用於生物組織的流態化加載或取出低溫保護劑的裝置的製作方法

2023-12-09 02:15:26 1

本發明涉及低溫保存技術領域，具體涉及一種用於生物組織的流態化加載或取出低溫保護劑的裝置。

背景技術：

低溫保存是指將活的生物樣品採用特殊的方法冷卻至低溫，一般為-196℃並長期保存；待需要時，將生物樣品按特殊的方法加熱至正常溫度，仍可獲得活的生物樣品。低溫保存生物樣品時，除了極簡單的微生物、病毒和細菌等外，一般而言添加低溫保護劑是必需的。

低溫保護劑雖能在低溫下對生物樣品起保護作用，但要想這種保護起作用，必須將足夠多的低溫保護劑載入到生物樣品內。然而，低溫保護劑對生物樣品來說是外來物質，對其有一定的毒性。這種毒性與低溫保護劑的種類、濃度、處理溫度和時間等因素密切相關，濃度越大、處理溫度越高、處理時間越長，則毒性損傷越嚴重。假設需載入生物樣品的低溫保護劑的濃度確定，那麼顯然加載溫度越低、加載時間越短，對低溫保存越有利。不像懸浮細胞等生物樣品，低溫保護劑自然滲透生物組織往往需要較長的時間，導致加載低溫保護劑時，生物組織更易遭受毒性損傷，這也是目前低溫保存生物組織的難點所在。降低加載溫度雖然可以減小毒性損傷，但同時也使得低溫保護劑滲透生物組織的速率減慢，這意味著載入相同量的低溫保護劑需要更長的時間，而加載時間加長又會增加遭受毒性損傷的風險。另外，當低溫保護劑溶液的濃度確定時，最低加載溫度一般認為是其平衡凍結點溫度，若再繼續降低則會發生凍結，這意味著在現有技術條件下，通過降低加載溫度來減小毒性損傷是有限的。將低溫保護劑從生物組織中取出時也存在同樣的問題。

因此，若能使最低極限處理溫度降至平衡凍結點溫度以下，即增強過冷，同時又能加快低溫保護劑滲透生物組織的速率，則能大大降低生物組織所遭受的毒性損傷，即能使低溫保存生物組織的成功率大大提高，而目前尚沒有可實現此種功能的自動化裝置。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：提供一種能夠在降低極限處理溫度的同時加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率的自動化裝置。

本發明的技術解決方案是：一種用於生物組織的流態化加載或取出低溫保護劑的裝置，其特徵在於：它包括溶液循環模塊、溶液供給模塊、樣品容器、溫控箱和控制器，所述樣品容器設置在溫控箱內，所述樣品容器設有進液口和出液口，所述溶液循環模塊與樣品容器的進液口和出液口相連通以使溶液循環流經樣品容器，所述溶液供給模塊與溶液循環模塊相連通以向溶液循環模塊供給溶液，所述控制器分別與溶液供給模塊、溶液循環模塊和溫控箱電連接。

採用上述結構後，本發明具有以下優點：

本發明低溫保護劑溶液通過溶液循環模塊變成一種持續循環流動的液體，這種流動性使得低溫保護劑溶液在溫度降低到平衡凍結點溫度以下也不會凝固，即出現了過冷現象，從而可以降低極限處理溫度；而同時這種流動性又可以加快低溫保護劑溶液滲透生物組織的速率，從而使得本裝置在降低極限處理溫度的同時能加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率，彌補了這一領域的空白；除此之外，由於溶液供給模塊、溶液循環模塊和溫控箱均由控制器控制，使得整個裝置實現了自動化。

作為優選，還包括氣體供給模塊，所述樣品容器還設有進氣口和出氣口，所述氣體供給模塊與樣品容器的進氣口相連通，以使進入樣品容器內的氣體對樣品容器內的溶液產生擾動並從出氣口處排出，所述氣體供給模塊與控制器電連接。該設置通過氣體供給模塊使樣品容器內的溶液產生擾動，並因為溶液的流動性，使得擾動程度增強，可進一步降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述樣品容器包括氣體流動腔以及設置在氣體流動腔內的樣品腔，所述進液口和出液口設置在樣品腔上，所述進氣口和出氣口設置在氣體流動腔上，所述溶液循環模塊與樣品腔的進液口和出液口相連通，所述氣體供給模塊與氣體流動腔的進氣口相連通，所述樣品腔上還設有若干透氣不透水的透氣孔，以使進氣口處進入的氣體能穿過樣品腔並從出氣口處排出。該設置將液體通道和氣體通道獨立開來，液體通道內的溶液不會進入到氣體通道內，但氣體通道內的氣體會進入液體通道內來增強溶液的擾動，整體結構簡單，工作可靠。

作為優選，所述樣品腔橫向貫穿設置在氣體流動腔內，以將氣體流動腔分隔為上半腔室和下半腔室，所述進液口和出液口分別設置在樣品腔的兩端，所述進氣口設置在氣體流動腔的下半腔室上，所述出氣口設置在氣體流動腔的上半腔室上，所述透氣孔設置在樣品腔的側壁上。該設置使溶液沿樣品腔橫向流過，而氣體由下而上穿過樣品腔，使得擾動作用較強，從而可以較大程度降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述進氣口和出氣口所在的第一直線L1垂直於進液口和出液口所在的第二直線L2。該設置使液體通道和氣體通道相互垂直，可最大程度增強溶液的擾動，從而可最大程度降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述樣品腔內沿橫向方向均勻間隔設置若干隔板。該設置可將多個生物組織樣品分開放置而不發生重疊，從而可以提高低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述溶液循環模塊包括單向閥、混勻容器、第一蠕動泵、第一換熱器和排液閥，所述單向閥、混勻容器、第一蠕動泵、第一換熱器沿溶液流動方向依序連接，所述第一換熱器位於溫控箱內，所述排液閥的進液口分別與樣品容器的出液口和單向閥的進液口相連通；所述溶液循環模塊與樣品容器的進液口和出液口相連通是指溶液循環模塊的第一換熱器的出液口、單向閥的進液口分別與樣品容器的進液口、出液口相連通；所述控制器與溶液循環模塊電連接是指控制器與第一蠕動泵電連接。該設置可以控制低溫保護劑溶液以一定的流速循環流經樣品容器，有利於提高低溫保護劑載入和取出生物組織的速率以及降低低溫保護劑溶液的極限處理溫度；同時，溶液可以循環使用以節省試劑，混勻容器兼具調節循環系統容積、保持循環系統內壓力以及利於排出循環系統內溶液的功能。

作為優選，所述溶液供給模塊包括第一儲液罐、第二儲液罐、第二蠕動泵、第三蠕動泵、電導電極和鉑電阻溫度傳感器，所述第一儲液罐與第二蠕動泵的進液口相連通，所述第二儲液罐與第三蠕動泵的進液口相連通，所述電導電極和鉑電阻溫度傳感器位於混勻容器內；所述溶液供給模塊與溶液循環模塊相連通是指第二蠕動泵的出液口與第三蠕動泵的出液口連通後分別與單向閥的出液口、混勻容器的進液口相連通；所述控制器與溶液供給模塊電連接是指控制器分別與第二蠕動泵、第三蠕動泵、電導電極和鉑電阻溫度傳感器電連接。該設置有利於向溶液循環模塊精準供給所要求濃度的低溫保護劑溶液。

作為優選，所述氣體供給模塊包括氣體發生器、第二換熱器，氣體發生器與第二換熱器相連，所述第二換熱器位於溫控箱內；所述氣體供給模塊與樣品容器的進氣口相連通是指第二換熱器的出氣口與樣品容器的進氣口相連通；所述控制器與氣體供給模塊電連接是指控制器與氣體發生器電連接。該設置結構簡單、操作方便，更有利於本發明的實施及推廣。

作為優選，所述氣體供給模塊中的氣體為氮氣。氮氣便宜且使用安全。

附圖說明：

圖1為本發明用於生物組織的流態化加載或取出低溫保護劑的裝置的結構示意圖；

圖2為本發明樣品容器的結構示意圖；

圖中：1-第一儲液罐，2-第二儲液罐，3-第二蠕動泵，4-第三蠕動泵，5-混勻容器，6-電導電極，7-第一蠕動泵，8-第一換熱器，9-樣品容器，9.1-樣品腔，9.2-隔板，9.3-氣體流動腔，9.4-進液口，9.5-出液口，9.6-進氣口，9.7-出氣口，10-排液閥，11-單向閥，12-氣體發生器，13-第二換熱器，14-溫控箱，15-控制器，16-鉑電阻溫度傳感器，17-上半腔室，18-下半腔室，19-透氣孔，L1-第一直線，L2-第二直線。

具體實施方式

下面結合附圖，並結合實施例對本發明做進一步的說明。

實施例：

如圖1、圖2所示，一種用於生物組織的流態化加載或取出低溫保護劑的裝置，其特徵在於：它包括溶液循環模塊、溶液供給模塊、樣品容器9、溫控箱14和控制器15，所述樣品容器9設置在溫控箱14內，所述樣品容器9設有進液口9.4和出液口9.5，所述溶液循環模塊與樣品容器9的進液口9.4和出液口9.5相連通以使溶液循環流經樣品容器9，所述溶液供給模塊與溶液循環模塊相連通以向溶液循環模塊供給溶液，所述控制器15分別與溶液供給模塊、溶液循環模塊和溫控箱14電連接。

本發明低溫保護劑溶液通過溶液循環模塊變成一種持續循環流動的液體，這種流動性使得低溫保護劑溶液在溫度降低到平衡凍結點溫度以下也不會凝固，即出現了過冷現象，從而可以降低極限處理溫度；而同時這種流動性又可以加快低溫保護劑溶液滲透生物組織的速率，從而使得本裝置在降低極限處理溫度的同時能加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率，彌補了這一領域的空白；除此之外，由於溶液供給模塊、溶液循環模塊和溫控箱14均由控制器15控制，使得整個裝置實現了自動化。

作為優選，還包括氣體供給模塊，所述樣品容器9還設有進氣口9.6和出氣口9.7，所述氣體供給模塊與樣品容器9的進氣口9.6相連通，以使進入樣品容器9內的氣體對樣品容器內的溶液產生擾動並從出氣口9.7處排出，所述氣體供給模塊與控制器15電連接。該設置通過氣體供給模塊使樣品容器內的溶液產生擾動，並因為溶液的流動性，使得擾動程度增強，可進一步降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述樣品容器9包括氣體流動腔9.3以及設置在氣體流動腔9.3內的樣品腔9.1，所述進液口9.4和出液口9.5設置在樣品腔9.1上，所述進氣口9.6和出氣口9.7設置在氣體流動腔9.3上，所述溶液循環模塊與樣品腔9.1的進液口9.4和出液口9.5相連通，所述氣體供給模塊與氣體流動腔9.3的進氣口9.6相連通，所述樣品腔9.1上還設有若干透氣不透水的透氣孔19，以使進氣口9.6處進入的氣體能穿過樣品腔9.1並從出氣口9.7處排出。該設置將液體通道和氣體通道獨立開來，液體通道內的溶液不會進入到氣體通道內，但氣體通道內的氣體會進入液體通道內來增強溶液的擾動，整體結構簡單，工作可靠。

作為優選，所述樣品腔9.1橫向貫穿設置在氣體流動腔9.3內，以將氣體流動腔9.3分隔為上半腔室17和下半腔室18，所述進液口9.4和出液口9.5分別設置在樣品腔9.1的兩端，所述進氣口9.6設置在氣體流動腔9.3的下半腔室18上，所述出氣口9.7設置在氣體流動腔9.3的上半腔室17上，所述透氣孔19設置在樣品腔9.1的側壁上。該設置使溶液沿樣品腔9.1橫向流過，而氣體由下而上穿過樣品腔9.1，使得擾動作用較強，從而可以較大程度降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述進氣口9.6和出氣口9.7所在的第一直線L1垂直於進液口9.4和出液口9.5所在的第二直線L2。該設置使液體通道和氣體通道相互垂直，可最大程度增強溶液的擾動，從而可最大程度降低極限處理溫度，並加快低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述樣品腔9.1內沿橫向方向均勻間隔設置若干隔板9.2，為清楚顯示樣品腔9.1和隔板9.2的結構，氮氣流動腔9.3在圖2中只給出一半，樣品腔9.1也被切除一部分。該設置可將多個生物組織樣品分開放置而不發生重疊，從而可以提高低溫保護劑載入和取出生物組織的速率。

作為優選，所述溶液循環模塊包括單向閥11、混勻容器5、第一蠕動泵7、第一換熱器8和排液閥10，所述單向閥11、混勻容器5、第一蠕動泵7、第一換熱器8沿溶液流動方向依序連接，所述第一換熱器8位於溫控箱14內，所述排液閥10的進液口分別與樣品容器9的出液口9.5和單向閥11的進液口相連通；所述溶液循環模塊與樣品容器9的進液口9.4和出液口9.5相連通是指溶液循環模塊的第一換熱器8的出液口、單向閥11的進液口分別與樣品容器9的進液口9.4、出液口9.5相連通；所述控制器15與溶液循環模塊電連接是指控制器15與第一蠕動泵7電連接。該設置可以控制低溫保護劑溶液以一定的流速循環流經樣品容器9，有利於提高低溫保護劑載入和取出生物組織的速率以及降低低溫保護劑溶液的極限處理溫度；同時，溶液可以循環使用以節省試劑，混勻容器5兼具調節循環系統容積、保持循環系統內壓力以及利於排出循環系統內溶液的功能。

作為優選，所述溶液供給模塊包括第一儲液罐1、第二儲液罐2、第二蠕動泵3、第三蠕動泵4、電導電極6和鉑電阻溫度傳感器16，所述第一儲液罐1與第二蠕動泵3的進液口相連通，所述第二儲液罐2與第三蠕動泵4的進液口相連通，所述電導電極6和鉑電阻溫度傳感器16位於混勻容器5內；所述溶液供給模塊與溶液循環模塊相連通是指第二蠕動泵3的出液口與第三蠕動泵4的出液口連通後分別與單向閥11的出液口、混勻容器5的進液口相連通；所述控制器15與溶液供給模塊電連接是指控制器15分別與第二蠕動泵3、第三蠕動泵4、電導電極6和鉑電阻溫度傳感器16電連接。該設置有利於向溶液循環模塊精準供給所要求濃度的低溫保護劑溶液。

作為優選，所述氣體供給模塊包括氣體發生器12、第二換熱器13，氣體發生器12與第二換熱器13相連，所述第二換熱器13位於溫控箱14內；所述氣體供給模塊與樣品容器9的進氣口9.6相連通是指第二換熱器13的出氣口與樣品容器9的進氣口9.6相連通；所述控制器15與氣體供給模塊電連接是指控制器15與氣體發生器12電連接。該設置結構簡單、操作方便，更有利於本發明的實施及推廣。

作為優選，所述氣體供給模塊中的氣體為氮氣。氮氣便宜且使用安全。

上述第一換熱器8和第二換熱器13由一段較長的管路彎折製得，也可以加裝翅片等利於換熱的結構，凡是能夠實現流體流過並進行熱交換的結構均適用於第一換熱器8和第二換熱器13所表示的結構；上述溫控箱14為現有技術典型的溫控裝置，可以為機械製冷或液氮製冷結合電加熱裝置、溫度傳感器實現，為示圖簡介清楚，所有部件均由圖中方框表示；所述混勻容器5應用的是典型的現有技術，即電磁攪拌，為示圖簡介清楚，攪拌子和電磁攪拌器未給出。圖中實心箭頭表示溶液流動方向，空心箭頭表示氮氣流動方向。

本發明主要由四部分組成：溶液濃度控制、溫度控制、溶液流速控制和氮氣流速控制。溶液濃度控制部分的作用是使循環流經樣品容器9的低溫保護劑溶液的濃度按照設定的程序變化，包括第一儲液罐1、第二儲液罐2、第二蠕動泵3、第三蠕動泵4、電導電極6、鉑電阻溫度傳感器16和控制器15。所述溫度控制部分的作用是使流經樣品容器9的低溫保護劑溶液和氮氣的溫度均按照設定的程序變化，包括溫控箱14、第一換熱器8、第二換熱器13和控制器15。所述溶液流速控制部分的作用是使循環流經樣品容器9的低溫保護劑溶液的流速保持在某一個定值或按照設定的程序變化，包括第一蠕動泵7和控制器15。所述氮氣流速控制部分的作用是使流經樣品容器9的氮氣的流速保持在某一個定值或按照設定的程序變化，包括氮氣發生器12和控制器15。

對生物組織樣品進行流態化加載或取出低溫保護劑處理之前，首先要建立採用的低溫保護劑溶液的電導率與濃度和溫度之間的關係模型，並輸入到控制器15中。對於二甲亞碸/氯化鈉/水、甘油/氯化鈉/水、乙二醇/氯化鈉/水、丙二醇/氯化鈉/水、海藻糖/氯化鈉/水這五種低溫保護劑溶液，氯化鈉的濃度為定值0.9％wt，電導率與濃度和溫度之間的關係模型如下：

<![CDATA[ κ = κ 0 exp ( - E a R T ) ( C 0 + C 1 x + C 2 x 2 ) ]]>

式中，κ為電導率，單位：mS/cm，T為溫度，單位：K，x為低溫保護劑的質量分數，R為摩爾氣體常數，其值為8.314J/(mol·K)，κ0、Ea、C0、C1和C2為模型係數，其值如下表所示：

本發明以向關節軟骨組織中加載二甲亞碸為例，加載過程如下：

打開內置在控制器15內的程序，輸入二甲亞碸/氯化鈉/水溶液的電導率與濃度和溫度之間的關係模型，並設定好濃度、溫度和流速變化程序；將0.9％wt的氯化鈉溶液和高濃度二甲亞碸/氯化鈉/水溶液分別裝入到第一儲液罐1和第二儲液罐2中；將1個或多個大小合適的關節軟骨組織置於樣品腔9.1內隔板9.2之間；開啟第一蠕動泵7、第二蠕動泵3、第三蠕動泵4、氮氣發生器12和溫控箱14。

所述溶液循環模塊中二甲亞碸溶液的濃度是通過改變第二蠕動泵3和第三蠕動泵4的轉速來控制。所述氯化鈉溶液和二甲亞碸在混勻容器5裡充分混勻，電導電極6檢測溶液的電導率，鉑電阻溫度傳感器16檢測溶液的溫度，兩者分別把信號傳送給控制器15轉化為濃度數值，並與預設濃度進行比較，控制器15根據處理結果輸出信號到第一蠕動泵7和第二蠕動泵3，控制兩者的轉速。

所述溫控箱14內溫度按照設定的程序變化，溶液循環模塊中的溶液通過第一換熱器8被冷卻後進入樣品腔9.1內，所述氮氣供給模塊中的氮氣通過第二換熱器13被冷卻，流經樣品腔9.1以對樣品腔9.1內的溶液產生擾動，最後從出氣口9.7處排出。

所述溶液循環模塊中溶液的流速通過改變第一蠕動泵7的轉速來控制，所述第一蠕動泵7的轉速保持一定值或按照設定的程序變化；所述氮氣供給模塊中氮氣的流速保持一定值或按照設定的程序變化。

加載過程結束後，關閉第二蠕動泵3、第三蠕動泵4、氮氣發生器12和溫控箱14，打開排液閥10，待溶液循環模塊中的溶液排淨後關閉第一蠕動泵7和排液閥10，取出關節軟骨組織以進行後續處理；最後將蒸餾水裝入第一儲液罐1，打開第二蠕動泵3，將一定量的蒸餾水輸送入溶液循環模塊，打開第一蠕動泵7，用蒸餾水衝洗溶液循環模塊，然後打開排液閥10將衝洗液排淨，此時裝置已被清洗乾淨，可以進行下一次加載。

以上為本裝置低溫保護劑溶液的加載過程，而取出過程與加載過程類似，這裡不再贅述，不同之處在於：加載過程中溶液循環模塊中溶液的濃度是逐漸升高的，且溫控箱14內的溫度是逐漸下降的，而取出過程中溶液循環模塊中溶液的濃度是逐漸降低的，且溫控箱14內的溫度是逐漸上升的。