檢測豬瘟病毒野毒的膠體金免疫層析試紙條的製作方法
2023-12-09 03:30:41
專利名稱：檢測豬瘟病毒野毒的膠體金免疫層析試紙條的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑別豬瘟病毒的試紙條，尤其涉及一種鑑別豬瘟病毒野毒的膠體
金免疫層析試紙條，屬於豬瘟病毒的診斷和鑑別領域。
背景技術：
豬瘟(classical swine fever， CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起豬的一種急性、發熱性、接觸性傳染病。世界動物衛生組織(0IE)將該 病列入須申報動物傳染病名錄。我國採用免疫豬瘟兔化弱毒疫苗(hog choleralapinized vaccine, HCLV)很好地預防和控制了豬瘟在我國的大規模流行，但近年來豬瘟又有巻土重 來、死灰復燃的跡象，且其流行和發病特點又發生了許多新變化，目前仍是危害我國養豬業 的主要傳染病之一 (王琴.豬瘟病毒流行病學、病原致病特性及豬瘟綜合防制研究.中國 農業科技導報，2006，8(5) :13-18.)。在發病初期進行快速、靈敏、準確的病原學診斷，是控 制豬瘟流行的重要環節，它可以使基層獸醫在疫情爆發時在現地確診，及早採取措施控制 疾病的流行。 膠體金免疫層析技術是20世紀90年代發展起來的 一 種新型體外診 斷 技 術 (Tanaka R， Yuhi T， Nagatani N， et al. A novel enhancement assay forimmunochromatogr即hic test strips using gold nanoparticles. Anal Bioanal Chem， 2006， 385 (8) : 1414-1420.)。該診斷方法快速簡便，操作簡單，無需儀器，結果準確。其 基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細層析作用，使抗原抗體在固相膜上反應，然後 用膠體金標記的抗體顯色，陽性反應在膜上呈現紅色，陰性反應則不出現紅色。已經報導的 豬瘟膠體金診斷技術，主要基於豬瘟病毒抗體定量檢測和病原定性檢測，對豬感染CSFV野 毒或接種免疫弱毒疫苗不能進行鑑別診斷。根據CSFV野毒和弱毒核酸序列差異建立的套 式PCR技術和螢光定量PCR技術，能區分CSFV野毒和弱毒，主要用於進行實驗室診斷，不適 合現地檢測。 中國採用免疫豬瘟兔化弱毒疫苗很好地控制了豬瘟在我國的大規模的流行，但是 由於缺乏利用血清學標誌和配套的鑑別診斷方法，使得通過抗體檢測很難區分免疫弱毒和 野毒感染，這非常不利於豬瘟的淨化(仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗——半 個世紀的回顧.中國農業科學，2005，38(8) :1675-1685.)。因此，通過抗原檢測對豬免疫弱 毒和感染野毒進行鑑別診斷的檢測方法就勢在必行。
發明內容
本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能夠準確、靈
敏的鑑別診斷CSFV野毒的膠體金免疫層析試紙條。 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 —種檢測CSFV野毒的膠體金免疫層析試紙條，由吸水紙1、硝酸纖維素膜2、膠體 金墊3、樣品墊4和支持物5組成；所述的硝酸纖維素膜2含有一條由抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體HQ06包被而成的檢測線和由兔抗鼠IgG抗體包被而成的質控線；所述的膠體 金墊3結合由膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10 ;其中，吸水紙1、硝酸纖 維膜2和膠體金墊3按照以下次序相連接並附著在支持物5上膠體金墊3與靠近硝酸纖 維膜2檢測線的一端相連接，吸水紙1與靠近硝酸纖維膜2質控線的一端相連接；樣品墊4 的一端附著在膠體金墊上，膠體金墊的另一端與硝酸纖維素膜2相銜接。
其中，所述的支持物只要具有一定的硬度，將樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜 和吸水墊負載於其上，達到支持和負載的目的即可，可以選用各種材料作為本發明的支持 物，例如塑料板(優選為PVC)、硬紙板、鋁板等。 所述的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體HQ06可按照文獻所公開的方法製備得 至lj (Peng WP， Hou Q， Xia ZH， et al. Identification of a conserved linear B-cell epitope atthe N_terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage-displayedrandom peptide library. Virus Res，2008，135(2) :267-272.);
所述的兔抗鼠IgG抗體可按照文獻所公開的方法製備得到(Zhang GP， WangXN， Yang， JF， et al. Development of an imm皿ochromatographic lateral flow test strip fordetection of P —adrenergic agonist Clenbuterol residues. J Immunol Methods, 2006,312(1-2) :27-33.); 所述的膠體金墊可參考以下方法製備得到 (1)製備膠體金顆粒取0.01%的氯金酸100mL，攪拌狀態加熱至9(TC，加入 1.8mLl^檸檬酸三納溶液，檸檬酸三鈉與氯金酸溶液充分混勻後，降低攪拌器的轉速，繼續 加熱維持整個反應體系溫度在95t:左右；當溶液顏色由淺黃色變成酒紅色時，停止加熱， 冷卻至室溫；用0. lmol/L的K2C03將膠體金溶液pH值調至8. 2，用0. 22 y m濾膜過濾後裝 入潔淨的玻璃瓶中，4t:避光保存； (2)製備膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10溶液將6E10單 抗與膠體金溶液用磁力攪拌器混合；加入5%的BSA溶液至終濃度為1 % ，離心20min棄沉 澱；10， 000r/min離心60min，棄上清；沉澱物用0. 02mol/L硼酸鹽緩衝液稀釋至原體積的 1/10，4t:保存備用；其中，6E10單抗與膠體金溶液的標記量為18. 75ii g/mL ;
(3)取玻璃纖維紙，將其浸入步驟(2)所製備的膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白 的單克隆抗體6E10溶液中lh，室溫乾燥，即得。 所述的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10可參考文獻所公開的方法製備得到 (彭伍平.利用噬菌體展示技術鑑定豬瘟病毒E2蛋白抗原表位.北京中國農業科學院， 2007)。 在膠體金免疫層析試紙條研製過程中，製備出高質量的膠體金是實驗成功的關 鍵。高質量的膠體金顆粒要求顆粒外形均一、尺寸變異係數小、且可以在硝酸纖維素膜上自 由流動。本發明在製備膠體金顆粒過程中與以往報導的方法有所改進在使用磁力加熱攪 拌器過程中，採用了降低反應溫度，使整個反應體系溫度控制在95t:左右，當檸檬酸三鈉與 氯金酸溶液混勻後，迅速降低了磁力攪拌器轉子的轉速。通過以上的改進可以最大程度的 降低膠體金顆粒之間的聚集，且可以得到大小均一的顆粒。在製備的膠體金過程中，膠體金 顆粒的大小與還原劑的加入量有關，本實驗經過條件優化，確定100mL 0.01%的氯金酸溶 液中加入最佳檸檬酸三鈉的量為1. 8mL，製備出直徑為25nm的金顆粒，這一尺寸的顆粒大
4小適中，易於辨識，又不影響蛋白質與金顆粒表面的結合，可以使標記的蛋白獲得最佳的性 能。 所述硝酸纖維素膜(該硝酸纖維素膜也可由尼龍膜來替換)上的檢測線和對照線 之間的間隔優選為4-6mm，更優選為5mm。
—種製備上述試紙條的方法，包括 (1)將抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10和兔抗鼠IgG抗體間隔4_6mm噴在 硝酸纖維膜上，分別作為檢測線和質控線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其餘蛋白結合位點， 洗滌，乾燥，備用； (2)將硝酸纖維膜、膠體金墊、樣品墊、吸水紙按照以下次序粘在支持物上將膠 體金墊連接在靠近硝酸纖維膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上，樣品墊附著在 膠體金墊的另一端上；吸水紙連接在硝酸纖維素膜的另一端，與硝酸纖維素膜的質控線相 接近； (3)將粘好的支持物材料切成3mm寬的試紙條，即得。
本發明試紙條的檢測方法
(1)待檢樣品的處理 將豬瘟病毒接種到對數生長期的PK15細胞，72h後棄去細胞培養液，刮下感染細 胞，加入1/2原培養液體積的含1% NP-40的0. Olmol/L PBS緩衝液(pH7. 2)，室溫下渦旋 震蕩，放置lh，其間不時用渦旋器混合。然後2500r/min 4t:離心10min，取上清做被檢抗 原。取不接毒的PK15細胞按照上述方法處理作為陰性對照。
(2)樣品檢測 取100 ii L處理好的樣品滴入樣品墊，10 15min內觀察實驗結果。
(3)結果判定如圖2所示。 陽性檢測線和質控線均出現清晰紅色條帶。樣品中豬瘟病毒含量越高，檢測線紅 色顏色越深。
陰性只有質控線出現紅色條帶。
無效質控線不出現紅色條帶。 CSFV E2囊膜糖蛋白在不同毒株間高度保守(Weiland E， Stark R， Haas B， et al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of disulfide_linked heterodimet. J Virol，1990，64(3) :3563-3569 ;Meyers G， Rumenapf T， Thiel H. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology, 1989， 171 (2) :555-567.)，本試驗通過利用抗CSFV E2蛋白的單 抗建立的膠體金免疫層析檢測方法可以直接用於檢測細胞樣品中的CSFV抗原。對抗原的 特異性識別主要藉助單抗的高度特異性。試驗所使用的抗CSFV E2蛋白單抗經過間接免疫 螢光實驗證明可以和CSFV全病毒發生反應。其中6E10單抗能和本發明人所分離各種基因 型的豬瘟病毒野毒發生反應，但與HCLV不發生反應。用膠體金標記6E10單抗作為捕捉抗 體，能夠實現對CSFV野毒鑑別診斷的目的，提高了檢測的特異性。 由於CSFV在細胞培養物中其滴度不是太高，且由於膠體金檢測試紙條敏感性的 限制，因此對檢測樣品的處理也是實驗成功的關鍵因素之一。在PK15細胞接毒後72h收毒， 通過將細胞反覆凍融作為檢測樣品並沒有達到預期的實驗目的。按照參考文獻(ShannonAD， Morrissy C， Mackintosh SG， et al. Detection of hogcholera virus antigens in experimentally—infected pigs using an antigen—c鄰ture EUSA. Vet Microbiol, 1993,34(3) :233-248.)收集培養的細胞，採用NP-40渦旋的方法，破壞了細胞膜，使病毒粒 子充分地從細胞中釋放出來，這樣利於單抗對抗原的捕捉，取得了預期的實驗結果。通過對 不同基因亞型CSFV細胞培養物的檢測，證明該方法敏感性、特異性和重複性都較好。
在試紙條組裝過程中，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水紙之間的位置要恰 當，各層之間的銜接處要壓緊壓實。由於試紙條的組件大部分是由親水性物質組成的，特別 是硝酸纖維素膜，這就要求試紙條在組裝前要充分乾燥。若試紙條保存環境中有水分存在， 容易使硝酸纖維素膜上的抗體發生水解、解離或疏水摺疊，導致抗體的生物活性降低而影 響檢測結果的正確性。 試驗結果表明，本發明所製備的試紙條用於檢測豬瘟病毒野毒感染的PK15細胞 培養物，在檢測線和質控線處均出現紅色條帶，未感染病毒的細胞培養物僅在質控線出現 紅色條帶；試紙條檢出病毒培養物的最低限為103 5TCID5。；用不同批次的試紙條重複檢測， 結果無差異；本發明試紙條不與豬瘟兔化弱毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸症候群病 毒、傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬圓 環病毒2型反應。所製備的試紙條具有較好的特異性和敏感性，重複性良好。
圖1膠體金免疫層析試紙條結構。
圖2膠體金免疫層析試紙條結果判定；1 :陽性；2 :陰性；3 :無效。
圖3膠體金顆粒透射電鏡照片(X 30， 000)。 圖4膠體金免疫層析試紙條的特異性；分別用膠體金免疫層析試紙條檢測CSFV Shimen株、兔化弱毒(HCLV) 、 BVDV、 PRRSV、 TGEV、 PEDV、 PRV、 PrV、 PPV和PCV-2感染的細胞 培養物。 圖5用膠體金免疫層析試紙條對不同基因型豬瘟病毒的檢測結果。
圖6膠體金免疫層析試紙條的敏感性試驗結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而
更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術
人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式
進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。 實施例1本發明檢測試紙條的製備 1材料與方法 1. 1主要試劑與儀器 氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸三納(Na3C6H507 2H20)、碳酸鉀(K2C03)、牛血清白蛋白 (BSA)和聚乙烯醇購自Sigma公司；硼酸(H3B03)購自Amreso公司；重組蛋白G瓊脂糖親和 層析柱購自Invitrogen公司；小鼠IgG購自Bioszune公司；去離子水購自北京天根公司。 硝酸纖維素膜(NC膜)為深圳伊能公司產品；吸水紙、玻璃纖維、膠板購自上海金標生物科技有限公司；ZX3000噴膜機、CM4000切條機購自美國Bio-Dot公司；豬瘟病毒抗原ELISA檢 測試劑盒購自IDEXX公司。
1. 2病毒株 CSFV石門系強毒株(Shimen)、2種不同基因亞型的CSFV野毒株[1. 1基因亞型 HLJ-1 (06) 、 HLJ-3 (06) 、 HeN_5 (06)和HeN_3 (06) ;2. 1基因亞型:HuNl (06) 、 SH-7 (06)、 SH11-0701和SX-09]、豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-l)BA株、 豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)HuN4株、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)H16株、豬流行性腹 瀉病毒(PEDV)CV777株、豬輪狀病毒(PRV)OSU株、偽狂犬病病毒(PrV) HLJ株、豬細小病毒 (PPV)BQ株、豬圓環病毒2型(PCV2)LG株和4個不同廠家生產的10個批次的豬瘟兔化弱毒 疫苗均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所豬傳染病研究室保存並提供。
1. 3單克隆抗體、兔抗鼠IgG抗體的製備與純化 特異性識別CSFV野毒的單抗6E10 (彭伍平.利用噬菌體展示技術鑑定豬瘟病毒 E2蛋白抗原表位.北京中國農業科學院，2007.)和識別豬瘟病毒一個線性表位的單抗 HQ06由(Peng WP，Hou Q，Xia ZH，et al. Identification of a conserved linearB-cell epitope at the N_terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus byphage-displayed random peptide library. Virus Res， 2008， 135 (2) :267-272.)可分
別按照文獻所公開的方法製備得到。 兔抗鼠IgG抗體製備的免疫程序按照已報導的方法(Zhang GP， Wang XN， Yang， JF， et al. Development of an immunochromatographic lateral flow test strip fordetection of 0—adrenergic agonist Clenbuterol residues. J Immunol Methods, 2006,312(1-2) :27-33.)進行，採用雙向瓊脂擴散試驗(楊漢春.動物免疫學.北京中 國農業大學出版社，2003， 297-298.)測定血清效價，製備的血清用蛋白G親和層析柱純化， SDS-PAGE法鑑定其純度，用Pierce公司BCA法測定蛋白濃度。
1.4膠體金顆粒的製備 採用檸檬酸三納還原法製備膠體金，用磁力加熱攪拌器加熱取0. 01%的氯金酸 100mL，攪拌狀態加熱至90°C ，迅速加入1. 8mL新配製的1 %檸檬酸三納溶液，檸檬酸三鈉與 氯金酸溶液充分混勻後，降低攪拌器的轉速，繼續加熱維持整個反應體系溫度在95t:左右。 當溶液顏色由淺黃色變成酒紅色時，停止加熱，冷卻至室溫。用0. lmol/L的I^C03將膠體金 溶液PH值調至8. 2，用0. 22 i！ m濾膜過濾後裝入潔淨的玻璃瓶中，4。C避光保存。用透射電 子顯微鏡觀察膠體金顆粒的大小與均一度。
1. 5膠體金標記單抗的製備
1. 5. 1單抗與膠體金最佳標記量的選擇 按照參考文獻進行(S皿XL， Zhao XL， Tang J. Pr印aration of gold—labeledantibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin Bl. Int J Food Microbiol, 2005， 99 (2) :185-194.)，最終通過試 驗確定6E10單抗與膠體金溶液的最佳標記量為18. 75 ii g/mL。
1. 5. 2膠體金標記單抗的製備 根據上述實驗結果，取最佳單抗的量與膠體金溶液用磁力攪拌器混合30min。加入 5%的BSA溶液至終濃度為1%。 2， 000r/min離心20min棄沉澱；10， 000r/min離心60min，棄上清。沉澱物用0. 02mol/L硼酸鹽緩衝液(pH 8. 2，含1%的BSA和0. 1%疊氮納)稀釋 至原體積的1/10，4t:保存備用。
1.6膠體金墊的製備 取玻璃纖維紙，將其浸入膠體金標記的單抗溶液中lh，室溫乾燥後4t:保存備用。 1. 7硝酸纖維素膜印膜的製備檢測線(Test line，T線)和質控線(Control line，C線)抗體工作濃度按照參考 文獻(蔣韜，梁仲，陳涓，等.口蹄疫病毒0、A、Asial型定型診斷膠體金免疫層析方法的建 立.中國農業科學，2008，41(11) :3801-3808.)確定，將硝酸纖維素膜放在噴膜儀上，將濃 度為2mg/mL的HQ06單抗放在X-only單向噴膜儀貯存池A，濃度為2mg/mL的兔抗鼠IgG抗 體放在貯存池B，開機後將HQ06單抗和兔抗鼠IgG抗體分別噴於膜中央，形成間距0. 5cm的 檢測線(T線)和質控線(C線)。將NC膜在室溫下乾燥lh，用含有l^聚乙烯醇的20mmo1/ L Tris-HCl(pH7.4)緩衝液室溫封閉30min，封閉後用去離子水漂洗一次，室溫自然乾燥，
4t:保存備用。 1. 8試紙條的組裝 將上述方法製備的膠體金墊、硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水紙和膠板(PVC板)按照
圖1的順序裝配，裁成寬度為3mm的診斷試紙條。 試驗例1本發明檢測試紙條各項性能的評價試驗 1. 1特異性試驗 用試紙條分別檢測CSFV石門株和不同基因型CSFV野毒株、HCLV、 BVDV、 PRRSV、 TGEV、 PEDV、 PRV、 PrV、 PPV和PCV2，根據檢測結果判定其特異性。
1. 2敏感性試驗 將半數細胞培養感染劑量(TCID5。)為105的豬瘟病毒樣品，用PBS進行梯度稀釋， 將試紙條檢測到得豬瘟病毒陽性參考樣品的最高稀釋倍數(最小病毒滴度)定為試紙條的 靈敏度。 1. 3重複性試驗 用不同批次生產的試紙條重複檢測豬瘟病毒陽性和陰性參考樣品，按照上述方法 進行操作和判定。 1. 4與抗原ELISA的符合性試驗 將本研究中所有檢測樣品用IDEXX公司豬瘟病毒抗原ELISA檢測試劑盒進行檢 測，比較膠體金試紙條檢測結果與其的符合性。
1. 5保存期試驗將試紙條保存於4t:，每隔1個月取出檢測陽性、陰性參考樣品。
2試驗結果 2. 1兔抗鼠IgG抗體的純度及效價 純化後兔抗鼠IgG多抗經SDS-PAGE電泳分析，純度可以達到95%以上。雙向瓊脂 擴散試驗測定兔抗鼠IgG血清效價為l : 32。
2.2膠體金顆粒的形態 製備的膠體金通過透射電子顯微鏡觀察顆粒的大小和均一程度。測得100個金顆 粒的平均直徑為25nm，符合標記單抗的要求(圖3)。
8
2. 3標準樣品的檢測結果 標準豬瘟陽性和陰性樣品經膠體金免疫層析試紙條檢測，結果與預期相符陽性 樣品在試紙條上出現兩條清晰可見的紅色條帶，陰性樣品僅在對照線出現一條紅色條帶。
2. 4膠體金試紙條的檢測性能
2. 4. 1特異性 將實施例1所製備的膠體金免疫層析試紙條對不同的病毒樣品進行檢測，結果表
明，該試紙條與豬的其他常見病毒反應呈陰性(圖4)，而與各基因型的豬瘟病毒反應成陽
性(圖5)。與不同廠家生產的豬瘟兔化弱毒疫苗反應也均呈陰性反應。 分別用膠體金免疫層析試紙條檢測CSFV Shimen株、兔化弱毒(HCLV) 、 BVDV、
PRRSV、 TGEV、 PEDV、 PRV、 PrV、 PPV和PCV-2感染的細胞培養物。 2. 4. 2敏感性將105 0TCID50的CSFV用PBS稀釋成TCID50分別為104 5/0. lmL、 104 0/0. lmL、 1035/0. lmL和103°/0. lmL的病毒液。分別用本發明膠體金免疫層析條試紙條檢測，每個稀 釋度重複兩次。結果表明，本發明試紙條檢測CSFV的最低限為103 5TCID5。(圖6)。
2. 4. 3重複性 用不同批次的本發明試紙條分別檢測陽性病毒細胞培養物和陰性細胞培養物，每 個批次重複檢測3次，結果均無明顯差異，說明該試紙條具有良好的重複性。
2. 4. 4膠體金免疫層析試紙條與抗原ELISA的符合性 將本發明膠體金免疫層析試紙條對樣品的檢測結果與抗原ELISA檢測結果進行 符合，兩者具有較高的符合率。當樣品中病毒含量較高時，兩者的符合率可達到100% (表 1)。 2. 4. 5保存期 本發明膠體金免疫層析試紙條在4C保存6個月內，取出檢測陰性和陽性參考樣 品，測試顯色程度和顯色時間無顯著性差異，說明其保存期至少可達6個月。
表1膠體金免疫層析試紙條與抗原ELISA檢測結果比較
病毒 OD，值 ELISA檢測結果 試紙條檢測結果
CSFV Shimen CSFV HLJ-1(06) CSFV HLJ-3(06) CSFV HeN-5(06) CSFV HeN-3(06) CSFVHuN1(06) CSFV SH-7(06) CSFV SHI 1-0701 CSFV SX-09 HCLV BVDV PRRSV TGEV PEDV
PRV PrV PPV PCV2 陽性對照 陰性對照
1.213 1.012 1.114 1.011 1.105 1.103 0.992 0.983 0.896 0.031 0.007 0.021 0.067 0.039
0.064 0.039 0.079 0.087 1.023 0.085
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權利要求
一種檢測豬瘟病毒野毒的膠體金免疫層析試紙條，其特徵在於由吸水紙(1)、硝酸纖維素膜(2)、膠體金墊(3)、樣品墊(4)和支持物(5)組成；所述的硝酸纖維素膜(2)含有一條由抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體HQ06包被而成的檢測線和由兔抗鼠IgG抗體包被而成的質控線；所述的膠體金墊(3)結合由膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10；其中，吸水紙(1)、硝酸纖維膜(2)和膠體金墊(3)按照以下次序相連接並附著在支持物(5)上膠體金墊(3)與靠近硝酸纖維膜(2)上的檢測線的一端相連接，吸水紙(1)與靠近硝酸纖維素膜(2)上的質控線的一端相連接；樣品墊(4)的一端附著在膠體金墊(3)上，膠體金墊(3)的另一端與硝酸纖維素膜(2)相銜接。
2. 按照權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特徵在於所述的支持物(5)是 塑料板、硬紙板或鋁板。
3. 按照權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特徵在於，所述的膠體金墊按照以下方法製備得到(1) 製備膠體金顆粒取0.01%的氯金酸100mL，攪拌狀態加熱至9(TC，加入1. 8mL 1 %檸檬酸三納溶液，檸檬酸三鈉與氯金酸溶液充分混勻後，降低攪拌器的轉速，繼續加熱 維持整個反應體系溫度在95t:;當溶液顏色由淺黃色變成酒紅色時，停止加熱，冷卻至室 溫；用0. lmol/L的K2C03將膠體金溶液pH值調至8. 2，用0. 22 y m濾膜過濾後裝入潔淨的玻璃瓶中，4t:避光保存；(2) 製備膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10溶液將6E10單抗 與膠體金溶液用磁力攪拌器混合；加入5%的BSA溶液至終濃度為1 %，離心20min棄沉 澱；10， 000r/min離心60min，棄上清；沉澱物用0. 02mol/L硼酸鹽緩衝液稀釋至原體積的 1/10，4t:保存備用；其中，6E10單抗與膠體金溶液的標記量為18. 75ii g/mL ;(3) 取玻璃纖維紙，將其浸入步驟(2)所製備的膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單 克隆抗體6E10溶液中lh，室溫乾燥，即得。
4. 一種製備權利要求1所述膠體金免疫層析試紙條的方法，包括(1) 將抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10和兔抗鼠IgG抗體間隔4-6mm噴在硝酸 纖維膜(2)上，分別作為檢測線和質控線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其餘蛋白結合位點， 洗滌，乾燥，備用；(2) 將硝酸纖維膜(2)、膠體金墊(3)、樣品墊(4)、吸水紙(1)按照以下次序粘在支持 物上將膠體金墊連接在靠近硝酸纖維膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上，樣品 墊附著在膠體金墊的另一端上；吸水紙連接在硝酸纖維素膜的另一端，與硝酸纖維素膜的 質控線相接近；(3) 將粘好的支持板材料切成3mm寬的試紙條，即得。
全文摘要
本發明公開了一種檢測豬瘟病毒野毒的膠體金免疫層析試紙條，由吸水紙(1)、硝酸纖維素膜(2)、膠體金墊(3)、樣品墊(4)和支持物(5)組成；所述的硝酸纖維素膜含有一條由抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體HQ06包被而成的檢測線和由兔抗鼠IgG抗體包被而成的質控線；所述的膠體金墊結合由膠體金標記的抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體6E10。本發明試紙條不與豬瘟兔化弱毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸症候群病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬圓環病毒2型反應，能夠準確、靈敏的鑑別診斷豬瘟病毒野毒，具有良好的特異性、敏感性和重複性。
文檔編號G01N33/532GK101762705SQ201010001679
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者仇華吉, 孫元, 王向鵬 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所