一種腫瘤疫苗及其合成方法
2023-12-09 02:09:26
專利名稱：一種腫瘤疫苗及其合成方法
技術領域：
本發明關於ー種腫瘤疫苗及其合成方法，其利用生物信息學的運算方式，設計出腫瘤相關抗原的序列，再據之合成腫瘤抗原，以形成一腫瘤疫苗。
背景技術：
癌症，或稱惡性腫瘤，在世界各國均是ー項令人憂心的健康問題，儘管多年來各界已不斷發展出新的診斷技術和各類治療方法，例如外科手術切除、放射性治療、以及化學治療，但是和一般常見的糖尿病、心臟病、感染性疾病、和精神性疾病比較起來，癌症依舊是首要的死亡原因。因此，現今醫界的首要課題便是研發出更新、更有效、以及能避免腫瘤復發的治療方法。基於上述理由，科學家將一部份心カ轉移到研究免疫系統與癌症之間的關係上，因此腫瘤免疫治療方法在過去十年中漸漸地發展成為ー項深具潛力的癌症治療方式， 為人們提供另ー種治療的選擇。所謂癌症免疫療法，指的是利用人體的免疫系統來對抗腫瘤，通過激發或調控人體專ー性免疫力來殺死癌細胞，以達到治療癌症的目的。樹狀細胞(Dendriticcell, DCs)是專門的抗原提呈細胞(Antigen-presentingcell)，近來常常被應用於免疫療法。樹狀細胞可以將抗原呈現給未活化的T細胞，進而啟動細胞和體液免疫反應。樹狀細胞會表達大量的細胞表面主要組織相容性複合體(Majorhistocompatibility complex,以下簡稱MHC)分子並且辨認多種來自細菌、病毒、其它病原體和內生性腫瘤的抗原。載有腫瘤抗原的樹狀細胞可以被稱作樹狀細胞疫苗(DCvaccine)，樹狀細胞疫苗可以引發具有抗原專ー性的免疫反應來對抗腫瘤。然而，樹狀細胞用於癌症的免疫療法卻有其限制。公知技術中，通常需要將樹狀細胞與分離自病人體內腫瘤細胞的腫瘤抗原共同培養一段時間後，才能讓樹狀細胞將該腫瘤抗原呈現給T淋巴細胞表面，以引發人體內針對該腫瘤抗原的免疫反應。由於不同個體的樹狀細胞表達不同的MHC分子，ー種MHC分子只能識別某ー種或某ー類抗原決定子(Epitope)，其稱為MHC的限制性反應(MHC restricted response)。因此,僅用一種腫瘤抗原實施免疫治療,其效果與毒殺對象局限。再者，公知的樹狀細胞免疫療法目前僅能針對個別患者當時所患的癌症量身訂製，並且製備的過程與技術繁複冗長、花費不貲，就成本考慮而言施行不易。由於免疫系統具有辨識非自體的抗原並加以消滅的能力，腫瘤所表達的抗原(或稱腫瘤抗原)已成為可以發展癌症免疫療法的工具之一。用於免疫療法的腫瘤抗原可以被區分為兩種類型，一類是只有腫瘤細胞會表現的腫瘤特異性抗原(tumor-specificantigen,以下簡稱TSA);另ー類抗原是在腫瘤細胞的表現量明顯高於一般正常細胞表現量的腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,以下簡稱TAA)。然而,要能找到ー個TSA來製備腫瘤疫苗是相當不容易的。另ー方面，由於正常細胞也會表現TAA，所以免疫系統會將TAA視為自體分子，因此使用TAA來製備腫瘤疫苗所能引發的免疫反應和腫瘤毒殺效果非常低。腫瘤相關抗原之所以不能引發強效的免疫反應，是因為免疫系統對於TAA這類自體抗原具有耐受性。免疫系統的ー個特色是它具有耐受性，這在協助免疫系統區分自體與外來分子時扮演很重要的角色。免疫系統的耐受性可以分為兩種，ー是中樞耐受性，另ー個是周邊耐受性。中樞耐受性表現在胸腺(產生T淋巴球)和骨髄(產生B淋巴球)。以T淋巴球來說，自體抗原與MHC組合而成的複合體和T細胞受器(T cellreceptors,以下簡稱TCR)之間的親和カ對於T細胞的免疫耐受性而言相當重要，凡是被MHC識別的自體抗原與T細胞受器有高親和カ的先驅T細胞都會經由負篩選的作用而被剔除，只留下親和力低的T細胞，以防止免疫系統對自體細胞組織展開攻擊。雖然這個機制在正常情況下可以保護自體的細胞組織，但在癌症發生的時候，無異是給了癌細胞ー個保護傘，讓癌細胞躲過人體的保衛系統，在人體內日益壯大形成腫瘤，終致危害健康。在公知的以腫瘤抗原作為免疫療法的技術中，僅能針對單ー種類的腫瘤進行治療，或者僅能引發細胞性免疫反應而無法刺激體液性免疫反應，效果局限且不能防止癌細胞復發，並且由於無法突破人體免疫系統的耐受性機制，因此所能引發的免疫效カ不夠強，導致治療徒勞無功。 綜上所述，免疫療法固然對於癌症的治療而言，提供了一種新的可能，但是公知的癌症免疫療法卻存在著如只能針對單ー個體內的特定腫瘤抗原進行毒殺、只能攻擊某ー種腫瘤、費用昂貴又費時、無法突破自體免疫耐受性、甚至引發副作用、與無法防止復發等問題尚待克服。
發明內容
本發明的目的在於提供ー種可以不受限於免疫系統耐受性和MHC的限制性，能夠針對多種不同癌細胞進行毒殺攻擊、且可以防止癌症復發的腫瘤疫苗。本發明的另一目的在於提供ー種合成方法，以製備可不受限於免疫系統耐受性、能夠針對多種不同癌細胞進行毒殺攻擊、且可以防止癌症復發的腫瘤疫苗。雖然T細胞受器對於MHC的辨認具有很強的專ー性，但有初歩的研究結果顯示，當有不同的抗原和ー個或多個MHC分子結合時，會驅使TCR的抗原辨識能力下降，導致T細胞對自體抗原產生交叉反應，顯示TCR的辨識能力具有可變性。現有的ー種假說是，源於寄生蟲、細菌和病毒這類具傳染性的病原體抗原，可能會因為病原體和宿主自體抗原間的某些微差異而導致免疫系統降低對於自體抗原的免疫耐受性的限制。因此推估，只要改變依照TAA所產生的抗原的胺基酸序列，便可以透過樹狀細胞協助活化可毒殺腫瘤的T細胞，而引發針對表達TAA的腫瘤細胞發生自體免疫反應。根據這個理論，發明人等決定以胺基酸序列為基礎來設計腫瘤疫苗以弓I發免疫系統對癌細胞的攻擊。大多數的腫瘤疫苗是依據其和人類主要組織相容性複合體(HLA)的結合力設計的。含有8至10個胺基酸的單ー胜肽抗原決定子(single-peptide epitope)可以和樹狀細胞上的第一型細胞表面主要組織相容性複合體(MHCI)結合而引發細胞毒殺T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的反應,而可以和第二型細胞表面主要組織相容性複合體(MHCII)結合的胜肽類抗原決定子可以活化輔助T細胞(Helper T cell)，以協助CTL的反應和抗體的產生。MHCII不同於MHCI的地方在於，MHCII的抗原結合區可以容納不同長度的胜肽鏈，通常介於13至25個胺基酸序列的長度。由於活化後的輔助T細胞也可以協助活化記憶T細胞(Memory cytotoxic T cells),因此和MHCII相關的腫瘤疫苗可以有效的防止癌症在治療後再度復發。是故，發明人決定著手研發對於MHCII具有專ー性的腫瘤疫苗，以用來製備可不受限於免疫系統耐受性、又能夠針對多種不同癌細胞進行毒殺攻擊的腫瘤疫苗。
本發明採用表皮生長因子受體(Epidermal growth factorreceptor,以下簡稱EGFR或ERBB)與上皮黏蛋白I (Mucinproteintypel，MUCI)作為腫瘤疫苗的候選基因。表皮生長因子受體是受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases)家族的ー員，是ー種穿膜醣蛋白，具有ー細胞外的配位子結合區、一穿膜親脂性片段、以及ー細胞內蛋白質激酶(protein kinases)功能區。目前在人體共發現有四種EGFR亞型，包括ERBB1，ERBB2，ERBB3和ERBB4。EGFR在多種不同的實體腫瘤中高度表現，其中包括結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎臟癌、肺癌、胰臟癌、前列腺癌以及頭頸癌等。上皮黏蛋白1(以下簡稱MUC1)是一種穿膜醣蛋白(glycosylatedtransmembraneprotein), MUCl在一些常見的上皮惡性腫瘤中會大量表達，例如胰臟癌、乳癌、前列腺癌和大腸癌等。由於MUCl和惡性細胞的快速增生有夫，因此MUCl已被視為ー個在功能上具有顯著意義的致癌基因，且被歸類為ー種腫瘤相關抗原而將之應用於癌症免疫療法。本發明人通過生物信息學方法，找出和人類白血球組織(Humanleukocyteantigen,HLA) ニ類抗原(即人類的細胞表面主要組織相容性複合體MHCII)具有較高親和 力的序列，經過設計改良，而研發出能與HLA ニ類抗原分子專ー性結合的ERBB1、ERBB2和MUCl抗原序列，共得到14種，井分為野生型和突變型兩組，每組各含7種抗原。這些序列可為大多數的HLA ニ類抗原所辨認。這些HLA分子的分布可覆蓋99%以上的華人群體(HanChinese population)。該 14 種抗原序列如 SEQ NO. I 至 SEQ NO. 14 所不。本發明實施例提供ー種腫瘤疫苗，其包括至少ー腫瘤抗原，其中，該腫瘤抗原的序列選自SEQ NO. I至SEQ NO. 14的群組，其中各抗原序列以道爾頓為單位的分子量分別為SEQ NO. I :3693 ；SEQ NO. 2 :4121 ；SEQ NO. 3 :3729 ；SEQ NO. 4 :3842 ；SEQ NO. 5 :4003 ；SEQ NO. 6 :3818 ；SEQ NO. 7 :3901 ；SEQ NO. 8 :3954 ；SEQ NO. 9 :3885 ；SEQ NO. 10 :4010 ；SEQNO. 11:3927 ；SEQ NO. 12 :3866 ；SEQ NO. 13 :3641 ；SEQ NO. 14 :3629。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，該腫瘤抗原序列由至少30個胺基酸組合而成。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，該腫瘤抗原以化學法或基因工程法合成。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，該腫瘤抗原具有專ー性的一表皮生長因數受體與一上皮黏蛋白的抗原決定子，且是人類白血球組織ニ類抗原分子的限制性抗原。本發明實施例提供一種腫瘤疫苗的合成方法，其包含以下步驟(a)根據一人類白血球組織抗原DR、DQ和DP各亞型分子在華人群體中的分布，選擇ー表皮生長因子受體I、一表皮生長因子受體2以及ー上皮黏蛋白I的胺基酸序列上可被這些人類白血球組織ニ類抗原分子所識別的抗原決定子；(b)以生物信息學方法分析抗原決定子與各人類白血球組織ニ類抗原分子之間的親和力，並挑選出合適的腫瘤抗原胺基酸序列；(c)根據步驟(b)的結果設計出14種包含至少30個胺基酸的ー腫瘤抗原序列；(d)以化學法或基因工程法合成這些腫瘤抗原；(e)將這些合成的14種腫瘤抗原分別與ニ甲基亞碸混合，使每ー種腫瘤抗原混合液的最終濃度為20mg/mL至40mg/mL，並將這些腫瘤抗原混合液分為野生型和突變型兩組，每組包括7種腫瘤抗原混合液；(f)將同一組中的腫瘤抗原混合液分別取出相同體積，並充分混合在一起，而得到一包含7種野生型或突變型腫瘤抗原的腫瘤疫苗，並使其中每種腫瘤抗原的最終濃度為2mg/mL 4mg/mL。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，這些腫瘤抗原的抗原決定子能被人類白血球組織ニ類抗原中分子所識別。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
圖I為本發明中，腫瘤疫苗合成方法的流程圖。
具體實施例方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其它實施例，都屬於本發明保護的範圍。I.腫瘤疫苗設計與實施首先，以人類表皮生長因子受體I (ERBBl)、表皮生長因子受體2 (ERBB2)以及上皮黏蛋白l(Human mucin type I protein, MUC1)作為癌症腫瘤疫苗候選基因,將這些候選基因所轉譯的胺基酸序列與華人(Han Chinese)的HLA ニ類抗原序列進行比對。接著，利用生物信息學方法找出與這些華人的HLA ニ類抗原之間親和力高的腫瘤抗原胺基酸序列。其中，所謂生物信息學方法包含利用計算機與軟體等輔助工具進行資料庫檢索、運用計算機運算法對檢索到的序列數據進行比對與分析、使用計算機運算法預測HLA ニ類抗原和ERBBU ERBB2與MUCl腫瘤抗原胺基酸序列之間的親和力等。根據前述生物信息學方法預測的結果，挑選出適合的腫瘤抗原序列，組合成含有至少30個胺基酸的腫瘤疫苗，其中較佳的實施態樣為含有33個胺基酸(33-mer)。依照上述方法，可以得到較佳的14種腫瘤抗原序列，最後再以化學法或基因工程法合成這些腫瘤抗原(實際合成時並不需要使用實體的ERBB1、ERBB2、MUCl等，而用生物信息學方法得到即可)。前述的14種ERBB1、ERBB2與MUCl腫瘤抗原可通過化學方法或基因工程方法合成而得，每種合成的腫瘤抗原以適量的ニ甲基亞碸(DMSO)溶解，並將最終濃度分別調整為20mg/mL至40mg/mL。之後將14種腫瘤抗原的混合液分為野生型和突變型兩組，每組7種。將每組(野生型組或突變型組)7種ERBB1、ERBB2與MUCl腫瘤抗原混合液以等體積的比例混合在一起後成為ー腫瘤疫苗，其中姆種腫瘤抗原的最終濃度調整為2mg/mL至4mg/mL。取出50μ I至200μ I的腫瘤疫苗與樹狀細胞進行混合。其中較佳的實施態樣為ImL的樹狀細胞(每毫升約含I至2百萬個樹狀細胞)加5 μ 1-10 μ I的腫瘤疫苗，並使腫瘤抗原的最終濃度成為20 μ g/mL至40 μ g/mL,而得到一包含ERBBl、ERBB2與MUCl的樹狀細胞腫瘤疫苗，請參照圖I。該腫瘤疫苗可以利用體外培養的樹狀細胞攜帯方式或用皮下多點注射方式施打於人體，而攜帶ERBBl、ERBB2與MUCl腫瘤抗原的樹狀細胞可以活化輔助T細胞，引發其針對ERBBl、ERBB2與MUCl的免疫反應，包括分泌特異性的抗ERBBl、ERBB2與MUCl腫瘤抗原的抗體。因此該腫瘤疫苗可以用於治療大多數的實體腫瘤，並且可以引發免疫作用的記憶性，以防止癌症的復發，例如預防經過初步治療(如外科手術切除與放射性治療)後的腫瘤復發。2.樹狀細胞體外培養2. I.樹狀細胞的製備所有操作均嚴格遵守標準操作規程(SOP)的程序。採集患者外周血100毫升(含2-3X108 個單個核細胞)，肝素抗凝血。經 Ficoll-Paque (GE Health care Life Sciences)分離單個核細胞，製備自體血漿，離心洗滌兩次，用無血清RPMI164 0重懸 ，調整細胞濃度為2-4X 106/ml,鋪入6孔板,置於37°C>5% CO2培養箱中，孵育兩小時後，輕晃6孔板,收集懸浮細胞至另ー個50ml離心管，用無血清RPMI1640培養液洗板1_2次，加入含1%自體血漿的AIM-V培養液繼續培養；第三天補加樹狀細胞培養液2-3ml/孔(Claison，Shanghai,China);第五天加入腫瘤特異性抗原(終濃度為O. 02-0. 04mg/ml)，誘導後12-16小時，カロ入樹狀細胞成熟因子(Claison, Shanghai, China);第8天收集細胞,離心,生理鹽水洗漆3次，用含有10%患者自體血漿的生理鹽水重懸，總體積為100ml。2. 2.細胞學分析分別在細胞採集當天及注射後第一周和第四周採集患者外周血10ml，分別用⑶3，HLA ニ類抗原和⑶4單克隆抗體進行螢光雙標記(FITC和PE或APC)，分析檢測T細胞亞群的百分比值(％ )。如果DR+⑶3+和⑶4+⑶3+T細胞百分比值隨時間上升，表明T細胞已被腫瘤抗原啟動。此時可輸入自然殺手細胞(Natural killer cell, NK cells) 02. 3.抗體分析分別在細胞採集當天及注射結束第1、3、6、12和24個月採集患者外周血5ml，離心分離血眾或血清。採用酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血中抗ERBB1、ERBB2與MUCl腫瘤抗原的抗體水平。根據抗體水平決定是否需要再次注射疫苗。3.皮下多點注射3. I.疫苗注射劑量與使用方式該腫瘤疫苗可以利用皮下多點注射的方式使用。每次治療需要注射700-1400微克(μg/次)腫瘤抗原混合液(每種抗原量為100-200微克)，注射前應與loo微克佐劑如顆粒-巨卩遼細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)混合。每個月注射一次，共連續注射4-6個月。以後根據血中抗ERBB1、ERBB2與MUCl腫瘤抗原的抗體水平決定是否需要再次注射疫苗。3. 2.抗體水平分析分別在首次注射和毎次再注射時及治療結束後每隔6個月採集患者外周血5ml，離心分離血眾或血清。採用酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血中抗ERBB1、ERBB2與MUCl腫瘤抗原的抗體水平。根據抗體水平決定是否需
要再次注射疫苗。
以上所述，僅為本發明的具體實施方式
，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何 熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。
權利要求
1.ー種腫瘤疫苗，其包括至少ー腫瘤抗原，其中，該腫瘤抗原的序列選自SEQ NO. I至SEQ NO. 14的群組，其中各抗原序列以道爾頓為單位的分子量分別為SEQ NO. I :3693 ；SEQNO. 2 :4121 ；SEQ NO. 3 :3729 ；SEQ NO. 4 :3842 ；SEQ NO. 5 :4003 ；SEQ NO. 6 :3818 ；SEQ NO. 7 3901 ；SEQ NO. 8 :3954 ；SEQ NO. 9 :3885 ；SEQ NO. 10 :4010 ；SEQ NO. 11 :3927 ；SEQ NO. 12 3866 ；SEQ NO. 13 :3641 ；SEQ NO. 14 :3629。
2.根據權利要求I所述的腫瘤疫苗,其中，該腫瘤抗原序列由至少30個胺基酸組合而成。
3.根據權利要求I所述的腫瘤疫苗，其中，該腫瘤抗原以化學法或基因工程法合成。
4.根據權利要求I所述的腫瘤疫苗，其中，該腫瘤抗原具有專ー性的一表皮生長因數 受體與一上皮黏蛋白的抗原決定子，且是人類白血球組織ニ類抗原分子的限制性抗原。
5.一種腫瘤疫苗的合成方法，其包含以下步驟 (a)根據一人類白血球組織抗原DR、DQ和DP各亞型分子在華人群體中的分布，選擇ー表皮生長因子受體I、一表皮生長因子受體2以及ー上皮黏蛋白I的胺基酸序列上可被這些人類白血球組織ニ類抗原分子所識別的抗原決定子； (b)以生物信息學方法分析抗原決定子與各人類白血球組織ニ類抗原分子之間的親和力，並挑選出合適的腫瘤抗原胺基酸序列； (c)根據步驟(b)的結果設計出14種包含至少30個胺基酸的ー腫瘤抗原序列； (d)以化學法或基因工程法合成這些腫瘤抗原； (e)將這些合成的14種腫瘤抗原分別與ニ甲基亞碸混合，使每ー種腫瘤抗原混合液的最終濃度為20mg/mL至40mg/mL，並將這些腫瘤抗原混合液分為野生型和突變型兩組，每組包括7種腫瘤抗原混合液； (f)將同一組中的腫瘤抗原混合液分別取出相同體積，並充分混合在一起，而得到一包含7種野生型或突變型腫瘤抗原的腫瘤疫苗，並使其中每種腫瘤抗原的最終濃度為2mg/mL全 4mg/mL。
6.根據權利要求5所述的腫瘤疫苗的合成方法，其中，這些腫瘤抗原的抗原決定子能被人類白血球組織ニ類抗原中分子所識別。
全文摘要
本發明關於一種腫瘤疫苗及其合成方法，其以表皮生長因子受體1(ERBB1)、表皮生長因子受體2(ERBB2)、以及上皮黏蛋白1(MUC1)作為候選基因，再利用生物信息學的運算方式，設計出可以不受限於免疫系統耐受性、能夠針對多種不同類型的腫瘤進行毒殺攻擊、並且可以防止癌症復發的一種腫瘤疫苗。
文檔編號A61K39/00GK102716472SQ20111007987
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者李光輝 申請人:李光輝