來自b族鏈球菌的核酸和蛋白質的製作方法

2023-12-08 23:29:41

專利名稱：來自b族鏈球菌的核酸和蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白質，編碼這些蛋白質的核酸，和這些蛋白質作為抗原和/或免疫原的應用和在檢測/診斷方面的應用。本發明也涉及細菌基因組的快速篩選以分離和表徵細菌細胞被膜關聯或分泌的蛋白質的方法。
B族鏈球菌(Group B Streptococcus)(GBS)(無乳鏈球菌)是一種有莢膜的細菌，該細菌作為引起新生兒和成人膿毒症和腦膜炎的人類主要的病原在1970年出現。出生後頭5天的早期新生兒感染的發病率為每1000個活嬰中有0.7到3.7個，感染嬰兒的死亡率約20％。在早期感染中活下來的新生兒中通常有25-50％患有神經後遺症。出生後6天到3個月發生的新生兒晚期感染的發病率為每1000個活嬰中有約0.5到1.0個。
分娩時母親生殖道GBS的集群和新生兒膿毒症的危險性存在明顯的聯繫。已發現人類直腸可以充當GBS的儲存庫。新生兒的易感性與針對引起人疾病的GBS上發現的莢膜多糖IgG抗體的低濃度或缺乏相關。在美國從臨床病例中分離到的菌株通常屬於莢膜血清型Ia，Ib，II，III，儘管血清型V可能具有越來越重要的意義。血清型VIII GBS是日本新生兒膿毒症的主要原因。
可能的預防方式涉及在分娩期內或產後向母親施用抗生素，但這可能導致抗性微生物的出現，某些情況下可出現過敏反應。對青春期女性進行接種誘導母體來源的長時間持續的免疫是預防新生兒GBS感染的最有希望的方法之一。這些生物體的莢膜多糖抗原在疫苗的發展方面已經引起極大的關注。對健康成人志願者的研究發現血清型Ia，II和III多糖是無毒的，它們分別在大約65％，95％和70％的非免疫成人中具有免疫原性。應用莢膜抗原作為疫苗的問題之一是反應率隨著免疫前狀態和多糖抗原的不同而改變，正如在人類志願者體內用GBS多糖所作的接種研究所揭示的那樣，不是所有的疫苗都可以產生足夠水平的IgG抗體。
儘管反覆刺激但一些人仍然不產生反應。這些特徵是由於多糖抗原T-非依賴性的性質。提高這些疫苗的免疫原性的一個策略是將該疫苗與蛋白質結合增強多糖的T細胞依賴特性。多糖結合物的應用看來是有前途的，但關於載體蛋白質的性質仍然存在未解決的問題。抗GBS的結合疫苗將要求至少製備4種不同的結合物，這增加疫苗的成本。
建立在莢膜多糖應用基礎上的抗GBS感染的疫苗接種方法有根據免疫前狀態和所使用的特定多糖類型反應率可能會產生相當大變化的缺點。人類志願者體內的結合疫苗實驗結果已經提示對於一些關鍵的莢膜抗原反應率可能僅僅在65％左右(Larsson等，感染和免疫(Infection and Immunity)643518-3523(1996))。對疫苗產生反應的所有個體是否都將會產生足夠水平的能穿越胎盤並且賦予新生兒免疫力的多糖特異性IgG也還不清楚。將蛋白質載體結合到多糖抗原上可能會將多糖抗原轉化成T細胞依賴性抗原並且使它們的免疫原性提高。
應用GBS III型多糖-破傷風類毒素結合物進行的初步研究一直是鼓舞人心的(Baker等，感染性疾病綜述(Reviews of InfectiousDiseases)7458-467(1985)，Baker等，新英格蘭醫學雜誌(The NewEngland J.of Medicine)3191180-1185(1988)，Paoletti等，感染和免疫64677-679(1996)，Paoletti等，感染和免疫623236-3243(1994))，但在發達國家，因為大部分成年人在過去的五年中都接受了抗破傷風免疫，破傷風的應用可能是有缺點的。用破傷風類毒素進行的加強免疫可能會引起不良反應(Boyer.，兒科學新觀點(Current Opinions in Pediatrics)713-18(1995))。多糖結合物疫苗與許多其它種類的疫苗相比有製備和生產昂貴的缺點。也有在GBS多糖和包含唾液酸的人糖蛋白質之間產生交叉反應的可能危險。
目前的證據提示細菌表面蛋白質對免疫的賦予也可能是有用的。在大部分血清型III菌株上發現但在血清型Ia，Ib或II上很少存在的一種叫做Rib的蛋白質在動物模型中賦予對表達Rib的GBS攻擊的免疫(Stalhammar-Carlemalm等，實驗醫學雜誌(Journal ofExperimental Medicine)1771593-1603(1993))。作為疫苗的一個組成部分的另一個感興趣的表面蛋白質是C蛋白質的α抗原，該抗原可以保護接種後的小鼠免受表達α蛋白質的菌株的致死性感染。由GBS菌株表達的該抗原的數量變化很明顯，然而來源於GBS的蛋白質抗原的應用可替換多糖作為抗原。在實驗模型系統中近期的證據提示GBS表面關聯蛋白質Rib和C蛋白質可以對GBS感染提供免疫(Stalhammar-Carlemalm等，(1993)[同上]，Larsson等，(1996)[同上])。然而這兩種蛋白質在引起人類疾病的所有GBS血清型中不是保守的。假設這些抗原具備免疫原性並且能在人體內引發保護水平的反應，上述抗原也不會對由於GBS引起的所有感染起到保護作用，因為感染性B族鏈球菌中10％不表達Rib或C蛋白質。
本發明通過採用專門為鑑定編碼細菌細胞表面關聯或分泌蛋白質的那些B組鏈球菌基因所設計的新篩選方法希望克服抗GBS的疫苗接種問題。這些基因表達的蛋白質可能具有免疫原性，因此在B族鏈球菌感染的預防和治療中可能是有用的。為了本申請的目的，術語免疫原性是指這些蛋白質將在實驗對象體內引發保護性的免疫反應。應用上述新的篩選方法許多編碼新的B組鏈球菌蛋白質的基因都已被鑑定。
所以第一方面，本發明提供了具有選自表1所示那些序列的序列的B族鏈球菌蛋白質、多肽或肽，或它們的片段或衍生物。
上述範圍內的蛋白質和多肽可能是細胞表面受體，粘著分子，轉運蛋白質，膜結構蛋白質，和/或信號分子，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。
一種蛋白質的胺基酸順序可以發生不影響其功能的改變。這些改變包括胺基酸的缺失，插入和替換，並可以是由不同的剪接和/或存在多個翻譯起始和終止位點引起。多態性可以作為翻譯過程的不忠實性的結果出現。所以，不影響蛋白質功能的胺基酸順序的變化是可以容忍的。
所以本發明包括本發明的蛋白質，多肽和肽的衍生物或變異體，這些衍生物或變異體與本發明中描述的蛋白質，多肽和肽有至少50％的同一性。優選序列同一性程度是至少60％，優選大於75％，更優選大於80％，90％或甚至95％。
術語同一性能夠用來描述兩個多肽序列之間的相似性。實現這一過程的本領域中熟知的軟體包是CLUSTAL程序。它比較兩個多肽的胺基酸序列並且通過在任一序列中適當時插入空位找到最佳的比對。最佳比對的胺基酸的同一性或相似性(胺基酸類型的同一性和保守性)也能夠用例如BLASTx這樣的軟體包計算。該程序比對相似序列的最大伸展片段並且給出一個合適的數值。對於任何一種類型的比較都可以發現相似的幾個區域，每個相似的區域都有一個不同的數值。本領域的技術人員將知道不同長度的兩個多肽可以以較長片段的整個長度為準進行比較。或者可以比較一些小的區域。正常地有用的比較是對同一長度的序列進行比較。
對編碼蛋白質的DNA進行操作是尤其強有力的技術，該技術可以修飾蛋白質和為純化目的產生大量蛋白質。這可能涉及用PCR技術擴增所需要的核酸序列。所以本發明提供的序列資料能夠用來設計PCR中使用的引物以便能夠靶向所需的序列，然後將其大量擴增。
典型地引物至少是5個核苷酸的長度，並且通常至少是10個核苷酸的長度(例如15到25個核苷酸長)。在一些情況下可能使用至少30或至少35個核苷酸長的引物。
作為另一種選擇，可以採用化學合成。這可以是自動化的。可以化學合成相對短的序列，連接起來提供較長的序列。
所以另一方面本發明進一步提供包含以下序列或由以下序列組成的核酸分子，所述序列是(i)在本文

圖1所示DNA序列或它們的RNA等價物中的任何序列；(ii)與(i)中序列的任何序列互補的序列；(iii)顯示與(i)或(ii)的那些序列編碼相同的蛋白質或多肽的序列；(iv)顯示與(i)、(ii)和(iii)的那些序列中的任何序列有實質同一性的序列；或(v)編碼圖1所示核酸分子的衍生物或片段的序列。
術語同一性也可以用來描述兩個獨立DNA序列的相似性。「bestfit」程序(Smith和Waterman，應用數學進展(Advances inapplied Mathematics)，482-489(1981))是用於尋找兩個核酸序列之間最佳相似性片段的一類計算機軟體中的一個實例，然而GAP程序能使序列沿著它們的整個長度比對，並且通過在任一序列中適當插入空位找到最佳比對。
本發明包括這樣的核酸序列，該核酸序列與此處描述的核酸序列有至少50％的同一性。優選序列同一性程度是至少60％，優選大於75％。更優選大於80％，90％或甚至95％。
上面所使用的術語「RNA等價物」是指給定的RNA分子具有與給定的DNA分子互補的序列，允許的情況是在RNA中遺傳密碼「U」替換了「T」。核酸分子可以以分離的，重組的或化學合成的形式存在。
DNA結構能夠用本領域熟知的方法很容易地產生。這些技術已公開，例如在Sambrook等「分子克隆」(Molecular Cloning)第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)。對DNA結構和所表達蛋白質的修飾例如添加啟動子，增強子，信號序列，前導序列，翻譯起始和終止信號和DNA穩定性調控區域，或添加融合部分，可能變得比較容易。
正常地DNA結構可以插入至載體中，該載體可以是任何適合的載體，包括質粒，病毒，噬菌體，轉座子，極微染色體，脂質體或機械載體。本發明的表達載體是適合表達編碼所需蛋白質產物的DNA的DNA結構，該結構可能包括(a)調控元件(例如啟動子，操縱子，活化子(activator)，抑制子(repressor)和/或增強子)，(b)可以被轉錄成mRNA的結構序列或編碼序列，和(c)適當的轉錄，翻譯，起始和終止序列。載體可以進一步包含選擇標記，例如抗生素抗性標記，以便於包含該載體的細胞的選擇和/或鑑定。
將載體轉化或轉染到宿主細胞中可獲得蛋白質的表達，該宿主細胞可以是真核或原核來源的。為了產生重組蛋白質，表達可以是誘導型表達或者只是在某些類型細胞中表達或者既是誘導型表達又是細胞特異性的表達。誘導型載體中尤其優選的是那些可通過易操作的環境因素，例如溫度和營養添加劑，誘導表達的載體。各種適合的載體，包括應用於原核和真核宿主中的組成型和誘導型表達載體，對本領域的那些技術人員來說是熟知的和常規使用的。
多種表達載體都可以用於表達本發明的B族鏈球菌蛋白質。這樣的載體尤其包括染色體，附加體和病毒來源的載體，例如來源於細菌質粒的載體，來源於噬菌體的載體，來源於轉座子的載體，來源於酵母元件的載體，來源於病毒(例如杆狀病毒，乳頭多瘤空泡病毒，例如SV40，痘苗病毒，腺病毒和逆轉錄病毒)的載體，和來源於它們的組合的載體，例如來源於質粒和噬菌體遺傳元件的那些載體，例如粘粒和噬菌粒，都可以依照本發明使用。通常，在這方面，適合在宿主中維持，增殖或表達核酸以表達多肽的任何載體都可以用於表達。因而這樣的載體組成了本發明另一個方面。
通過多種熟知的和常規的技術中的任何技術可以將適當的DNA序列插入到載體中。
在表達載體中核酸序列可操作性地與適當的表達調控序列連接，這些調控序列包括，例如指導mRNA轉錄的啟動子。這樣的啟動子的代表包括，但不限於，噬菌體λPL啟動子，T3和T7啟動子，大腸桿菌lac，trp，和λPL啟動子，微生物的真核生物GAL，葡糖澱粉酶和纖維二糖水解酶啟動子和哺乳動物金屬硫蛋白質(小鼠)和熱休克(人)啟動子。
一般地，表達載體將包含轉錄起始和終止位點，並在轉錄區中包含翻譯時所用的核糖體結合位點。該結構表達的成熟轉錄本的編碼部分通常包括開始時的翻譯起始密碼子AUG和位於將被翻譯的多肽末端適當位置的終止密碼子。
本發明用於B族鏈球菌蛋白質重組表達的適當宿主的代表性實例包括細菌細胞，例如鏈球菌，葡萄球菌，大腸桿菌，鏈黴菌和枯草芽胞桿菌細胞；真菌細胞，例如酵母細胞和麴黴細胞；昆蟲細胞例如果蠅S2和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞例如CHO，COS，HeLa和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。這樣的宿主細胞形成本發明的另一個方面。
可通過任何方便的方法破壞在蛋白質表達中使用的微生物細胞，這些方法包括反覆凍融，超聲處理，機械破壞，或應用細胞裂解劑，這些方法對本領域的技術人員是知悉的。
可以採用人們熟知的方法從重組細胞培養物中收回和純化多肽，上述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和植物血凝素層析。在分離和或純化期間多肽變性時使蛋白質重新摺疊的眾所周知的技術可以用來重現活性構象。
此處描述的B組鏈球菌蛋白質還能夠用作產生抗體或親和體(affibody)的靶抗原。這些可用來檢測B族鏈球菌。
所以本發明在另一方面提供了與本文所述的任何一種或多種蛋白質，多肽，肽，它們的片段或衍生物結合的抗體，親和體，或其衍生物。
本發明範圍內的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。當將本發明描述的蛋白質，或其類似物，衍生物或片段注射給適當的動物時，在動物宿主(例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，綿羊，山羊或猴子)體內通過刺激可以產生多克隆抗體。如果需要，可以將佐劑與蛋白質一起施用。人們熟知的佐劑包括弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)和氫氧化鋁。然後可以通過抗體與本發明描述的蛋白質的結合和本領域技術人員熟知的許多其它方法將抗體純化。
單克隆抗體可以從雜交瘤中產生。這些雜交瘤可以通過將骨髓瘤細胞與產生所需抗體的脾細胞融合以形成永生化細胞系來製備。為此可以採用人們熟知的Kohler和Milstein技術(Nature 256(1975))或在此技術基礎上後來變更的技術。
製備與特定多肽/蛋白質結合的單克隆抗體和多克隆抗體的技術在本領域已發展完善。在標準免疫教科書中討論了這些技術，例如在Roitt等，免疫學(Immunology)，第二版(1989)，ChurchillLivingstone，倫敦中。
除了全抗體，本發明包括能與本發明描述的蛋白質等結合的抗體衍生物。所以，本發明包括抗體片段和合成的結構。在Dougall等，Tibtech 12 372-379(1994年九月)有抗體片段和合成結構的實例。
抗體片段包括，例如，Fab，F(ab』)2和Fv片段。能夠對Fv片段進行修飾產生一種合成的結構，稱為單鏈Fv(scFv)分子。該分子包括共價連接Vh和Vl區的肽接頭，該肽接頭有助於該分子的穩定性。其它能夠使用的合成結構包括CDR肽。該肽是包含抗原結合決定簇的合成肽。肽模擬物也可以使用。這些分子通常是構象限制性的有機環，該環模擬CDR環結構同時包括與抗原相互作用的側鏈。
合成的結構包括嵌合分子。所以，例如，人源化(或靈長類化)抗體或它們的衍生物包括在本發明的範圍內。人源化抗體的一個實例是具有人構架區和齧齒動物高變區的抗體。例如Morrison等在PNAS，81，6851-6855(1984)和Takeda等在自然(Nature)，314，452-454(1985)中討論了產生嵌合抗體的方式。
合成的結構也包括包含了附加部分的分子，該附加部分為該分子提供了除結合抗原外的一些期望得到的特性。例如，該部分可以是一種標記(例如螢光或放射性標記)。或者，該部分可以是藥物學活性劑。
已發現親和體是與靶蛋白質以低解離常數結合的蛋白質。它們是從表達目的靶蛋白質片段的噬菌體展示文庫中選擇出來的(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，生物化學和生物工程系，皇家工程學院(KTH)，Stockholm，瑞士)。
本發明進一步提供了包含本發明描述的一種或多種蛋白質，多肽，肽，其片段或衍生物，或核苷酸序列的免疫原性組合物。該免疫原性組合物可以包括本發明描述的ID-65和/或ID-66核酸序列。或者，該免疫原性組合物可以包含包括本發明描述的ID-65，ID-83，ID-89，ID-93和/或ID-96在內的蛋白質/多肽，或其片段或衍生物。該種組合物在治療或預防實驗對象體內的B族鏈球菌感染方面可能是有用的。在本發明的一個優選方面中免疫原性組合物是疫苗。
在其它方面本發明提供i)本發明描述的免疫原性組合物在製備用於治療或預防B族鏈球菌感染的藥物中的應用。優選該藥物是疫苗。
ii)B族鏈球菌的檢測方法，該方法包括使待檢樣品與至少一種本發明描述的抗體，親和體，或其衍生物接觸的步驟。
iii)B族鏈球菌的檢測方法，該方法包括使待檢樣品與至少一種本發明描述的蛋白質，多肽，肽，片段或衍生物接觸的步驟。
iv)B族鏈球菌的檢測方法，該方法包括使待檢樣品與至少一種本發明描述的核酸分子接觸的步驟。
v)檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一種本發明描述的抗體，親和體，或其衍生物。
vi)檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一種本發明描述的B族鏈球菌蛋白質，多肽，肽，其片段或衍生物。
vii)檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一種本發明的核酸。
正如以上所述，可以用特異鑑定編碼細菌細胞被膜關聯或分泌蛋白質的那些B族鏈球菌基因的篩選方法鑑定和分離本發明描述的新蛋白質。
假如發明人已經鑑定出一組重要的蛋白質，那麼這些蛋白質便是抗微生物治療的潛在的靶標。然而必需確定每一種蛋白質對微生物的存活是否是必需的。所以，本發明也提供了一種確定本發明描述的蛋白質或多肽是否代表潛在的抗微生物靶標方法，該方法包括使所述蛋白質失活並確定B族鏈球菌是否還存活。
使蛋白質失活的適當的方法是使所選擇的基因敲除，即阻止蛋白質表達，並確定該做法是否導致了致死性的改變。實施該基因敲除的適當的方法在Li等，P.N.A.S.，9413251-13256(1997)和Kolkman等，生物化學雜誌(Journal of Biological Chemistry)，27219502-19508(1997)；Kolkman等，細菌學雜誌(Journal ofBacteriology)，1783736-3741(1996)有描述。
在最後一方面，本發明提供了能夠拮抗、抑制或以其它方式幹擾本發明的蛋白質或多肽的功能或表達的藥劑在生產用於治療或預防B族鏈球菌感染的藥物中的應用。
現在通過以下實施例對本發明進行描述，這些實施例不應以任何方式理解為限制本發明。這些實施例涉及如下附圖，其中圖1(A)顯示編碼抗原性B族鏈球菌蛋白質的一些全長核苷酸序列和它們相應的胺基酸順序。
圖2顯示使用蛋白質ID-65和ID-66的疫苗實驗結果。
圖3顯示在篩選過程中使用的許多寡核苷酸引物。
所設計的nucS1引物用以擴增nuc A基因的成熟形式。
所設計的nucS2引物用以擴增nuc A基因的成熟形式。
所設計的nucS3引物用以擴增nuc A基因的成熟形式。
所設計的nucR引物用以擴增nuc A基因的成熟形式。
所設計的nucseq引物用以測定克隆到pTREP-Nuc載體中的DNA的序列。
pTREPF核酸序列包含ECORV的識別位點，用於將片段克隆到pTREX7中。
pTREPR核酸序列包含BAMH1的識別位點，用於將片段克隆到pTREX7中。
PUCF正向測序引物，使克隆的DNA片段直接測序。
VR基因特異性引物的例子，通過DNA步移的方法用來獲得進一步的抗原DNA序列。
V1基因特異性引物的例子，通過DNA步移的方法用來獲得進一步的抗原DNA序列。
V2基因特異性引物的例子，通過DNA步移的方法用來獲得進一步的抗原DNA序列。
圖4(i)圖示了pTREP1-nuc1，pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3中成熟nuc基因緊上遊的單一基因克隆位點的核苷酸序列。每個pTREP-nuc載體包含一個EcoRV(pTREP1-nuc2中的一個SmaI位點)切割位點，對成熟nuc基因來說該位點可允許在3個不同框架中克隆基因組DNA片段。
(ii)pTREP1-nuc載體的物理和遺傳的概括性圖譜。描述了包含nuc，大環內酯、lincosamides和鏈陽性菌素B(MLS)抗性決定子，和複製子(rep)Ori-pAMβ1的表達盒(未按比例畫)。
(iii)圖示了具有與基因表達和單一限制性內切酶位點的定位有關的各種序列元件的表達盒(未按比例畫)。
圖5在12％的聚丙烯醯胺凝膠上對附加His的ID-65和ID-83蛋白質抗原(預計的分子量分別為57,144和25,000道爾頓)的純化製品的SDS-PAGE分析。各泳道為MW，分子量標準；1，附加His的ID-65蛋白質；2，附加His的ID-83蛋白質。
圖6在12％的聚丙烯醯胺凝膠上對附加His的ID-93蛋白質抗原(預計的分子量＝28,000道爾頓)的純化製品的SDS-PAGE分析。
各泳道為MW，分子量標準；1，附加His的ID-93蛋白質。
圖7在12％的聚丙烯醯胺凝膠上對附加His的ID-89和ID-96蛋白質抗原(預計的分子量分別為35,000和31,000道爾頓)的純化製品的SDS-PAGE分析。各泳道為MW，分子量標準；1，附加His的ID-89蛋白質；2，附加His的ID-96蛋白質。
圖8抗ID-65和ID-83蛋白質的IgG效價1＝ID-65+氫氧化鋁組-第5周放血2＝PBS+氫氧化鋁對照組-第5周放血(對1和2組進行純化的ID-65蛋白質的ELISAs)3＝ID-83+氫氧化鋁組-第5周放血4＝PBS+氫氧化鋁對照組-第5周放血(對3和4組進行純化的ID-83蛋白質的ELISAs)圖9顯示用蛋白質ID-93的疫苗實驗結果圖10抗ID-93蛋白質的IgG效價1＝ID-93+氫氧化鋁組-第3周放血2＝ID-93+氫氧化鋁組-第6周放血3＝PBS+氫氧化鋁對照組-第3周放血4＝PBS+氫氧化鋁對照組-第6周放血圖11抗ID-89和ID-96蛋白質的IgG效價1＝ID-89+TitreMax金組-第3周放血2＝ID-89+TitreMax金組-第6周放血3＝PBS+TitreMax金對照組-第3周放血4＝PBS+TitreMax金對照組-第6周放血5＝ID-96+TitreMax金組-第3周放血6＝ID-96+TitreMax金組-第6周放血7＝PBS+TitreMax金對照組-第3周放血8＝PBS+TitreMax金對照組-第6周放血對1-4組進行純化的ID-89蛋白質的ELISAs對5-6組進行純化的ID-96蛋白質的ELISAs圖12對基因組DNA的Southern印跡分析。將來自表7列出的每一菌株的基因組DNA用Hin DIII(NEB)徹底消化，然後在0.8％的瓊脂糖中40伏電泳6小時，再通過Southern印跡將其轉移到HybondN+(Amersham)膜上，與地高辛配基標記的rib基因探針雜交。特異結合的DNA探針用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)鑑定。
圖13對基因組DNA的Southern印跡分析。將來自表6列出的每一菌株的基因組DNA用Hin DIII(NEB)徹底消化，然後在0.8％的瓊脂糖中40伏電泳6小時，再通過Southern印跡將其轉移到HybondN+(Amersham)膜上與地高辛配基標記的ID-65基因探針雜交。特異結合的DNA探針用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)鑑定。
圖14對基因組DNA的Southern印跡分析。將來自表6列出的每一菌株的基因組DNA用Hin DIII(NEB)徹底消化，然後在0.8％的瓊脂糖中40伏電泳6小時，再通過Southern印跡將其轉移到HybondN+(Amersham)膜上與地高辛配基標記的ID-89基因探針雜交。特異結合的DNA探針用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)鑑定。
圖15對基因組DNA的Southern印跡分析。將來自表6列出的每一菌株的基因組DNA用Hin DIII(NEB)徹底消化，然後在0.8％的瓊脂糖中40伏電泳6小時，再通過Southern印跡將其轉移到HybondN+(Amersham)膜上與地高辛配基標記的ID-93基因探針雜交。特異結合的DNA探針用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)鑑定。
圖16對基因組DNA的Southern印跡分析。將來自表6列出的每一菌株的基因組DNA用EcoRI(NEB)徹底消化，然後在0.8％的瓊脂糖中40伏電泳6小時，再通過Southern印跡將其轉移到HybondN+(Amersham)膜上與地高辛配基標記的ID-96基因探針雜交。特異結合的DNA探針用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)鑑定。
實施例1除非另外說明，應用本發明描述的核酸酶篩選系統即LEEP(輸出蛋白質的乳球菌表達(Lactococcus Expression of ExportedProteins))系統已經鑑定出推測在無乳鏈球菌(S.agalactiae)中編碼輸出蛋白質的基因/部分基因序列。對這些序列進行了進一步的分析以除去假的序列。用以下描述的許多參數對使用該篩選系統鑑定的基因的核苷酸序列進行表徵。
1.對所有推測的表面蛋白質的前導肽/信號肽序列進行分析。細菌的信號肽序列具備共同的設計。這些信號肽的特點是一個短的帶正電荷的N末端(N區)之後緊接著一段疏水性殘基(中間部分-h區)，疏水性殘基之後是包含切割位點的更具極性的C末端部分(c-區)。採用計算機軟體對推測蛋白質進行親水性作圖(Marcks，核酸研究(Nuc.Acid.Res.)，161829-1836(1988))，該方法可以用來鑑定前導肽序列的典型的獨特疏水部分(h區)。另外，也可以發現是否存在潛在的核糖體結合位點(翻譯所需的Shine-Dalgarno序列)。
2.應用所有的推測的表面蛋白質序列搜索包括GENBANK和SWISSPROT資料庫翻譯在內的OWL序列資料庫。這可以找出與不但在序列水平而且在功能水平上可能早已得到表徵的序列的相似序列。這也可以提供上述蛋白質確實是表面相關蛋白質而不是假蛋白質的信息。
3.對推測的無乳鏈球菌表面蛋白質的新穎性也進行評估。一些已發現的蛋白質可能具有也可能不具有典型的前導肽序列，並且可能與資料庫中的任何DNA/蛋白質序列都無同源性。確實，這些蛋白質可能會顯示出我們的篩選方法的主要優點，即分離非典型的表面相關蛋白質，該蛋白質在所有以前描述的篩選方法中會被遺漏。
本發明描述三個報告載體的構建和它們在鑑定和分離來自病原菌的編碼分泌或表面關聯蛋白質的基因組DNA片段中的應用。
pTREP1-nuc系列報告載體的構建(a)pTREP1表達質粒的構建pTREP1質粒是高拷貝數(每個細胞40到80個)θ複製型革蘭氏陽性質粒，該質粒是pTREX質粒的衍生物，pTREX本身是以前公開的pIL253質粒的衍生物。pIL253質粒引入了pAMβ1(Simon和Chopin，Biochemie 70559-566(1988))L lactis性因子的大範圍革蘭氏陽性宿主複製子。pIL253也缺乏可被以pIL501為實例的結合型親代質粒轉移或有效帶動轉移所必需的tra功能。早先已將腸球菌pAMβ1複製子轉移到包括鏈球菌，乳桿菌和芽孢桿菌及丙酮丁醇梭菌的各物種中(LeBlanc等，Proceedings of the National Academy of Science USA，753484-3487(1978))，這提示該複製子具有潛在的廣泛宿主適用範圍。pTREP1質粒代表一種組成型轉錄載體。
pTREX載體的構建如下。通過對2個互補的寡核苷酸退火然後用Tf1 DNA聚合酶延伸，製備包含推測的RNA穩定序列，翻譯起始區(TIR)，用於基因插入的多克隆位點和轉錄終止子的人工DNA片段。有義和反義寡核苷酸各自在5』末端包含NheI和BamHI的識別位點使克隆易於進行。該片段被克隆在pUC19NT7中的Xbal和BamHI位點之間，pUC19NT7是pUC19的衍生物，其包含來自pLET1(Wells等，應用細菌學雜誌(J.Appl.Bacteriol.)，74629-636(1993))的克隆在EcoRI和HindIII位點之間的T7表達盒。所得結構稱為pUCLEX。然後用HindIII切割切下pUCLEX的完全表達盒並且進行鈍化，此後用EcoRI切割，之後克隆到pIL253的EcoRI和SacI(鈍化的)位點產生載體pTREX(Wells和Schofield，在代謝，遺傳學和應用方面的新近展-NATOASI系列H 9837-62(1996))。推測的RNA穩定序列和TIR來源於大腸桿菌T7噬菌體序列，並且在一個核苷酸位置對其進行修飾以提高Shine Dalgarno(SD)基序與乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)核糖體16sRNA的互補性(Schofield等，pers.coms.劍橋大學病理學系)。
表現啟動子活性的乳酸乳球菌MG1363染色體DNA片段隨後被稱為P7，該片段克隆在表達盒的EcoRI和Bg1II位點之間，創建了pTREX7。先前已用啟動子探針載體pSB292(Waterfield等，基因(Gene)，1659-15(1995))將該活性啟動子區分離。應用VentDNA聚合酶，依照產品說明通過PCR擴增該啟動子片段。
pTREP1載體的構建如下。將兩個重疊並且部分互補的合成寡核苷酸一起退火，然後依照生產商的使用說明用測序酶延伸，創建包括轉錄終止子，正向pUC測序引物，啟動子多克隆位點區和通用翻譯終止序列的人工DNA片段。有義和反義(pTREPF和pTREPR)寡核苷酸各自在5』末端包含EcolV和BamHI識別位點使其易於克隆到pTREX7中。轉錄終止子是在乳球菌屬中已證明有效的芽孢桿菌青黴素酶基因的終止子(Jos等，應用和環境微生物學(Applied and EnviromentalMicrobiology)，50540-542(1985))。因為觀察到在pTREX載體中的靶基因的表達有滲漏並且認為這是起始區域隱藏的啟動子活性的結果(Schofield等，pers.coms.劍橋大學病理學系)，故該轉錄終止子被認為是必需的。為能直接對克隆的DNA片段測序，正向pUC測序引物包括在上述DNA片段之內。包括了在3個不同框架中編碼終止密碼子的翻譯終止序列，這可防止載體基因和克隆DNA片段之間的翻譯融合。依照生產商的使用說明，將pTREX7載體首先用EcoRI消化然後用T4 DNA聚合酶(NEB)的5』-3』聚合酶活性將其鈍化。然後將經EcoRI消化和末端鈍化後的pTREX7載體用Bg1 II消化，除去P7啟動子。將人工合成的寡聚核苷酸退火後形成的人工DNA片段用EcoRV和BamH I消化，然後克隆到經EcoRI(鈍化的)和Bg1 II消化的pTREX7載體中產生pTREP。然後將稱為P1的乳酸乳球菌MG1363染色體啟動子克隆到pTREP表達盒中存在的EcoRI和Bg1 II位點之間形成pTREP1。同樣用啟動子探針載體pSB292分離該啟動子然後通過Waterfield等，(1995)[同上]描述的對其進行表徵。最初應用ventDNA聚合酶依照生產商的使用說明對P1啟動子片段進行PCR擴增，然後將該片段作為EcoRI-Bgl II DNA片段克隆到pTREX中。將包含EcoRI-Bgl II P1啟動子的片段用限制性酶消化從pTREX1中移出，克隆到pTREP中(Schofieldt等，pers.coms.University of Cambridge，Dept.Pathology)。
(b)S.aureus nuc基因的PCR擴增S.aureus nuc基因的核苷酸序列(EMBL資料庫編號V01281)用來設計PCR擴增所用的合成寡核苷酸引物。將引物設計成擴增nuc基因成熟形式的引物，該基因的成熟形式稱為nucA，是通過蛋白質水解酶切割分泌型的稱為Snase B(Shortle，1983[同上])的前肽的N末端19到21個胺基酸後形成的。設計三個有義引物(在圖3中顯示的nucS1，nucS2和nucS3)，對nuc基因來說在不同的閱讀框中每個引物有一個EcoRV或Sam I的平端限制性內切酶切點。另外，將Bg1 II和BamH I各自引入有義和反義引物的5』末端以便入克隆至經BamH I和Bg1 II切割的pTREP1中。所有引物的序列在圖3中給出。採用與反義引物結合的每個有義引物對編碼核酸酶基因的成熟形式(NucA)的三個nuc基因DNA片段進行PCR擴增。應用S.aureus基因組DNA模板，Vent DNA聚合酶(NEB)和生產商所推薦的條件對nuc基因片段進行PCR擴增。開始的變性步驟是93℃，2分鐘，然後是93℃，45秒變性，50℃，45秒退火，73℃，1分鐘延伸的30個循環，最後，73℃延伸5分鐘。用Wizard純化柱(Promega)除去未摻入的核苷酸和引物純化PCR擴增產物。
(c)pTREP1-nuc載體的構建將b部分中描述的純化的nuc基因片段用Bg1 II和BamH I在標準條件下消化，然後連接到經BamH I和Bg1 II切割和脫磷酸後的pTREP1上產生報告載體的pTREP1-nuc1，pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3系列報告載體。這些載體描述在圖4中。使用生產商提供的試劑和緩衝液或使用標準技術(Sambrook和Maniatis分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社冷泉港(1989))完成一般的分子生物學操作。在每個pTREP1-nuc載體中，表達盒包含一個轉錄終止子，一個乳球菌啟動子P1，單一克隆位點(Bg1 II，EcoRV或Sam I)，然後是nuc基因的成熟形式和第二個轉錄終止子。應當注意到的是nuc基因翻譯和分泌所需的序列故意地被排除在該結構之外。這些元件只能通過適當消化後的外來DNA片段(代表靶細菌)提供，上述片段能夠克隆到nuc基因上遊近端存在的單一限制性位點。
(d)對B族鏈球菌中的分泌蛋白質的篩選將從B族鏈球菌(無乳鏈球菌)分離到的基因組DNA用限制酶Tru9I消化。該酶可以識別5』-TTAA-3』序列，使用該酶的原因是其能有效地切割A/T豐富的基因組並且能產生在優選大小範圍內的(通常平均在0.5-1.0kb之間)隨機基因組DNA。因為這可以增加利用P1啟動子轉錄新的基因序列的可能性，所以這個大小範圍是優選的。然而，P1啟動子不是在所有的情況下都是必需的，因為許多鏈球菌啟動子在乳酸乳球菌中可以被識別。不同大小的DNA片段可以從無乳鏈球菌基因組DNA的部分Tru9 I消化物中純化得到。
因為Tru9 I限制酶產生交錯末端，所以在將DNA片段連接到經EcoRV或Sam I切割的pTREP1-nuc載體之前必需對其末端進行鈍化。這可以應用Klenow酶的5』-3』聚合酶活性通過部分填充的酶反應實現。簡言之，將Tru9 I消化的DNA溶解在一種溶液中(通常溶液總量為10-20μl)，該溶液補充有T4 DNA連接酶緩衝液(New EnglandBiolabs；NEB)(1X)和所需的dNTPs，在這種情況下是dATP和dTTP，各33μM。加入Klenow酶(每μgDNA加入一個單位Klenow酶(NEB))，25℃反應15分鐘。將該混合物75℃放置20分鐘終止該反應。然後加入EcoRV或Sam I消化的pTREP-nuc質粒DNA(通常在200-400ng之間)。然後在該混合物中加入400單位T4 DNA連接酶(NEB)和T4 DNA連接酶緩衝液(1X)，然後16℃孵育過夜。將該連接反應混合物直接沉澱在100％的乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)中，用於轉化乳酸乳球菌MG1363(Gasson，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)，1541-9(1983))。或者，pTREP-nuc載體的基因克隆位點也包含一個Bg1 II位點，該位點可以用來克隆例如Sau3A I消化的基因組DNA片段。
將L.lactis轉化體克隆培養在腦心浸液瓊脂上，分泌核酸酶的(Nuc+)克隆可以通過甲苯胺藍-DNA-瓊脂覆蓋(0.05M Tris pH9.0，每升溶液中瓊脂10g，每升溶液中NaCl 10g，0.1mM CaCl2，0.03％wt/vol.鮭魚精子DNA和90mg甲苯胺藍O染料)基本依照Shortle，1983[同上]，和Le Loir等，1994[同上]中的描述檢測。然後將培養板37℃孵育長達2個小時。分泌核酸酶的克隆產生容易分辨的粉紅色暈輪。從Nuc+重組乳酸乳球菌克隆中分離質粒DNA，在一條鏈上用圖3中描述的可直接測定DNA插入部分序列的NucSeq測序引物對DNA插入片段進行測序。
實施例2無乳鏈球菌標準接種物的製備菌株的確認無乳鏈球菌血清型III(菌株97/0099)是從患腦膜炎的新生兒腦脊髓液得來的一種新的臨床分離株。對這個B族鏈球菌的溶血菌株進行了流行病學的檢測，並且在呼吸道和系統性感染實驗室，PHLS公共衛生中心實驗室，61 Colidale Avenue，倫敦NW9 5HT進行了確認。該菌株在到達之前在實驗室中僅傳代培養兩次。到達時其在瓊脂斜面上，一次掃到的4到5個菌落用來接種Todd Hewitt/5％馬血培養液，然後於37℃靜置孵育過夜。然後用此過夜培養物0.5ml等分試樣製備20％甘油的細菌原種，用於-70℃長期保存。甘油原種在Todd Hewitt/5％馬血瓊脂平板上劃線以確認其活力。
B族鏈球菌的在體傳代將無乳鏈球菌血清型III(菌株97/0099)的冷凍培養物(描述於「菌株的確認」)在Todd-Hewitt/5％馬血瓊脂平板上劃線成單菌落，該平板於37℃培養過夜。刮下4-5個菌落用於接種Todd Hewitt/5％馬血培養液，再將其培養過夜。從過夜的培養物中分出0.5ml等分試樣用來接種50ml的Todd Hewitt液體培養基中(1∶100稀釋)，37℃孵育。將過夜的培養物進行10倍的連續稀釋(因為該菌株的毒力是未知的)，將每一稀釋培養物在CBA/ca小鼠中腹膜內傳代，一式二份。對用於傳代的各種接種物進行存活數量的計數。用108到104菌落形成單位(cfu)的不同濃度的病原體攻擊各組小鼠。對出現症狀的小鼠在最後進行麻醉和心臟穿刺(僅僅是那些用高濃度，即1×108cfu攻擊過的小鼠出現了症狀)。上述穿刺所獲得的未凝固的血液用來直接接種50ml血清液體培養基(Todd Hewitt/20％滅活的胎牛血清)。對培養物進行密切監視使其生長到晚期對數期。因為隨著細菌的生長血液被越來越多地溶解致使培養基中血液的存在幹擾了OD600nm的讀數，所以需要對培養物密切監視。到晚期對數期/早期靜止期時將培養物轉移到一個新鮮的50ml管中，以排除沉澱在試管底部的死細菌細胞和殘留的血細胞。從上述培養物中取出0.5ml等分試樣轉移到無菌的冷凍管中，在液氮中冷凍，儲存在-70℃。為確定細菌的數量，對單個標準接種等分試樣進行活菌計數。計數結果大約為5×108cfu/ml。
B族鏈球菌標準接種物的腹膜內攻擊和毒力測定為確定標準接種物的毒力是否適合疫苗實驗中使用，採用一個劑量範圍的接種物進行攻擊。將冷凍的標準接種菌株等分試樣在室溫下融解。從活菌計數數據中已經知道標準接種物中每ml含有的cfu數量。最初，將標準接種物在Todd Hewett液體培養基中進行連續的稀釋，然後以500μl Todd Hewitt液體培養基中含有1×108到1×104cfu的劑量腹膜內攻擊小鼠。對注射不同劑量的各組小鼠的存活時間進行比較。確定標準接種物毒力適合，1×106cfu的劑量被認為是疫苗實驗中進一步使用時接近最佳的劑量。進一步優化可通過比較用5×105到5×106cfu的劑量攻擊的小鼠來實現。最佳劑量估計約在2.5×106cfu。該劑量代表100％的致死劑量，並且可重複地與通過集中在一個窄的時間範圍內的存活時間確定的終止點相一致。在所有這些實驗過程中，要經常監視受攻擊的小鼠以闡明症狀，症狀發展的階段和計算存活時間。
在DNA接種實驗中對B族鏈球苗LEEP來源基因的篩選pcDNA3.1+作為DNA疫苗載體商業獲得的pcDNA3.1+質粒(Invitrogen)，此後稱為pcDNA3.1，除非另有說明，在所有涉及用LEEP系統產生的基因靶的DNA免疫實驗中用作載體。設計pcDNA3.1用於在哺乳動物細胞中高水平穩定和短暫表達，並且在DNA疫苗實驗中pcDNA3.1作為宿主載體以檢測來自多種病原體的候選基因，已得到廣泛且成功地應用(Zhang等，感染和免疫，1761035-40(1997)；Kurar和Splitter，疫苗(Vaccine)，151851-57(1997)；Anderson等，感染和免疫，643168-3173(1996))。
上述載體包含便於多個基因靶克隆在人巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子/增強子的下遊的多克隆位點，上述啟動子/增強子可使靶基因在多種哺乳動物細胞和包括肌肉和免疫細胞的細胞類型中有效而高水平地表達。這對最佳的免疫反應是重要的，因為在體內產生保護性反應的過程中哪些細胞是最重要的尚不為人們所知。該質粒也包含允許其在大腸桿菌中方便地高拷貝數複製和生長的ColE1複製起點和用於在大腸桿菌中選擇的氨苄青黴素抗性基因(B-內醯胺酶)。另外pcDNA3.1在MCS上遊含有一個T7啟動子/引發位點，該位點可使克隆的基因以有義方向體外轉錄。
DNA疫苗的製備為每個用LEEP系統產生的目的基因設計寡核苷酸引物，除非另有說明。對每個基因進行徹底檢查，並可能地，將引物設計成可靶向被認為是僅編碼蛋白質成熟部分的基因部分(附錄I)；此目的是表達那些僅編碼靶基因蛋白質成熟部分的序列以便於蛋白質在哺乳動物細胞中表達時進行正確的摺疊。例如，在大多數情況下引物的設計使推測的N末端信號肽序列不包括在將克隆到pcDNA3.1表達載體內的最終擴增產物中。信號肽引導多肽前體通過蛋白質輸出途逕到達細胞膜，正常情況下在該途徑信號肽被信號肽酶I(如果是脂蛋白質，通過信號肽酶II)降解。所以，信號肽不組成成熟蛋白質的任何部分，不管該成熟蛋白質是出現在細菌的表面上還是被分泌。在N末端前導肽序列不十分明顯的情況下，將引物設計成靶向整個基因序列以便在pcDNA3.1中克隆和最終表達。
所有正向和反向寡核苷酸引物引入了適當的限制酶位點以便於克隆到pcDNA3.1MCS區。設計的所有正向引物在『atg』翻譯起始密碼子緊上遊也包括符合靶基因插入片段讀框的保守Kozak核苷酸序列5』-gccacc-3』。Kozak序列促進真核生物核糖體對起始區序列的識別。典型地，引入BamH I限制酶位點的正向引物開始的序列是5』-cgggatccgccaccatg-3』，隨後是與要擴增的那部分基因的5』端同源的序列。所有的反向引物引入了一個Not I限制酶位點序列5』-ttgcggccgc-3』。所設計的所有基因特異性的正向和反向引物都具有相容的熔解溫度以便於它們的擴增。
應用Vent DNA聚合酶(NEB)或rTth DNA聚合酶(PE應用生物系統)在生產商推薦的條件下通過PCR從無乳鏈球菌基因組模板擴增所有基因靶標。典型地擴增反應涉及一個95℃ 2分鐘的起始變性步驟，然後是95℃變性35秒，適當融解溫度下退火30秒，和72℃延伸1分鐘的35個循環(1分鐘擴增1kb的DNA)。此後，72℃ 10分鐘進行最後的延伸。將所有的PCR擴增產物用酚氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然後用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉澱。將特異的DNA片段用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離出來。將純化後的擴增基因DNA片段用適當的限制酶消化，然後克隆到pcDNA3.1質粒載體中，用大腸桿菌作為宿主。基因的成功克隆和維持通過限制性作圖和DNA測序確定。用Plasmid Mega試劑盒(Qiagen)對重組質粒DNA進行大規模(＞1.5mg)分離。
DNA疫苗接種實驗小鼠體內DNA疫苗實驗通過向6周齡的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)施用DNA完成。將進行疫苗接種的小鼠分為6組，每組用包含特定的用LEEP系統產生的靶基因序列的重組pcDNA3.1質粒DNA免疫，除非另有說明。將在Dulbecco’s PBS(Sigma)中的100μg總量的DNA肌肉注射到兩個後腿的脛骨前肌中。4周後用同量的DNA重複此步驟。為了進行比較，所有的疫苗實驗中都包括對照小鼠組。這些對照組或者不進行DNA疫苗接種或者只用非重組pcDNA3.1質粒DNA免疫，接種的時間安排如以上描述。第二次免疫後4周，所有小鼠組用致死劑量無乳鏈球菌血清型III(97/0099菌株)腹膜內攻擊。實際投放的細菌數通過在Todd-Hewitt/5％血瓊脂平板上鋪板接種物的連續稀釋物確定。將所有小鼠在感染後3到4天處死。在感染期間，監視受攻擊小鼠以發現與無乳鏈球菌所致疾病的發作相關的症狀。以適當次序排列的典型症狀包括豎毛，越來越嚴重的弓背姿勢，眼排洩物，越來越嗜睡和不願活動，不願活動經常是下部身體/後腿區域明顯癱瘓的結果。上述次序中靠後的症狀通常與垂死狀態的出現同時發生，在該階段對小鼠進行挑出殺死以阻止進一步的疾患。這些小鼠被判斷會非常快地死亡，挑出殺死的時間用來確定統計分析使用的存活時間。當發現小鼠死亡時，該小鼠的存活時間通過把一隻特定小鼠最後觀察到活著的時間和發現死亡的時間進行平均獲得，以確定更準確的死亡時間。該實驗的結果在表1中顯示，在圖2中以圖呈現。
對結果的解釋上述被克隆且用於攻擊實驗的任何DNA序列對攻擊起到了保護作用，則獲得陽性結果。在下列條件下DNA序列可確定具有保護作用-如果該DNA序列與對照組比較呈現的保護作用用Mann-WhitneyU檢驗確定具有統計學顯著性(95％的可信水平(p＞0.05))。
-如果用Mann-Whitney檢驗該DNA序列是顯著性介於兩者間的或不顯著的，但顯示一些保護特徵。例如，一個或一些遠離中心的小鼠與對照小鼠比較超出的存活時間有統計學顯著性。或者，與對照組中的對應小鼠比較最先死亡的時間也可以是延長的。當對一些結果的闡述受到與DNA疫苗投放有關的問題影響時將顯著性介於兩者間的或不顯著的結果視為潛在的陽性結果是可以接受的。確實，存活時間上的巨大差異可以反應給定小組的不同成員之間免疫反應的不同水平。
表1LEEP DNA免疫和GBS攻擊實驗存活時間的統計學分析
p值指當與非疫苗接種的對照組比較時的統計學顯著性。
評價ID-65(3-60)與未經接種的對照組比較時用「3-60(ID-65)」DNA疫苗免疫的小鼠顯示顯著更長的存活時間。
ID-66(3-5)與未經接種的對照組比較時用「3-5(ID-66)」DNA疫苗免疫的小鼠顯示顯著更長的存活時間。
實施例3在蛋白質疫苗接種實驗中B族鏈球菌LEEP來源的蛋白質的表達和篩選蛋白質表達將優選的基因，即基於序列特點推導出的(如圖1中描述)預測表達特徵選擇的那些基因，利用大腸桿菌作宿主用pET系統(Novagen，Inc.，Madison，WI)克隆和作為重組蛋白質表達。將靶基因克隆到pET28b(+)質粒表達載體中。pET28b(+)載體設計用於靶蛋白質高水平表達和純化。該載體攜帶一個用於靶基因轉錄的T7啟動子，然後是一個N末端His·Tag/凝血酶/T7·Tag構型，一個包含克隆用的單一限制酶位點的多克隆位點，和一個可選擇的C末端His·Tag序列。為進行選擇和維持靶基因的表達該載體也攜帶一個卡那黴素抗性基因(pET系統手冊，第8版，Novagen)。
蛋白質疫苗的製備為每個用LEEP系統產生的靶基因設計寡核苷酸引物，除非另有說明。對每個基因進行徹底檢查。在可能時，設計引物使它們靶向預計僅編碼蛋白質成熟部分的那部分基因(附錄II)。希望表達只對應於預計的成熟蛋白質的那些基因可以促進蛋白質最後在體外表達時的正確摺疊。設計寡核苷酸引物使編碼推測的靶蛋白質N末端的信號肽序列不包括在將被克隆至pET28b(+)中的最終擴增產物內。信號肽引導多肽前體通過蛋白質輸出途逕到達細胞膜，正常情況下在該途徑中信號肽被信號肽酶I(如果是脂蛋白質通過信號肽酶II)降解。所以，不管該成熟蛋白質是出現在細菌的表面還是形成分泌的蛋白質，預期信號肽不構成成熟蛋白質的任何部分。為達到此目的，用預測來自不同生物的胺基酸序列中信號肽切割位點的存在和位置的DNA StriderTM程序(CEA，法國)和SignalP V1.1程序(Nielsen等，蛋白質工程(ProteinEngineering)101-6(1997))預測傳統的信號肽和它們的切割位點。當N末端前導肽序列不明顯時，將引物設計成包括整個基因序列用於克隆和表達。
設計所有寡核苷酸引物使它們引入適當的限制酶位點以便於其克隆到pcDNA3.1 MCS區(附錄II)。正向引物包括一個Nco I(5』-ccatgg-3』)或Nhe I(5』-gctagc-3』)限制酶位點和與靶基因開放閱讀框(orf)在讀框內相符的「ATG」起始密碼子。所有的反向引物包括一個Not I限制酶位點5』-gcggccgc-3』，設計所有的反向引物以便靶基因能夠在包含C末端His·Tag的讀框中表達(即靶基因的終止密碼子不包括在其中)。應用Nco I和Not I可將N末端His·Tag，凝血酶和T7·TagDNA序列除去。同時在高效核糖體結合位點(來自噬菌體T7主要莢膜蛋白質)的緊下遊克隆靶基因，以便於T7 RNA聚合酶對靶基因高水平表達/翻譯，並且通過C末端的His·Tag便於下一步的純化。設計所有靶基因特異的正向和方向引物使它們具有相容的熔解溫度以便於它們擴增。
應用Vent DNA聚合酶(NEB)在生產商推薦的條件下通過PCR從無乳鏈球菌基因組模板擴增所有基因靶標。典型的擴增反應涉及一個95℃ 2分鐘的起始變性步驟，然後是95℃變性35秒，適當熔解溫度下退火30秒，72℃延伸1分鐘的35個循環(1分鐘擴增1kb的DNA)。之後，72℃ 10分鐘進行最後的延伸。將所有的PCR擴增產物用酚∶氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然後用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉澱。將特異的DNA片段用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離出來。然後將純化後的靶基因DNA擴增物用Nco I(或Nhe I)和Not I限制酶消化，然後克隆到用Nco I和Not I消化後的pET28b(+)質粒載體中，用大腸桿菌DH5α或大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主。基因的成功克隆和維持通過限制性內切酶作圖確定。
對靶蛋白質的表達和可溶性的確定表達重組蛋白質的大腸桿菌BL21 DE3 pET28b(+)菌株的甘油儲存物用於接種10ml包含卡那黴素(30μg/ml)的Luria液體培養基，劇烈振蕩(300rpm)，37℃培養過夜。
將步驟1中的過夜培養物1∶100稀釋接種20-40ml包含卡那黴素(30μg/ml)的Luria液體培養基，並劇烈搖動(300rpm)，37℃培養。當培養物的OD600達到0.6到1.0之間時加入IPTG，使終濃度達到1mM。典型地培養物需誘導3個小時。然後7000g 10分鐘離心收穫細胞。然後將細胞沉澱重新懸浮在1/10體積的裂解緩衝液中(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10mM咪唑；10％甘油)。然後加入溶菌酶至1mg/ml的終濃度，將此懸浮液在冰上孵育30分鐘。然後將該懸浮液在冰上進行超聲處理(200-300W，10秒鐘脈衝，進行6次，中間冷卻10秒針)。將裂解物10,000g離心20分鐘。將上清液(包含可溶性蛋白質)轉移到一個無菌的2ml eppendorf管中。將沉澱重新懸浮在2ml的裂解緩衝液(8M尿素；50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10％甘油)中。該懸浮液包含不溶性的蛋白質組份。從可溶性和不溶性組份中各取等分試樣轉移到新的eppendorf管中。加入等量的2×SDS-PAGE緩衝液，然後95℃加熱5分鐘使蛋白質樣品變性。將變性後的提取物樣品進行SDS-PAGE分析以確定靶基因的表達和溶解性。
重組靶蛋白質的大規模表達表達重組蛋白質的大腸桿菌BL21 DE3 pET28b(+)菌株的甘油儲存物用於接種10ml包含卡那黴素(30μg/ml)的Luria液體培養基，劇烈搖動(300rpm)，37℃培養過夜。取5ml重組菌株的過夜培養物用於接種250ml包含卡那黴素(30μg/ml)的Luria液體培養基，並劇烈搖動(300rpm)，37℃培養。當培養物的OD600達到0.6到1.0之間時加入IPTG至終濃度1mM。典型地將培養物誘導3個小時。然後將培養物離心成沉澱塊在-20℃冷凍儲存。
靶蛋白質的純化Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen LTD，West Sussex，UK；Cat.No.30210)用來純化附加His的重組蛋白質。在閱讀框中和pET28b(+)中的靶蛋白質表達的6×His親和標記物便於其與Ni-NTA的結合。Ni-NTA具備高結合能力(非特異性結合極微)，每ml樹脂能夠結合5-10mg 6×His-標記的蛋白質。6×His-標記物免疫原性極弱，pH8.0時，該標記物小且無電荷，所以一般不幹擾蛋白質的結構和功能(TheQIAexpressionist，Qiagen Handbook，March 1999)。
注意此處描述的所有蛋白質(LEEP來源的，除非另有說明)除了ID-65外都是在變性的條件下純化的。ID-65的製備和純化是在天然的條件下進行的。
在天然條件下的純化將冰凍的細胞沉澱在冰上融化15分鐘，然後將其重新懸浮在10ml裂解緩衝液中(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10mM咪唑；10％甘油)，然後加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，將懸浮液在冰上孵育30分鐘。然後將該懸浮液在冰上進行超聲處理(200-300W，10秒鐘脈衝，進行6次，中間冷卻10秒針)。然後將Dnase I(5μg/ml)加到裂解物中，再將該裂解物冰上孵育10-15分鐘。將裂解物在4℃，10,000rpm離心20分鐘以沉澱細胞碎片。將澄清的裂解物上清液裝載到聚丙烯柱上(Qiagen；Cat.No.34964)，蓋好底部的蓋子。然後加入1.5ml 50％的Ni-NTA，將柱子密封，4℃，用擺動輪輕輕混合懸浮液1-2小時。再將包含裂解物/Ni-NTA混合物的柱子直立在曲頸瓶架上使Ni-NTA沉澱下來。將底部的蓋子取走，使裂解物流出。用3到6個4ml體積的衝洗緩衝液(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；20mM咪唑；10％甘油)衝洗柱子。然後將蛋白質洗脫在0.5等份的洗脫緩衝液(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；500mM咪唑；10％甘油)中。對各部分洗脫物通過SDS-PAGE進行分析，將那些包含蛋白質的洗脫物收集在一起對一種PBS(pH7.0)-甘油(10％)溶液透析。
在變性條件下的純化和重摺疊將冰凍的細胞沉澱在冰上融化15分鐘，然後將其重新懸浮在10ml包含8M尿素，300mM NaCl，10％甘油，0.1M NaH2PO4，pH8.0，和10mM咪唑的緩衝液中。然後將細胞在室溫下輕輕旋渦搖動1小時裂解。將裂解物10,000g離心20分鐘以沉澱細胞碎片。將澄清的裂解物上清液裝載到聚丙烯柱上(Qiagen；Cat.No.34964)，蓋好底部的蓋子。然後加入1.5ml 50％的Ni-NTA漿，將柱子密封，在室溫，用擺動輪輕輕混合懸浮液1-2小時。再將包含裂解物/Ni-NTA混合物的柱子直立在曲頸瓶架上使Ni-NTA沉澱下來。將底部的蓋子取走，使裂解物流出。用4-8ml包含8M尿素，300mM NaCl，10％甘油，0.1M NaH2PO4，pH8.0，和10mM咪唑的緩衝液衝洗柱子。用6-0M的梯度在包含0.1M NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCl，和10％甘油的緩衝液中衝洗樹脂以促使尿素的緩慢移出和靶蛋白質的逐步的重新摺疊。用包含0.1M NaH2PO4，pH7.0，500mM NaCl，和10％甘油的緩衝液再衝洗樹脂。然後將重組蛋白質洗脫在0.5ml等份的洗脫緩衝液(500mM咪唑，0.1M NaH2PO4，pH7.0，500mM NaCl，和10％甘油)中。對各洗脫組分通過SDS-PAGE進行分析，將那些包含蛋白質的洗脫物收集在一起對一種PBS(pH7.0)-甘油(10％)溶液透析。
在蛋白質作為抗原用於免疫和疫苗接種實驗之前將所有蛋白質進行SDS-PAGE分析，結果顯示在圖5，6和7中。
蛋白質的接種疫苗是由磷酸鹽緩衝鹽水/10％甘油中的靶蛋白質組成，並且與氫氧化鋁(alum)混合(ImjectAlum，Pierce，Rockford，Ill.)。每劑疫苗(除非另有說明)在50μl PBS/10％甘油中包含25μg的純化蛋白質，與50μl氫氧化鋁混合。6-8 CBA/ca小鼠的各組(Harlan，UK)用疫苗皮下免疫，4周後再免疫一次。對照組接受100μl劑量的PBS/10％甘油和氫氧化鋁。所有被接種的組都由6隻小鼠組成。在第7周攻擊小鼠(除非另有說明)。將2.5-5×106的細菌稀釋在0.5ml的Todd-Hewitt液體培養基中，腹膜內注射小鼠。每天記錄死亡共計7天。每天觀察受攻擊的小鼠的疾病症狀。以適當次序出現的典型症狀包括豎毛，越來越嚴重的弓背姿勢，眼分泌物，越來越嗜睡和不願活動，不願活動經常是下部身體/後腿區域明顯癱瘓的結果。上述次序中靠後的症狀通常與垂死狀態的出現同時發生，在該階段對小鼠進行選出殺死以阻止進一步的疾患。這些小鼠被判斷會非常快地死亡，挑出殺死的時間用來確定統計分析使用的存活時間。為確定一個比較準確的死亡時間，當發現小鼠死亡時，把這隻特定小鼠最後觀察到活著的時間和發現死亡的時間進行平均即為該小鼠的存活時間。
抗體反應的分析用2劑疫苗間隔4周免疫小鼠(每組6隻)。在初次免疫後的第3周和第6周進行小鼠尾部放血以獲得血清。用最初的純化蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中針對疫苗蛋白質成分的總的免疫球蛋白質G(IgG)效價。
標準的ELISA操作步驟溶液碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH9.8
0.80g Na2CO31.46g NaHCO3用HCl調pH至9.6加蒸餾水(dH2O)至終體積為500ml。
n-硝基苯磷酸底物二乙醇胺緩衝液，pH9.848.5ml二乙醇胺用1M HCl調pH到9.8加dH2O至終體積為500ml。
注意對於用來免疫的每種蛋白質來說ELISAs都是優化的操作步驟1.ELISA反應板(Greiner Labortechnik 96孔板Cat.No.655061)用碳酸鹽/碳酸氫緩衝液(50μl/ml)稀釋的適當濃度的重組蛋白質包被。用塑料或鉑覆蓋板4℃放置過夜。
2.在包含PBS/0.05％Tween-20的盆/容器中快速衝洗反應板2次然後拍幹。
3.用PBS/Tween中的3％BSA(100μl/孔)室溫封閉反應板1小時。
4.如前述用PBS/Tween衝洗3次然後如前述拍幹。
5.將(第一抗體)蛋白質特異性抗血清在PBS/Tween中從1/50開始倍增連續稀釋，加入反應板中(50μl/孔)，然後室溫孵育90分鐘。
6.如前述衝洗反應板(快速3次)，然後3分鐘浸泡2次(在PBS/Tween中)。
7.加入稀釋的第二抗體鹼性磷酸酶結合物。將抗小鼠總IgG鹼性磷酸酶結合物(羊抗小鼠IgG-AP，Southern BiotechnologyAssociates，Birmingham，AL.Cat.NO.1030-04)在PBS/Tween中進行1/3000稀釋，然後每孔加入50μl，室溫孵育90分鐘。
8.如步驟6中所述衝洗反應板。
9.加入底物。將一片5mg的硝基苯磷酸(Sigma低溫保存)溶解在5ml二乙醇胺緩衝液中。然後每孔加入100μl。用鉑覆蓋(光敏感反應)，然後在室溫放置30分鐘。在405nm波長處讀取光密度值(OD)。
10.畫出OD值對稀釋度的曲線(log標度)。當某稀釋度的OD值與包含1/50稀釋度的免疫前血清的孔所測得的OD值的均值相同時計算為終點效價。
ELISA反應板的格式
表的概述Pre將聚集的接種前的血清進行1/50稀釋，為進行終點效價的計算，每塊反應板上包含加入該血清(每孔50μl)的重複孔。
2°一個空白對照孔，其中沒有加入第二抗體結合物，代之以PBS/Tween1°一個空白對照孔，其中沒有加入第一抗體，代之以PBS/Tween重複 每種血清以重複形式分析對所用的稀釋系列進行了說明(參見此表的第一行)。從1/50稀釋度開始，在PBS/Tween中將血清進行2倍稀釋，如表所示連續進行倍比稀釋。
蛋白質免疫數據
ID-65和ID-83ID-65和ID-83疫苗由與氫氧化鋁(alum)(ImjectAlum，Pierce，Rockford，III.)混合的磷酸鹽緩衝鹽水/10％甘油中的靶蛋白質組成。每劑疫苗在100μl PBS/10％甘油中包含20μg的純化蛋白質，與50μl氫氧化鋁混合。一組6-8周齡的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)用ID-65和ID-83疫苗皮下免疫，4周後再免疫一次。對照組接受150μl劑量的PBS/10％甘油(2∶1)和氫氧化鋁。所有組都包含6隻小鼠。在初次免疫後5周時進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中針對ID-65和ID-83蛋白質的總的免疫球蛋白質G(IgG)抗體的存在。也用最初的疫苗接種後6周從PBS/10％甘油免疫的對照組中獲得的血清進行ELISA。
注意ELISA反應板用ID-65和ID-83蛋白質以1μl/ml的濃度進行包被。
ID-65和ID-83蛋白質疫苗接種的ELISA結果用2劑ID-65和ID-83疫苗間隔4周免疫小鼠(每組6隻)。在初次免疫後的第5周進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化的ID-65和ID-83蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中存在的針對疫苗蛋白質成分的免疫球蛋白質G(IgG)效價。優化後，純化的ID-65和ID-83都以1μg/ml的濃度包被ELISA反應板。檢測免疫前血清(1/50稀釋度)的總的IgG效價。結果顯示在表2，圖示見圖8。
表2
蛋白質免疫和攻擊數據(ID-93)ID-93ID-93疫苗是由磷酸鹽緩衝鹽水/10％甘油中的靶蛋白質與氫氧化鋁混合(alum)(ImjectAlum，Pierce，Rockford，III.)組成。每劑疫苗在100μl PBS/10％甘油中包含25μg的純化蛋白質，與100μl氫氧化鋁混合。一組6-8周齡的CBA/ca小鼠用ID-93疫苗皮下免疫，4周後再免疫一次。對照組接受PBS/10％甘油和氫氧化鋁。2組都包含6隻小鼠。在第7周攻擊小鼠(除非另有說明)。將5×106的細菌稀釋在0.5ml的Todd-Hewitt液體培養基中進行腹膜內(i.p.)注射。每天觀察受攻擊的小鼠的疾病症狀。每天記錄小鼠的死亡，共記錄7天。存活的數據顯示在表3，圖示見圖9。
在初次免疫後的第3周和第6周進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化的ID-93蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中針對ID-93蛋白質的總的免疫球蛋白質G(IgG)抗體的存在。也用在最初的疫苗接種後6周時從PBS/10％甘油免疫的對照組中獲得的血清進行ELISA。注意ELISA反應板用ID-93蛋白質以1μl/ml的濃度進行包被。表3ID-93蛋白質免疫和GBS攻擊實驗存活時間的統計學分析
p值代表當與非免疫的對照組相比時統計學顯著性。
評價ID-93(RS-70)用ID-93-氫氧化鋁疫苗免疫的小鼠與用PBS-氫氧化鋁的對照組相比顯示存活時間顯著延長。
(用95％置信水平(p＞0.05)的Mann-Whitney U檢驗確定統計學顯著性)。
ID-93蛋白質疫苗接種的ELISA結果用2劑ID-93疫苗間隔4周免疫小鼠(每組6隻)。在初次免疫後的3周和6周進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化的ID-93蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中存在的針對疫苗蛋白質成分的免疫球蛋白質G(IgG)效價。優化後，純化的ID-93以1μg/ml的濃度包被ELISA反應板。檢測免疫前血清(1/50稀釋度)的總的IgG效價。結果顯示在表4，圖示見圖10。
表4
蛋白質免疫數據ID-89和ID-96ID-89和ID-96疫苗是由磷酸鹽緩衝鹽水/10％甘油中的靶蛋白質組成，依照生產商的使用說明與TitreMax金(TritreMax Gold)佐劑(Sigma，Missouri，USA)混合的。ID-89疫苗在50μl PBS/10％甘油中包含25μg的純化蛋白質，與50μl TitreMax金混合。ID-96疫苗在50μl PBS/10％甘油中包含12.5μg的純化蛋白質，與50μl TitreMax金混合。各組6-8周齡的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)用ID-89和ID-96疫苗皮下免疫，4周後再免疫一次。對照組接受100μl劑量的PBS/10％甘油和TitreMax金(1∶1)。兩組都包含6隻小鼠。在初次免疫後3周和6周時進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中針對ID-89和ID-96蛋白質的所有免疫球蛋白質G(IgG)抗體的存在。也用最初的疫苗接種後3周和6周從PBS/10％甘油免疫過的對照組中獲得的血清進行ELISA。
注意ELISA反應板用ID-89或ID-96蛋白質各自以1μl/ml和3μl/ml的濃度進行包被。
ID-89和ID-96蛋白質疫苗接種的ELISA結果用2劑ID-89和ID-96疫苗間隔4周免疫小鼠(每組6隻)。在初次免疫後的3周和6周進行小鼠尾部放血以獲得血清。用純化的ID-89和ID-96蛋白質作為包被抗原，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)確定血清中存在的針對疫苗蛋白質成分的免疫球蛋白質G(IgG)效價。優化後，純化的ID-89和ID-96分別是以1μg/ml和3μg/ml的濃度包被ELISA反應板。檢測免疫前血清(1/50稀釋度)的總的IgG效價。也用最初的疫苗接種後3周和6周時從PBS/10％甘油免疫過的對照組中獲得的血清進行ELISA。結果顯示在表5a和5b中，圖示見圖11。
表5a
表5b
實施例4候選疫苗抗原基因在B族鏈球菌不同的分離物中的保守性和可變性為確定用LEEP系統分離出的新的B族鏈球菌基因的交叉-血清型保守性進行初步的Southern印跡分析，除非另有說明。對靶基因血清型分布的分析也可以確定它們作為GBS疫苗中的抗原成分的潛在用途。作為本研究的一部分對其DNA進行了分析的B族鏈球菌菌株在附錄III中列出。
Southern印跡分析時用做DNA探針的特定靶基因的擴增和標記為每個採用LEEP系統來源的目的基因設計寡核苷酸引物，除非另有說明。已在附錄II中描述的相同的引物用於擴增相應的基因特異性的DNA探針。特異的靶基因應用Vent DNA聚合酶(NEB)依照生產商的使用說明通過PCR擴增。典型的反應在包含50ng GBS模板DNA的100μl體積中進行，其中還包含十分之一體積的酶反應緩衝液，每種引物1μM，每種dNTP 250μM和2單位的Vent DNA聚合酶。典型的反應包含最初的95℃變性2分鐘，然後是95℃變性30秒，適當的熔解溫度下退火30秒，和72℃延伸1分鐘(擴增一千個DNA鹼基需要1分鐘)的35個循環。退火溫度通過兩個寡核苷酸引物中熔解溫度較低的確定。最後72℃延伸10分鐘後結束反應。
將所有的PCR擴增產物用酚氯仿(2∶1∶1)抽提一次，然後用氯仿(1∶1)抽提一次，再用乙醇沉澱。將特異的DNA片段用QIA quick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離出來。
用作DNA探針時，擴增後純化的基因DNA片段用DIG核酸標記試劑盒(Boehringer Mannheim)依照生產商的使用說明進行地高辛配基標記。
B族鏈球菌基因組DNA的Southern印跡雜交分析基因組DNA先前已從做過LEEP來源(除非另有說明)的基因靶的保守性研究的所有B族鏈球菌菌株中分離。用Hin D III或者EcoR I限制酶(NEB)依照生產商的使用說明對適當濃度的DNA進行消化和瓊脂糖凝膠電泳的分析。DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳後，把凝膠在0.25M HCl中變性20分鐘，然後將DNA通過毛細管印跡的方式過夜轉移到HybondTMN+膜(Amersham)上。該方法基本如Sambrook等(1989)所述，Whatman 3MM的芯放在0.4M NaOH的池子上面的平臺上。轉移完成後，將濾膜在2×SSC中簡短地衝洗，放在Saran包裝套(Dow化學公司)中4℃儲存。
當使用DIG核酸檢測試劑盒時按Boehringer Mannhein推薦的條件對濾膜進行預雜交，用地高辛配基標記的DNA探針雜交，然後進行衝洗。將濾膜在雜交緩衝液(1％ w/v提供的封閉劑，5×SSC，0.1％ v/vN-月桂基肌氨酸，0.02％ v/v十二烷基硫酸鈉[SDS])中68℃預雜交1小時。將地高辛配基標記的DNA探針在加入到雜交緩衝液之前99.9℃變性10分鐘。允許在Hybaid微雜交爐中旋轉的Hybaid管中進行過夜雜交。用2×SSC-0.1％SDS室溫下衝洗濾膜5分鐘2次將未結合的探針除去。然後為增加嚴格性將濾膜用0.1×SSC-0.1％SDS 68℃衝洗15分鐘2次。DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)用來免疫學檢測特異結合的地高辛配基標記的DNA探針。
Southern印跡分析的結果除非另有說明，所有的基因組消化物和它們相應的Southern印跡都遵循下面表6中描述的相同泳道順序。
表6
為達到比較的目的，決定分析GBS rib基因的血清型分布，rib基因編碼已知的保護性的免疫原Rib。以前已發現Rib在血清型III中和血清型II的一些菌株中存在，但在血清型Ia和Ib中不存在(Stalhammar-Carlemalm等，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)1771593-1603(1993))。
這種模式的確定不僅對後續的結果的解釋增加了可信度，而且也可以確定rib同源基因在此處研究的其餘GBS血清型中是否存在。為在Southern印跡分析中作為基因探針應用的rib的擴增所設計的引物在附錄II中描述。
表7-圖12的泳道順序(rib基因的Southern印跡分析)
對Rib(圖12)的評論圖12顯示的Southern印跡分析提示rib基因不是在所有GBS血清型中都是保守的。血清型Ia和Ib的所有菌株(泳道2到5)和血清型II的118/158和97/0057菌株(泳道8和9)中都不存在rib。然而，rib在血清型II的18RS21和1954/92(泳道6和7)菌株和血清型III的所有菌株(泳道10到13)中都存在。這與以前發表的數據相一致(Stalhammar-Carlemalm等，1993[同上])。Rib也在代表血清型VII和VIII的菌株(泳道17和18)中存在，但在代表血清型IV，V和V(泳道14到16)的菌株和對照菌株(泳道19和20)中不存在。rib基因探針以較低的強度與來自代表血清型Ia，Ib，IV，VI，VII的菌株和血清型II的菌株118/158和97/0057的基因組DNA片段雜交。這可能提示在這些菌株中存在與rib低水平同源性的基因。這些雜交的DNA片段可能包含編碼與Rib蛋白質同源性很高的Ca蛋白質抗原的GBS bca基因(Wastfelt等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem)，27118892-18897(1996))的同源基因。如果情況確是如此，這將與以前的工作即上述2種蛋白質之一在血清型Ia，Ib，II和III的所有菌株中都是陽性(Stalhammar-Carlemalm等，1993[同上])的相一致。然而，rib基因在不同GBS血清型之間明顯的可變性的分布使它作為用於對抗所有血清型的交叉保護性的GBS疫苗的候選物質不夠理想。
對ID-65(圖13)的評論圖13中描述的Southern印跡分析提示基因ID-65在所有GBS血清型中是保守的。該基因探針特異性地與來自所有GBS代表菌的DNA消化物中大約3.0kb的Hin DIII消化的基因組DNA片段雜交，而在兩個對照菌株中都不存在(泳道18和19)。這提示ID-65基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。ID-65 DNA探針也與1.636bp的分子量標準物進行微弱的雜交(來自NEB的1kb的DNA梯用來估計所有Southern印跡分析中的DNA片段的大小)。
對ID-89(圖14)的評論圖14中描述的Southern印跡分析提示基因ID-89並排在所有GBS血清型中保守。來自16個GBS菌株中12個菌株的4.0kb Hin DIII消化的基因組DNA片段與ID-89基因探針特異性地雜交。另外，來自GBS菌株Ib(SB35)(泳道4)的3.25kb Hin DIII消化的基因組DNA片段也與ID-89基因探針特異性地雜交。然而，ID-89基因探針不與來自菌株Ia(515)[泳道2]，IV(3139)[泳道13]和V(1169-NT)[泳道14]的消化的基因組DNA片段雜交，這提示這些菌株不存在ID-89同源物。
對ID-93(圖15)的評論圖15中描述的Southern印跡分析提示基因ID-93在所有GBS血清型中是保守的。該基因探針特異性地與來自所有GBS代表菌的DNA消化物中大約3.25kb的Hin DIII消化的基因組DNA片段雜交，而在兩個對照菌株中不存在(泳道18和19)。這提示ID-93基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。
對ID-96(圖16)的評論圖16中描述的Southern印跡分析提示基因ID-96在所有GBS血清型中是保守的。基因探針特異性地與來自所有GBS代表菌的DNA消化物中大約12.0個kb的EcoR I-消化的基因組DNA片段雜交，而在兩個對照菌株中不存在(泳道18和19)。這提示ID-96基因在所有GBS血清型(和菌株)中在基因和基因座水平是保守的。
附錄IID-65正向引物5』-cggatccgccaccatgGCGGATCAAACTACATCGGTTC-3』反向引物5』-ttgcggccgcGTTGGGATAACTAGTCGGTTTAGTCG長度(包括限制性位點)＝1541bp納入1515bp編碼推測的成熟蛋白質的505個胺基酸的基因特異性序列。
PCR擴增的退火溫度＝60℃預測編碼信號肽的序列從擴增產物中略去ID-66正向引物5』-cggatccgccaccatgAATCTTTATTTCCATAGTACTCCCTTGC-3』反向引物5』-ttgcggccgcAAAATGATCAGTTTGAGGGTAAAAGAG-3』長度(包括限制性位點)＝767bp納入747bp編碼推測的成熟蛋白質的247個胺基酸的基因特異性序列。
PCR擴增的退火溫度＝60℃預測編碼信號肽的序列從擴增產物中略去附錄IIID-65正向引物5』-catgccatgGCGGATCAAACTACATCGGTTC-3』反向引物5』-ttgcggccgcGTTGGGATAACTAGTCGGTTTAGTCG長度(包括限制性位點)＝1534bp納入1515bp編碼推測的成熟蛋白質的505個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝60℃ID-83正向引物5』-catgccatggcaAAAATAGTAGTACCAGTAATGCCTC-3』反向引物5』-ttgcggccgcCTCTGAAATAGTAATTTGTCCG-3』長度(包括限制性位點)＝626bp納入624bp編碼推測的成熟蛋白質的208個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝52℃ID-89正向引物5』-catgccatgggaAAGAAAGCAAATAATGTCAGTCC-3』反向引物5』-ttgcggccgcATTGGGTGTAAGCATTTTTTC-3』長度(包括限制性位點)＝990bp納入969bp編碼推測的成熟蛋白質的323個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝54℃TD-93
正向引物5』-catgccatgggaACTGAGAACTGGTTACATACTAAAG-3』反向引物5』-ttgcggccgcATTAGCTTTTTCAACAATTTCTC-3』長度(包括限制性位點)＝759bp納入744bp編碼推測的成熟蛋白質的248個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝51℃ID-96正向引物5』-ctagctagccgATGTTTGCGTGGGAAAG-3』反向引物5』-ttgcggccgcATAAGATTTAACAATACCAAGTAATATAGC-3』長度(包括限制性位點)＝944bp納入921bp編碼推測的成熟蛋白質的307個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝53℃rib(對照)正向引物5』-ggggtaccggccaccATGGCTGAAGTAATTTCAGGAAGT-3』反向引物5』-cggaattccgTTAATCCTCTTTTTTTCTTAGAAACAGAT長度(包括限制性位點)＝3559bp納入3531bp編碼推測的成熟蛋白質的1177個胺基酸的基因特異序列。
PCR擴增的退火溫度＝55℃附錄III以下列出的是對其DNA做過基因保守性分析的B族鏈球菌菌株(血清型和菌株名稱)的詳細資料。
血清型 菌株Ia 515Ia A909Ib SB35Ib H36BII 18RS21II 1954/92II 118/158II 97/0057III BM110III BS30III M781III 97/0099IV 3139V1169/NTVI GBS VIVII 7271VIII JM9在分析中還包括了用作對照目的的A族鏈球菌菌株(血清型M1，菌株NCTC8198)和肺炎鏈球菌(血清型14)。
權利要求
1.B族鏈球菌的多肽或蛋白質、或其片段或衍生物，其中該多肽或蛋白質具有從圖1描述的那些序列中選擇的序列。
2.權利要求1中所述的蛋白質、多肽和肽的衍生物或變異體，其與權利要求1中所述的那些蛋白質、多肽和肽有至少50％的同一性。
3.權利要求1或2中所述的B族鏈球菌的多肽或蛋白質、或其衍生物或變異體，是分離的或重組的。
4.包含或由一種序列組成的核酸分子，該序列是(i)在說明書圖1所示DNA序列或它們的RNA等價物中的任何序列；(ii)與(i)中序列的任何序列互補的序列；(iii)與(i)或(ii)的那些序列編碼相同的蛋白質或多肽的序列；(iv)顯示與(i)、(ii)和(ii)的那些序列中的任何序列有實質同一性的序列；或(v)編碼圖1所示核酸分子的衍生物或片段的序列。
5.載體，其包含一個或多個權利要求4中所定義的核酸分子。
6.權利要求4中所述的載體，該載體進一步包含編碼以下成員任何一個或多個的核酸啟動子，增強子，信號序列，前導序列，翻譯起始和終止信號，DNA穩定性控制區域，或融合部分。
7.權利要求5或6中所述的載體在轉化或轉染原核或真核宿主中的應用。
8.轉化了權利要求5或6中定義的載體的宿主細胞。
9.產生權利要求1或2中所述的B族鏈球菌多肽或蛋白質、或其衍生物或變異體的方法，該方法包括在權利要求8所述的宿主細胞中表達上述多肽或蛋白質。
10.與權利要求1到3之任何一項所定義的蛋白質、多肽、肽、其片段或衍生物中的一個或多個結合的抗體、親和體或其衍生物。
11.一種免疫原性組合物，該組合物包含權利要求1到3之任何一項所定義的蛋白質、多肽、肽、其片段或衍生物中的一個或多個。
12.權利要求11中所述的免疫原性組合物，其中蛋白質、多肽、肽、或其片段或衍生物包括ID-65或ID-83，ID-89，ID-93或ID-96。
13.權利要求11或12中所述的免疫原性組合物，其是疫苗。
14.一種免疫原性組合物，該組合物包含權利要求4中定義的核酸序列的一個或多個。
15.權利要求14中所述的免疫原性組合物，其中核酸序列包括ID-65或ID-66。
16.權利要求14或15中所述的免疫原性組合物，其是疫苗。
17.權利要求11到16之任何一項所定義的免疫原性組合物在製備用於治療或預防B族鏈球菌感染的藥物中的應用。
18.一種檢測B族鏈球菌的方法，該方法包括使待檢樣品與至少一個權利要求10所述的抗體、親和體或其衍生物接觸的步驟。
19.一種檢測B族鏈球菌的方法，該方法包括使待檢樣品與至少一個權利要求1到3之任何一項所定義的蛋白質、多肽、肽、片段或衍生物接觸的步驟。
20.一種檢測B族鏈球菌的方法，該方法包括使待檢樣品與至少一個權利要求4所定義的核酸分子接觸的步驟。
21.一種檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一個權利要求10所定義的抗體、親和體、或其衍生物。
22.一種檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一個權利要求1到3之任何一項所定義的B族鏈球菌蛋白質、多肽、肽、其片段或衍生物。
23.一種檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒包含至少一個權利要求4所定義的核酸分子。
24.確定權利要求1到3之任何一項所定義的蛋白質、多肽、肽、其片段或衍生物是否代表潛在的抗微生物靶標的方法，該方法包括使所述蛋白質失活和確定B族鏈球菌是否仍然存活。
全文摘要
描述了來自B族鏈球菌的新蛋白質抗原,以及編碼它們的核酸序列。也描述了疫苗的用途和篩選方法。
文檔編號A61P31/04GK1377410SQ0081361
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月7日 優先權日1999年9月7日
發明者R·W·F·勒佩吉, J·M·韋爾斯, S·B·漢尼菲 申請人:微生物技術有限公司