在同一條染色體上的重組而將URA3環出，那麼在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上長出的都是丟失了URA3篩選標記的重組菌。利用丟失了URA3篩選標記的重組菌可以進行下一輪的轉化進而敲除另一條染色體上的CaSRB10基因。
CaSRB10基因的敲除結果用Southern雜交技術進行檢測與鑑定，用BamHI和SstI酶切各個菌株基因組DNA，用1.2kb片段作探針雜交。根據白念珠菌基因組序列(http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB/)，發現CAI4顯示一條雜交條帶，單拷貝缺失株顯示兩條雜交條帶，在5-FOA平板上將一份拷貝的HisG和URA3環出後，又出現了一條較小的雜交條帶，通過第二輪的轉化，可以將染色體上第二拷貝的CaSRB10基因敲除。圖2B顯示了CaSRB10基因敲除過程中各個菌株的Southern雜交分析圖譜。
結果表明經過兩輪的敲除，兩個拷貝的CaSRB10基因分別被敲除，得到casrb10/casrb10缺失株(圖2B)。
實施例3CaSRB10基因的敲除對白念珠菌形態的影響在實施例2中，通過同源重組的方法在白念珠菌中敲除了CaSRB10基因，Southern雜交分析確證這個敲除是成功的，得到了CaSRB10缺失株。對該CaSRB10缺失株進行觀察，結果發現，CaSRB10基因的敲除，引起了白念珠菌一系列細胞和菌落形態的變化。在SD固體培養基30℃培養5天之後，缺失株的菌落表面有很多褶皺，而且菌落扁平，貼在瓊脂表面，只剩下一個拷貝的CaSRB10基因的菌株菌落表面也略微有些褶皺。而野生型，回復菌株都呈現出半球形，平滑的菌落(圖3A)。在YPD液體培養基培養12個小時之後，缺失株的生長狀態為伸長的假菌絲，只有一個拷貝CaSRB10基因的菌株，有些細胞也略有伸長，說明CaSRB10在胞內發揮作用也受其劑量的影響(圖3B)。
另外，還用常規方法，檢測了CaSRB10基因的缺失對菌絲特異性基因表達的影響，在30℃，YPD培養條件下，缺失株中菌絲特異性基因也有一定的表達，結果與缺失株在此條件下的形態相吻合。
實施例4casrb10/casrb10缺失株與tup1/tup1缺失株形態的比較CaSrb10和Tup1都是白念珠菌絲狀生長的負調控因子，但是它們缺失株的形態卻不完全相同。在YPD，30℃的培養條件下，casrb10/casrb10缺失株和tup1/tup1缺失株都能生長為伸長的假菌絲，但是同tup1/tup1缺失株相比，casrb10/casrb10缺失株的假菌絲狀態不均勻，中間混雜了30％左右的菌體。在Lee’s，37℃菌絲誘導的培養條件下，casrb10/casrb10缺失株可以形成菌絲，而tup1/tup1缺失株依然以假菌絲的形態存在(圖4)。說明tup1/tup1缺失株喪失了形態轉變的能力，只是以單一的假菌絲形態生長，而casrb10/casrb10缺失株形態轉變的能力並沒有完全喪失，能夠以酵母態，菌絲態和假菌絲形態生長，但是形態之間的轉換能力下降。這表明，CaSRB10具有調控白念珠菌絲狀生長的功能。
實施例5CaSRB10基因的敲除對白念珠菌毒性的影響CaSRB10基因的敲除影響了白念珠菌的形態，本實施例中，通過小鼠尾靜脈注射野生型菌株和缺失株進行小鼠系統感染實驗來檢測CaSRB10基因的破壞是否導致了菌株毒性下降。
結果(a)CaSrb10在白念珠菌中是一個重要的毒性因子野生型菌株有較強的毒性，小鼠在注射了5×106野生型細胞後於14天後全部死亡；同樣條件下，小鼠注射了5×106casrb10/casrb10缺失株細胞後，25天之後仍有6隻小鼠存活，而注射了5×106tup1/tup1缺失株的小鼠都可以存活25天以上。這證明casrb10/casrb10缺失株相對於野生型菌株毒性減低(圖5A)，而tup1/tup1缺失株則沒有毒性，這與白念珠菌形態轉變能力與其毒性直接相關相一致。因此，CaSrb10在白念珠菌中是一個重要的毒性因子，而casrb10缺失株是一個重要的遺傳背景清楚的減毒株。
(b)casrb10/casrb10缺失株能使小鼠對野生型的白念珠菌產生免疫力最近有些實驗室利用減毒菌株作為疫苗來免疫小鼠，取得了比較好的效果(Elena FA et al，Proteomics 2004，4，3007-3020；Elena FA et al，Proteomics 2004，4，1204-1215)。因此，本實施例中，還檢測casrb10/casrb10缺失株作為減毒菌株能否可以使小鼠產生免疫力。方法如下採用注射過casrb10/casrb10缺失株25天後仍然存活的小鼠(共6隻)，再一次向其體內注射5×106野生型的白念珠菌，再過25天後，發現6隻小鼠有兩隻依然存活。而沒有注射過casrb10/casrb10缺失株的小鼠，注射5×106野生型的白念珠菌後，6天之後8隻小鼠全部死亡(圖5B)。這說明先注射casrb10/casrb10缺失株能使小鼠對野生型的白念珠菌產生免疫力。因此，可以在此基礎上發展潛在的有用的疫苗。
實施例6CaSrb10蛋白重組表達和純化在該實施例中，以實施例1中的PCR擴增產物為模板，用序列如下的5』和3』端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得白念珠菌CaSRB10 DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5』端寡核苷酸引物序列為5』-CGGGATCCATGAGTTATAGTTCAGCTTC-3』(SEQ ID NO9)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3』端引物序列為
5』-CGGGATCCCTACCCACGTTTCTTTCTAAT-3』(SEQ ID NO10)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和白念珠菌CaSRB10的部分編碼序列。
白念珠菌CaSrb10蛋白cDNA PCR產物純化後經BamHI酶切再與質粒pGEX-2T(購於美國Invitrogen公司)按常規方法重組形成載體pGEX-2T-CaSRB10並轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆用EcoRI酶切鑑定插入方向，酶切產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。鑑定後純化並測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。經測序證實，已插入了完整的CaSRB10編碼序列。
挑表達CaSRB10的陽性DH5α克隆接種於100ml 2×YTA培養基中，37℃300rpm振蕩培養12-15hr，1∶10稀釋於預熱的2×YTA培養基繼續振蕩培養1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM後30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎後再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然後12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾後，過1ml 50％穀胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌後，加入500ul穀胱甘肽洗脫緩衝液(10mM穀胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘後收集洗脫液，重複洗脫2-3次，得到白念珠菌CaSrb10蛋白。
實施例7抗CaSrb10蛋白抗體的產生將實施例6中獲得的重組白念珠菌CaSrb10蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱白念珠菌CaSrb10蛋白基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明的CaSrb10蛋白發生結合。
討論白念珠菌(Candida albicans)是一種人體機會性致病真菌，能引起廣泛的深部和淺部感染，但是其真正的致病因子和致病機理沒有完全研究清楚。
近年的研究表明，Cdc2相關的蛋白激酶，細胞周期因子依賴的蛋白激酶，以及G1期細胞因子也在調控白念珠菌的菌絲髮育以及毒性發揮過程中起著非常重要的作用(Chen J et al.Mol Cell Bi0l.2000 Dec；20(23)8696-708；Zheng X et al EMBO J.2004 Apr 21；23(8)1845-56)。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Srb10是一個CTD蛋白激酶。它能在轉錄起始複合物形成以前，磷酸化RNA聚合酶II大亞基的CTD，使RNA聚合酶II同與基本轉錄因子脫離，從而抑制特定基因的轉錄(Hengartner CJ et al Mol Cell.1998 Jul；2(1)43-53.)。在氮源充足的條件下，它也能夠直接磷酸化轉錄因子Ste12，把它送入泛素-蛋白酶體降解途徑，降低它在胞內的水平，從而抑制釀酒酵母假菌絲的形成(Nelson C et al Nature.2003 Jan9；421(6919)187-90)。
本發明人利用生物信息學比較分析和PCR技術，從白念珠菌的基因組克隆了一個新基因，該基因編碼的產物和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的SRB10基因編碼的蛋白具有最高的同源性，同源性達50％，它們的激酶亞結構域也非常相似，因此命名為CaSRB10。利用同源重組原理，在白念珠菌中敲除CaSRB10基因，構建了casrb10/casrb10缺失株，該缺失株在YPD，30℃的培養條件下，生長狀態為伸長的假菌絲。同tup1/tup1缺失株相比，它的這種假菌絲狀態不是很均勻，中間混雜了30％左右的酵母形態的菌體。在Lee’s培養基，37℃菌絲誘導的培養條件下，casrb10/casrb10缺失株可以形成菌絲，而tup1/tup1缺失株依然以長的假菌絲形態生長。小鼠系統感染實驗表明casrb10/casrb10缺失株相對於野生型來講毒性減低。在接種casrb10/casrb10缺失株後，存活下來的小鼠對野生型白念珠菌有一定的免疫力。
這些結果表明，CaSrb10在白念珠菌中是一個重要的毒性因子。先注射casrb10/casrb10缺失株能使小鼠對野生型的白念珠菌產生免疫力。因此，可以在此基因的基礎上發展有用的疫苗。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120白念珠菌CTD蛋白激酶基因及其用途13005817416010170PatentIn version3.221012111827212DNA213白念珠菌(Candida albicans)220
221CDS222(1)..(1824)4001atg agt tat agt tca gct tca ttt aga aaa ctt aat aat gtt ggg ata48Met Ser Tyr Ser Ser Ala Ser Phe Arg Lys Leu Asn Asn Val Gly Ile1 5 10 15tct caa cca tca caa aca aca aca aca aca acc tcg gcg aat caa cot96Ser Gln Pro Ser Gln Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Ash Gln Pro20 25 30caa ctg caa ctg caa caa cag cct tta caa caa ctg caa caa cag cat144Gln Leu Gln Leu Gln Gln Gln Pro Leu Gln Gln Leu Gln Gln Gln His35 40 45tta cat atg aaa cca aat cct cat att cca cat cat caa ttg cca gga192Leu His Met Lys Pro Asn Pro His Ile Pro His His Gln Leu Pro Gly50 55 60act gtt ggc act aga gct tcg att cct caa cca gca tta atg gca ctg240Thr Val Gly Thr Arg Ala Ser Ile Pro Gln Pro Ala Leu Met Ala Leu65 70 75 80aat tca att ttg act ttg ggt cct ttt aaa cat cgt aaa gat ttg aca288Asn Ser Ile Leu Thr Leu Gly Pro Phe Lys His Arg Lys Asp Leu Thr85 90 95cga gag tca gtt tta tca acc tat caa att atg gga tat att gct gct336Arg Glu Ser Val Leu Ser Thr Tyr Gln Ile Met Gly Tyr Ile Ala Ala100 105 110ggt act tat ggg aaa gtc tat aag gct aaa ttg aaa agt aat aaa ctt384Gly Thr Tyr Gly Lys Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Ser Asn Lys Leu115 120 125aat aaa act gac gat gat agt ggt att gat ggc att aat aat aaa gat432Asn Lys Thr Asp Asp Asp Ser Gly Ile Asp Gly Ile Asn Asn Lys Asp130 135 140att ttt tca gaa tca atg aat gat ctt cat cat gat aat agt ccc agc480Ile Phe Ser Glu Ser Met Asn Asp Leu His His Asp Asn Ser Pro Ser145 150 155 160atc atg atc aac acc act act aac atc act atc aat aat agt ctt ccg528Ile Met Ile Asn Thr Thr Thr Asn Ile Thr Ile Asn Asn Ser Leu Pro165 170 175caa ttt ttt gct ata aaa aaa ttt aaa agt gac aat cat cat cat cat576Gln Phe Phe Ala Ile Lys Lys Phe Lys Ser Asp Asn His His His His180 185 190
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權利要求
1.一種分離的白念珠菌CaSrb10多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，並且具有調控白念珠菌絲狀生長的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的多肽；更佳地，該多核苷酸的序列選自下組的一種(i)具有SEQ ID NO1中1-1824位的序列；(ii)具有SEQ ID NO1中1-1827位的序列。
5.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求5所述的載體。
7.一種多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求6所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出白念珠菌CaSrb10蛋白多肽。
8.一種能與權利要求1所述的白念珠菌CaSrb10蛋白特異性結合的抗體。
9.一種檢測樣品中是否存在CaSrb10蛋白的方法，其特徵在於，包括將樣品與權利要求8所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaSrb10蛋白。
10.一種CaSRB10基因的用途，其特徵在於，用於製備casrb10/casrb10缺失株。
全文摘要
本發明提供了一種新的白念珠菌的CTD蛋白激酶CaSrb10蛋白，編碼CaSrb10蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種CaSrb10蛋白的方法。本發明還公開了編碼這種CaSrb10蛋白的多核苷酸的用途。CaSrb10在白念珠菌中是一個重要的毒性因子。在接種casrb10/casrb10缺失株後，存活下來的小鼠對野生型白念珠菌有一定的免疫力。
文檔編號C07K16/40GK1952121SQ20051003058
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月17日 優先權日2005年10月17日
發明者陳江野, 逯楊 申請人:中國科學院上海生命科學研究院