在人實體瘤中的基因缺損和突變體alk激酶的製作方法

2023-12-09 04:42:11

專利名稱：在人實體瘤中的基因缺損和突變體alk激酶的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及與癌症有關的蛋白質和基因，以及涉及癌症的 才企測、i貪斷和治療。
背景技術：
許多癌症以細胞信號通路的石皮壞為特徵，其導致細胞過程的異 常控制，或導致不能控制細胞的生長和增殖。這些破壞經常由特定 信號蛋白(如激酶)活性的變化所引起。這些癌症包括實體瘤，如 非小細胞肺癌(NSCLC)。在美國，NSCLC是癌症死亡的主要原因， 並且佔所有月申癌的約87%。在美國每年有約151,000個NSCLC新 病例，並且據估計-f義在美國每年120,000以上的患者將死於該疾病。 參見"C"wcer2G05，" American Cancer Society 。包括 三種不同亞型的NSCLC經常4又在它已經轉移以後祐:;險測到，因此 在i貪斷的兩年內死亡率是75%。
已知，導致具有異常信號活性的激酶融合蛋白的基因缺失和/ 或易^f立可以直^妄導致某些癌症。例如，已直4妄i正明，BCR-ABL癌 蛋白( 一種酪氨酸激酶融合蛋白)是人慢性髓細胞性白血病(CML ) 的病原體。在至少90-95%的CML病例中發現的BCR-ABL癌蛋白 是通過基因序列從第9號染色體上的c-ABL蛋白質酪氨酸激酶易位到第22號染色體上的BCR序列而產生的，這產生所謂的費城染色 體。參見例如，Kurzock " "/.， TV.五"g/. 3/9: 990-998 (1988)。
在急性淋巴細胞白血病和NSCLC病例中也觀測到易位。
已描述了導致與各種其它癌症有關的突變體或融合蛋白的基 因易^f立和缺失。1列^口， Falini"a/"S/ood 99(2" 409-426 (2002),糹宗 述了已知發生在血液癌症中的易位，包括在ALCL中發現的 NPM-ALK融合。到目前為止，僅描述了發生在肺癌中的有限數目 的基因易位、缺失、以及突變體蛋白質，包括涉及Notch3的t(15;19) 易位。參見Dang " a/" /胸/. Ow. 92(76" 1355-1357 (2000)。
在小細胞和非小細胞肺癌中已發現RNA結合蛋白-6(EML-4)表達和 /或活性方面的缺損。參見Drabkin " a/., (9wcoge"e S(76」.'2589-97 (1999)。然而，到目前為止，還沒有描述在人NSCLC癌症中涉及蛋 白激酶的易位或缺失。
已描述了在間變性大細胞淋巴瘤中由於NPM與ALK的融合所 導至丈的ALK S敫酶表達方面的在夾損。參見Morris " a/., 1994; Shiota " "/.，1994。已描述了 ALK與膜突蛋白、非肌肌球蛋白重鏈9(Tort " a/. 2001)、網格蛋白(clarthrin)重鏈(TourioleM/" 2000; Bridge""/" 2001 )、原月幾5求蛋白3(TPM3)(Lamant " 1999)、 TRK-融合基因 (TGF)(Hemandez W "/.，爿附.戶"仇1487-1493 (2002))以及 其它基因的融合。尤其是，據報導在非實體淋巴瘤中有TGF-ALK 融合，但到目前為止，還未在實體瘤中描述這種融合。已描述了 ALK在癌症中的一4殳作用。參見Pulford " "/.， J！ Ce〃屍 Wo/. 7P9(3六 330-358 (2004)。然而，到目前為止，還沒有描述在EML-4表達和/ 或激活方面的缺損。
高度期望鑑定在人癌症中的突變，因為它可以導致開發新療法 (治療劑)，其輩巴向這樣的融合或突變體蛋白質，以及導致新i貪斷 方法，用於鑑定具有這才羊的基因突變的患者。例如，BCR-ABL已 變成開發治療白血病的治療劑(療法)的靶。最近，Gleevec (曱 磺酸伊馬替尼，STI-571), ABL激酶的一種小分子抑制劑，已批准 用於治療CML。這種藥物是新類抗增殖劑的第一種藥物，其用來對驅動腫瘤細胞生長的信號通路進行幹擾。這種藥物的開發相對於
CML和ALL的常規療法(化療和放射)而言代表一種顯著的進步， 其中常規療法受到眾所周知的副作用的煩擾並且經常具有有限的 效果，因為它們不能特異性地靶向癌(惡性腫瘤)的基本的原因。 同樣，已描述了用於特異性地檢測患者中的BCR-ABL融合蛋白的 試劑和方法，以便鑑定最可能應答靶向抑制劑如Gleevec⑧的患者。
因此，仍然需要鑑定新的基因突變，如易位或缺失，其導致與 人癌症，尤其是實體瘤，包括肺癌如NSCLC的進展有關的融合或 突變體蛋白質，以及需要開發新的試劑和方法，用於研究和4企測這 樣的融合蛋白。這樣的融合蛋白的鑑定將尤其期望產生新方法來選 擇用於靶向治療的患者，以及用於篩選能抑制這樣的突變體/融合蛋 白的新藥物。

發明內容
根據本發明，在人實體瘤非小細胞肺癌(NSCLC)中現已鑑定 了發生在人第2號染色體中的新的基因缺失突變，其導致融合蛋白， 該融合蛋白結合部分間變性淋巴瘤激酶(ALK)和二級蛋白質。與 ALK融合有關的二級蛋白質包括棘皮動物微管結合蛋白樣(棘皮類 微管關聯蛋白樣,Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like) 4(EML-4)和TRK-融合基因(TFG)。在非小細胞肺癌患者樣品中目前 已7見測到突變體/融合ALK激酶。
因此本發明部分地提供了分離的多核苷酸和載體，其編碼所披 露的突變體/融合ALK多肽，用於檢測它們的探針和測定方法，分 離的突變體/融合ALK多肽，重組突變體多肽，以及用於才企測突變 體ALK多核苦酸和多肽的試劑。所^皮露的這些新的突變體ALK激 酶和易位/缺失的鑑定使得可以用新方法來確定在生物樣品中突變 體ALK多核苦酸或多肽的存在，本發明還提供了對抑制突變體激 酶蛋白的化合物進行篩選的方法，以及對以突變體ALK多核苷酸 或多肽的表達為特徵的癌症的進展進行抑制的方法。下面更詳細地 描述本發明的方面和實施方式。
ii附圖j兌明


圖1A示出了 EML-4基因和ALK基因在第2號染色體上的位 置(圖片A),全長EML-4和ALK蛋白質的結構域位置，以及 EML4-ALK融合蛋白(短變體)的結構域位置(圖片B );融合接 頭存在於胺基酸233-234,並且融合蛋白包括ALK的激酶結構域(但 不包括跨膜和胞外結構域)。還示出了 (在圖片B中)EML4外顯 子6/內含子6/ALK外顯子20融合接頭區的DNA (和蛋白質)序列 (分別為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 )。
圖1B示出了 EML-4基因和ALK基因在第2號染色體上的位 置(圖片A),和全長EML-4和ALK蛋白質的結構域位置，以及 EML4-ALK融合蛋白(長變體)的結構域位置(圖片B );融合接 頭存在於胺基酸495-496，並且融合蛋白包括ALK的激酶結構域(但 不包括跨膜和胞外結構域)。還示出了 (在圖片B中)EML4外顯 子13/ALK外顯子20融合接頭區的DNA (和蛋白質)序列(分別 為SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25 )。
圖1C示出了 TFG基因在第6號染色體上和ALK基因在第2 號染色體上的位置(圖片A),和全長TFG和ALK蛋白質的結構 域位置，以及TFG-ALK融合蛋白的結構域位置(圖片B );融合接 頭存在於胺基酸138-139，並且融合蛋白包括ALK的激酶結構域(但 不包括跨膜和胞外結構域)。還示出了 (在圖片B中)TFG外顯子 3/ALK外顯子20融合接頭區的DNA(和蛋白質)序列(分別為SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27 )。
圖2A是人EML4-ALK融合蛋白(短變體)的胺基酸序列(1 字母代碼)(SEQ ID NO:l)(頂部圖片)，還示出了編碼DNA序列(SEQ ID NO:2 )(底部圖片)；EML-4部分的殘基用斜體表示，而ALK的 激酶結構域的殘基用黑體表示。
圖2B是人EML4-ALK融合蛋白(長變體)的胺基酸序列(1 字母代碼)(SEQ ID NO:18)(頂部圖片)，還示出了編碼DNA序列(SEQIDNO:19)(底部圖片)；EML-4部分的殘基用斜體表示，而 ALK的激酶結構域的殘基用黑體表示。
圖2C是人TFG-ALK融合蛋白的胺基酸序列(1字母代碼)(SEQ ID NO:20)(頂部圖片)，還示出了編碼DNA序列(SEQ ID NO:21 )(底 部圖片)；TFG部分的殘基用斜體表示，而ALK的激酶結構域的殘 基用黑體表示。
圖3A-3B是人EML-4蛋白質的胺基酸序列(1字母代碼)(SEQ ID NO:3)(SwissProt Accession No. 061936)，還示出了編石馬DNA序 歹'J ( SEQ ID NO:4 ) (GeneBank Accession No. NM019063);《呆留在 短變體缺失突變體中的殘基被加上下劃線，而保留在長變體中的殘 基用斜體表示。
圖4A-4B是人ALK激酶的氨基^列(1字母代碼)(SEQ ID NO:5 ) (SwissProt Accession No. Q9UM73),還示出了編碼DNA序 列(SEQ ID NO:6 ) (GeneBank Accession No. HSU66559); l呆留在缺 失突變體中的殘基被加上下劃線，而激酶結構域的殘基用粗體表示。
圖4C-4D是人TFG蛋白質的胺基酸序列(1字母代碼)(SEQ ID NO:22)(SwissProt Accession No. Q92734),還示出了編碼DNA序列 (SEQ ID NO:23)(GeneBank Accession No. NM006070); 4呆留在缺失 突變體中的殘基淨皮加上下劃線。
圖5是凝膠圖(gels)，其示出了 ( A)藉助於5'RACE產物並 通過ALK引物在2 4侖PCR以後ALK的才僉測；UAP表示通用擴增 引物，GSP表示基因特異性引物，(B)通過EML-4形成的融合基 因和通過RT-PCR形成的ALK缺失突變體的檢測，(C )在人NSCLC 肺瘤衝羊品中通過5，RACE對EML4-ALK融合基因(短和長變體) 的檯r測，以及(D )在人NSCLC胂瘤樣品中通過5，RACE對TFG-ALK 融合基因的^r測。圖6示出了通過採用雙色(橙色/綠色)斷裂探針(包括ALK基因斷裂點2p23相反側的探針)的FISH測定法，對在H2228細胞中通過EML-4和ALK易位所形成的融合基因的檢測；探針大小和位置示於上部圖片中。
具體實施例方式
根據本發明，在人實體瘤非小細胞肺癌(NSCLC)中現已鑑定了導致突變體激酶融合蛋白的先前未知的基因缺失和易位，其中突變體激酶融合蛋白結合部分間變性淋巴瘤激酶(ALK)和部分二級蛋白質。與所發現的ALK融合有關的二級蛋白質包括棘皮動物微管結合蛋白樣4 (EML-4)和TRK-融合基因(TFG )。
兩種披露的發生在第2號染色體上的EML4和ALK基因之間的缺失產生融合蛋白，其結合EML-4 (401個胺基酸微管結合蛋白)的N端與ALK ( 1620個胺基酸膜酪氨酸激酶)的激酶結構域和C端。所得到的EML4-ALK融合蛋白(其分別為796個胺基酸(短變體)和1059個胺基酸(長變體)並保留ALK激酶活性)預期會驅動人實體瘤亞型(包^舌NSCLC)的增殖和存活。
所披露的發生在第6號染色體上的TFG基因和第2號染色體上的ALK基因之間的易位產生融合蛋白，其結合TFG (—種400個胺基酸蛋白質)的N端與ALK ( —種1620個胺基酸膜酪氨酸激酶)的激酶結構域和C端。所得到的TFG-ALK融合蛋白(其是701個胺基酸)先前在非實體人淋巴瘤中已觀測到(Hernandez " a/.(2002)，上文)，但先前在實體瘤中沒有描述。TFG-ALK融合蛋白保留ALK激酶活性，並且預期會驅動人實體瘤亞型(包括NSCLC )的增殖和存活。
雖然在NSCLC中已描述了幾種導致異常融合蛋白的基因易位或缺失，包4舌涉及Notch3的t(l5; 19)易位(參見Dang W a/.，上文)，但目前披露的EML4-ALK缺失突變體和融合蛋白是新的。類似地，TFG-ALK易位突變體和融合蛋白，雖然在非實體瘤如淋巴瘤中是
14已知的，但在實體瘤NSCLC中是新的。EML-4是一種表達在大多數人組織中的微管相關蛋白。到目前為止，還沒有報導在EML-4表達和/或活性方面的缺損。ALK是一種膜酪氨酸激酶，並且表達在人類的腦、CNS組織、以及小腸和睪丸中，但不表達在正常、淋巴樣細胞中。在神經系統的正常發育和功能中它起重要的作用(Iwahara"a/" 1997)。
在間變性大細胞淋巴瘤和成神經細胞瘤中已發現在ALK表達和/或激活方面的缺損(參見Morris d a/" 1994, Osajima-Hakomori "a/.，2005)。已描述了 ALK與膜突蛋白、非肌肌球蛋白重鏈9、網格蛋白重鏈、原肌球蛋白3(TPM3)、 TRK-融合基因(TFG)、以及其它基因的鬲蟲合。參見Tort W a/.; Touriol W a/., Hernandez W a/.，上文。有趣的是，所糹皮露的EML-4與ALK的融合(短變體)精確地存在於野生型(wild-type) ALK中的相同點(胺基酸1058),如先前4十隻於其它ALK融合突變體所描述的。
如下文進一步描述的，目前已分離和測序了 EML4-ALK缺失突變體和表達的融合蛋白，並且產生了用於表達融合蛋白的cDNA。因此，本發明部分地提供了編碼EML4-ALK融合多肽的分離的多核苷酸；雜交於這樣的多核苷酸的核酸探針；以及利用這樣的多斥亥芬酸來產生重《且突變體ALK多肽的方法、載體以及宿主細月包。本發明還部分地提供了分離的多肽，其包含編碼EML4-ALK融合多肽的胺基酸序列；重組突變體多肽；以及分離的試劑，其特異性地結合於和/或檢測EML4-ALK融合多肽，但不結合於或檢測野生型EML-4或野生型ALK。本發明的這些方面(其將在下文進一步詳細地描述)將尤其可用於進一步研究由突變體ALK激酶表達/活性驅動的癌症才幾制，用於鑑定實體瘤(例如，癌，包4舌肺癌和肉瘤)以及其它癌症，其以所4皮露的ALK缺失和易位突變和/或融合蛋白、或突變體ALK激酶的表達/活性為特徵，以及可用於實施本發明的方法，如下文進一步描述的。
新型ALK激酶突變體以及基因缺失和易4立突變的鑑定對於實體瘤如NSCLC的可能的診斷和治療具有重要意義，其中實體瘤以這些融合蛋白中的一種或多種為特徵。NSCLC，例如，經常僅在它轉移以後才才企測到，因此在it斷兩年內的死亡率為75%。因此，高度期望能夠儘早地鑑定具有基因突變(其可以導致NSCLC)的患者。
因此，起因於基因缺失的EML4-ALK融合蛋白(短和長變體)和起因於基因易位的TFG-ALK融合蛋白(其預期會驅動實體瘤，NSCLC，的增殖和存活)的發現〗吏得可以產生重要的新方法來準確地鑑定哺乳動物的實體瘤，包括肺癌(如NSCLC)，以及其它癌症，其中表達ALK融合蛋白(如EML4-ALK或TFG-ALK )。這些腫瘤4艮可能對突變體ALK蛋白如WHI-131或WHI-154的激酶活性的抑制劑起反應。儘早鑑定由突變體ALK激酶驅動的癌症的能力將大大有助於臨床確定哪種療法(治療劑)或療法組合將最適合於特定患者，從而有助於避免這樣的靶向其它激酶的抑制劑處方，這些激酶事實上並不是驅動癌症的主要信號分子。
因此，本發明部分地提供了利用本發明的融合特異性和突變體特異性試劑來才全測癌症中ALK突變體多核苷酸和/或融合多肽的存在的方法。這樣的方法可以用來例如鑑定實體瘤，如NSCLC，其可能對突變體蛋白質的ALK激酶活性的抑制劑起反應。本發明還部分地提供了用於確定化合物是否抑制以EML4-ALK融合多肽為特徵的癌症的進展的方法。另外，本發明提供了一種通過抑制突變體多肽的表達和/或活性來抑制實體瘤進展的方法，其中實體瘤表達EML4-ALK融合多肽或TFG-ALK融合多肽。這樣的方法將在下文進一步詳糹田i也4苗述。
下文將更詳細地描述本發明的另外的方面、優點以及實施方式。將本文引用的所有參考文獻的全部內部結合於此作為參考。
16定義
如在本文中所4吏用的，以下術語具有指定的含義。
"抗體"是指所有類型的免疫球蛋白，包括IgG、 IgM、 IgA、 IgD以及IgE，包括Fab或其抗原識別片段，包括嵌合、多克隆以及單克隆抗體。如在本文中所使用的，術語"人源化抗體"是指這樣的抗體分子，其中胺基酸已被非抗原結合區代替以便更接近地類似人抗體，同時仍然保留最初的結合能力。
術語"生物上活性的"是指具有天然存在分子的結構、調節、或生化功能的蛋白質。同樣，"免疫學上活性的"是指天然、重組、或合成EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽、或其任何寡肽誘導適當
術語"生物樣品，，以其最廣的含義使用，並且指任何懷lt包含ALK融合多核香酸或多肽或其片4殳(包括EML4-ALK和TFG-ALK融合多核苷酸和多肽)的生物樣品，並且可以包括細胞、分離自細胞的染色體(例如， 一定範圍的中期染色體)、基因組DNA(在溶液中或結合於固體載體如用於DNA分析)、RNA (在溶液中或結合於固體載體如用於RNA分析)、cDNA (在溶液中或結合於固體載體)、來自細胞的提取物、血液、尿、骨髓、或組織等。
就癌症和突變體ALK多核苷酸以及多肽而論，"特徵為"是指這樣的癌症，其中涉及ALK的基因缺失或易位和/或表達的融合多肽是存在的，這是與其中這樣的基因缺失和/或融合多肽不存在的癌症相比。突變體多肽的存在可以整體上或部分地驅動這樣的癌症的生長和存活。
"共有序列，，是指這樣的核酸序列，其已被重測序以分離(分解)不需要的石鹹基(uncalled base )，或其已利用XL-PCR ( PerkinElmer, Norwalk, Conn.)在5，和/或3'方向力口以延4申並測序過，或其已利用GELVIEWTM Fragment Assembly系統(GCQ Madison, Wis.)裝配自多於一種Incyte克隆的重疊序列，或其已^皮延伸和裝配。
17"ALK激酶-抑制治療劑"是指任何包含一種或多種化合物(化 學的或生物的)的組合物，其直4妄或間接i也、並單獨i也和/或作為融 合蛋白的一部分(如EML4-ALK融合蛋白和TFG-ALK融合蛋白)， 抑制野生型或截短的ALK激酶的表達和/或活性。
"衍生物"是指編碼所披露的融合多核苷酸的核酸序列的化學 修飾或所編碼的多肽本身。作為上述修飾的例證是用烷基、醯基、 或氨基基團代替氫。核酸衍生物將編碼保留天然分子的基本生物特 性的多肽。
就本文4皮露的多肽、多核苷酸或試劑而i侖，"可才企測標記"是指 化學的、生物的、或其它修飾，包括但不限於螢光、質量、殘基、 染料、放射性同位素、標記、或標誌修飾等，藉此可以才企測感興趣 分子的存在。
就生物樣品中的ALK融合多肽而論，"表達"或"表達的"是指與 其中該融合多肽未顯著表達的對照樣品相比顯著表達。
"重同位素標記肽"(可與AQUA肽互換-使用)是指包括至少一
個重同位素標記的肽，其適合於絕對量化或檢測蛋白質，如在 WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry" (Gygi "/.)中戶斤4苗 述的，並在下文進一步描述。就上述AQUA肽而i侖，術語"特異性 地檢測"是指肽將僅檢測和量化包含AQUA肽序列的多肽和蛋白質 並且將不會顯著地才企測並不包含AQUA肽序列的多肽和蛋白質。
"分離的"(或"基本上純化的")是指離開它們的天然環境並 經分離的或隔離的核酸或胺基酸序列。它們優選為至少60%、更優 選75%、以及最優選90%或更大地不含它們天然伴隨的其它成分。
"模擬物"是指這樣的分子，按照ALK融合多肽或其部分的結 構開發其結構，因此同樣能夠實施易位相關的蛋白質樣分子的一些 或所有作用。
18如本文所描述的，"突變體ALK"或"融合"多核苷酸或多肽是指 涉及ALK和二級蛋白質(例如，EML-4或TFG)的融合多核苷酸 或多肽。
"多核苷酸"(或"核苷酸序列")是指寡核苷酸、核苷酸、或 多核苷酸、以及其片斷或部分，以及指基因組或合成起源DNA或 RNA,其可以是單鏈或雙鏈的，並且表示有義鏈或反義鏈。
"多肽，，(或"胺基酸序列")是指寡肽、肽、多肽、或蛋白質 序列、以及其片斷或部分，並且指天然存在或合成分子。其中本文 陳述的"胺基酸序列"是指天然存在的蛋白質分子的胺基酸序列，
"胺基酸序列"和類似術語，如"多肽"或"蛋白質"，並不是將 胺基酸序列限於與陳述的蛋白質分子有關的完全、天然胺基酸序 列。
"EML4-ALK融合多核苦酸"是指如本文描述的基本上純化的 EML4-ALK缺失突變體基因產物或融合多核苷酸(短或長變體)的 核酸序列，其獲自任何物種，尤其是哺乳動物，包括牛、羊、豬、 鼠、馬、以及優選人，並且來自任何來源天然、合成、半合成、 或重組。
"EML4-ALK融合多肽"是指本文描述的基本上純化的 EML4-ALK融合多肽(短或長變體)的胺基酸序列，其獲自任何物 種，尤其是哺乳動物，包括牛、羊、豬、鼠、馬、以及優選人，並 且來自<壬<可來源天然、合成、半合成、或重組。
"TFG-ALK融合多核苷酸"是指如本文描述的基本上純化的 TFG-ALK易位突變體基因產物或融合多核香酸的核酸序列，其獲 自任何物種，尤其是哺乳動物，包括牛、羊、豬、鼠、馬、以及優 選人，並且來自4壬4可來源天然、合成、半合成、或重組。
"TFG-ALK融合多肽"是指本文描述的基本上純化的TFG-ALK 融合多肽的胺基酸序列，其獲自任何物種，尤其是哺乳動物，包括
19牛、羊、豬、鼠、馬、以及優選人，並且來自任何來源天然、合 成、半合成、或重組。
關於抗體和蛋白質或肽的相互作用，術語"特異性地結合於" ((或"特異性地結合"或"特異的結合")是指，該相互作用取決於 在蛋白質上特定結構(即，抗原決定簇或表位)的存在；換言之， 抗體識別並結合於特定的蛋白結構而不是一般地結合於蛋白質。就 抗體結合於序列或抗原決定簇而不是結合於它對其是特異性的序 列或抗原決定簇而論，術語"並不結合"是指並不顯著地與其反應， 這是與抗體結合於對其抗體是特異性的抗原決定簇或序列相比。
就序列或探針雜交條件而論，術語"嚴格條件"是"嚴格性"， 其發生在約Tm-5°C (低於探針或序列的解鏈溫度(Tm)5。C)至低於 Tm約20。C至25。C的範圍內。典型的嚴格條件是在42°C下在溶 液中過夜溫育，其中溶液包含50%甲醯胺、5X.SSC(750mMNaCl， 75 mM 一寧檬酸三鈉)、50 mM石粦酸鈉(pH 7.6)、 5X Denhardt溶液、 10%硫酸右旋糖酐、以及20孩i克/ml變性的、切變的鮭魚精DNA， 接著在約65。C的O.IXSSC中洗滌過濾器。如本領域4支術人員將明
苦酸序列。
突變體ALK多肽的"變體"是指被一個或多個胺基酸改變的 胺基酸序列。該變體可以具有"保守"變化，其中取代的胺基酸具 有類似的結構或化學性能，例如，用異亮氨酸代替亮氨酸。更例外 地，變體可以具有"非保守，，變化，例如，用色氨酸^替甘氨酸。 類似的較小變化還可以包括胺基酸缺失或插入，或兩者。利用本領 i或眾所周知的計算枳4l序，例如DNASTAR庫欠件，可以找到指導， 其用來確定可以取代、插入、或缺失哪些胺基酸殘基而不消除生物 或免疫活性。
A.在人實體瘤中的突變體ALK激酶的鑑定
在對來自非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系(包括H2228)的提取物 和來自患者的實體瘤進行全面磷酸化肽分布實驗過程中意外地鑑
20定了本文披露的新的人基因缺失，其發生在第2號染色體上並導致 兩種結合具有激酶結構域的EML-4的N端和ALK的C端的融合蛋 白變體的表達。NSCLC (—種實體瘤)是肺癌的一種亞型。在這些 缺失融合中涉及的蛋白質示於圖1A-1B的圖片A中。
利用最近描述的用於分離和質譜表徵來自複雜混合物的〗奮飾 肽的4支術(參見美國專利/>開號20030044848, Rush w "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides from Complex Mixtures" ) ("IAP"才支術)，首次闡述了 H2228細胞系的石粦酸化分布， 如在下文的實施例1中進一步描述的。應用IAP技術並利用磷酸酪 氨酸特異性抗體(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA， 2003/04 Cat. #9411 )鑑定了 H2228細胞系表達ALK激酶，但蛋白 質被明顯截短。該篩選鑑定了在細胞系中的許多其它激活的激酶， 包括已知在肺癌中被激活的某些激酶。然後通過5， RACE進行的序 列5，至ALK的分析鑑定了激酶#:融合到EML-4的N端(參見圖6 )。
隨後利用才目同的全面石粦酸基分布方式(phospho-profiling approach )對來自NSCLC患者的154個腫瘤樣品進行的實驗不4又證 實在那些患者群體中存在EML4-ALK (短變體)突變，而且揭示了 在其它患者群體中存在第二種EML4-ALK (長變體)以及存在 TFG-ALK突變(參見實施例IB和1C )。
通過利用siRNA沉默來抑制細胞可以i正實，突變體ALK蛋白 質在這些NSCLC腫瘤中正驅動細胞增殖和存活(參見實施例3 )。
通過PCR擴增EML4-ALK融合基因(短和長變體)和TFG-ALK 融合基因，然後分離並測序(參見實施例3)。如圖1A-1B的圖片B 所示，EML4-ALK缺失結合具有激酶結構域的野生型EML-4 (在 短變體中的胺基酸1-233,或在長變體中的胺基酸1-495 ) N端與野 生型ALK (胺基酸1057-1620 )的C端(還參見SEQ ID NOs: 3和 5 )。融合接頭正好存在於野生型ALK的C端至跨膜結構域(參見 圖1A-1B )。 EML4-ALK融合多肽分別保留EML-4的N端233或 495個胺基酸，其包括該蛋白質的巻曲螺旋結構域。所得到的分別 包含796個胺基酸(短變體)或1059個胺基酸(長變體)(參見圖
211A-1B和圖2A畫2B的圖片B(SEQ ID NOs: 1和18))的EML4-ALK 融合蛋白可保留ALK的激酶活性。涉及的外顯子以及融合4妻頭示 於圖1A-1B(圖片B)中。融合接頭包括來自EML-4的內含子6, 其接著外顯子6 (短變體)或來自EML-4 (長變體)的外顯子13。
如圖1C的圖片B所示，TFG-ALK易4立結合具有激酶結構i或 的野生型TFG (胺基酸1-138)的N端與野生型ALK (胺基酸 1057-1620)的C端(還參見SEQIDNOs: 22和5;以及圖1C的圖 片B和圖4C(SEQ ID NOs: 20和1))。融合4姿頭正好存在於野生型 ALK的C端至跨膜結構域(參見圖1C )並保留ALK的激酶活性。 涉及的外顯子以及融合接頭示於圖1C(圖片B)中。該融合接頭包 括來自TFG的外顯子3和來自ALK的外顯子20。
FISH探針用來在一組400個石蠟包埋的人NSCLC腫瘤樣品中 才企測EML4-ALK (短變體)融合蛋白的存在(參見實施例6和7; 圖6)。在該樣本量中這種短變體突變的發生率非常^f氐。然而，利用 IAP技術來4全查在另一組來自患者的154個冷凍人NSCLC腫瘤樣 品中的全面磷酸化分布，則才企測到EML4-ALK融合蛋白(短和長 變體兩者)、以及TFG-ALK融合蛋白的表達具有更高的發生率(參 見實施例1B )。
B.分離的多核苷酸
本發明部分地提供了編碼EML4-ALK融合多肽的分離的多 核苷酸；雜交於上述多核苷酸的核苷酸探針，以及用於利用上述多 核苷酸來產生重糹且融合多肽的方法、載體、以及宿主細月包。
除非另有"i兌明，本文中通過測序DNA分子所確定的所有4亥苷 酸序列是利用自動4匕的DNA測序4義(如來自Applied Biosystems， Inc. 的型號373 )力口以確定的，並且由本文確定的DNA分子編石馬的多 肽的所有胺基酸序列是利用自動化的肽測序4義加以確定的(參見實 施例2)。如本技術領域已知的，對於通過這種自動化方式確定的任 何DNA序列，本文確定的任何核苦酸序列可以包含一些誤差。通
22過自動化方法確定的核苷酸序列通常至少約90%相同於，更通常至 少約95%至至少約99.9%相同於測序的DNA分子的實際核苷^f 列。實際序列可以通過其它方式更準確地加以確定，包括本領:威眾 所周知的人工DNA測序方法。如本技術領域同樣已知的，和實際 序列相比，在確定的核苦酸序列中的單插入或缺失爿誇在核苷酸序列 的翻譯中引起移碼，以致由確定的核苷酸序列編碼的預測的胺基酸 序列將完全不同於由測得的DNA分子實際編碼的胺基酸序列，其 開始於上述插入或缺失的點。
除非另有說明，本文陳述的每個核苷酸序列表示為脫氧核糖核 芬酸(簡寫為A、 G、 C以及T)的序列。然而，核酸分子或多核 苷酸的"核苷酸序列"對於DNA分子或多核苷酸是指脫氧核衝唐核 苦酸序列，而對於RNA分子或多核苷酸則是指核糖核苷酸(A、 G、 C以及U)的相應序列，其中在指定的脫氧衝亥外唐核香酸序列中的每 個胸苦脫氧核糖核苦酸(T)被核糖核苦酸尿苷(U)取代。例如，對照 具有SEQ ID NO: 2的序列(利用脫氧核糖核苷酸簡寫表示)的RNA 分子可用來指出RNA分子具有這樣的序列，其中SEQ ID NO: 2的 每個脫氧核糖核苦酸A、 G或C已^皮相應的核糖核苷酸A、 G或C 取 ，並且每個脫氧衝亥4唐4亥香酸T已淨皮核津唐4亥苷酸U取^。
在一種實施方式中，本發明提供了一種分離的多核苷酸，該多 核苷酸包含核苷酸序列，而該核苷酸序列至少95%相同於選自由以 下序列組成的組的序列
(a)編碼棘皮動物微管結合蛋白樣4/間變性淋巴瘤激酶 (EML4-ALK )融合多肽的核苷酸序列，包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的胺基酸序列；
(b )編碼EML4-ALK融合多肽的核苦酸序列，所述核香酸序 列包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 19的核苷酸序列；
(c )編碼EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，其中EML4-ALK 融合多肽包含EML-4的N端胺基酸序列(SEQ ID NO: 3的殘基
231-233或SEQ ID NO: 3的殘基1-495 )以及ALK的激酶結構域(SEQID NO: 5的殘基1116-1383 );
(d )核苷酸序列，包含EML-4的N端核普酸序列(SEQ ID NO:4的核苦酸1-700或SEQ ID NO: 4的核苷酸1-1486 )以及ALK的激酶結構域核苷酸序列(SEQ ID NO: 6的核苷酸3348-4149 );
(e )核苷酸序列，包含至少6個鄰接核苷酸，其圍繞EML4-ALK融合多核普酸的融合接頭(SEQ ID NO: 2的核苦酸700-701或SEQID NO: 19的核苷酸1486-1487 );
(f) 編碼多肽的核香酸序列，包含至少6個鄰接胺基酸，其圍繞EML4-ALK融合多肽的融合接頭(SEQ ID NO: 1的殘基233-234或SEQ ID NO: 18的殘基495-496 );以及
(g) 核香酸序列，其互補於(a) (-(f)的任4可核苷酸序列。
利用本文提供的信息，如圖2中的核苷酸序歹'j(SEQ IDNO:2),並利用標準克隆和篩選方法，如利用mRNA作為原料來克隆cDNA的那些方法，可以獲得本發明的核酸分子，其編碼本發明的突變體ALK多肽。作為本發明的例證，在圖2中描述的EML4-ALK融合多核普酸(短變體)(SEQ ID NO: 2)分離自人NSCLC細胞系的基因組DNA (如在在下面的實施例2中進一步描述的)。還可以在其它癌症(包括實體瘤)的基因組DNA或cDNA文庫中鑑定融合基因，其中發生所披露的EML4-ALK基因缺失(第2號染色體)。
確定的EML4-ALK融合基因的核苦酸序列(SEQ ID NOs: 2和19)分別編碼796個胺基酸的激酶融合蛋白(短變體)和1059個胺基酸的激酶融合蛋白(長變體)(參見圖2A-B(SEQ ID NOs: 1和18)和圖1A-B )。 EML4-ALK融合多核苷酸包括「野生型EML-4的部分核苷酸序列(參見圖3(SEQIDNO:4))，其編碼具有野生型ALK的部分核香酸序列(參見圖4(SEQIDNO: 6))的蛋白質的N端(胺基酸l-233(短變體)或胺基酸l-495(長變體))，其中上述部分核苷酸序列編碼上述蛋白質的激酶結構域和C端。參見圖1A-B。激酶結構域包含在短變體融合蛋白(由短變體融合多核苷酸的核苷酸
874-1704編碼)中的殘基292-568或在長變體融合蛋白(由長變體融合多核苷酸的核苷酸1663-2494編碼)中的殘基555-831。參見圖2A-2B。
如所指出的，本發明部分地提供了 EML4-ALK融合蛋白的成熟形式。根據信號假說，由哺乳動物細胞分泌的蛋白質具有信號或分泌前導序列，其在生長蛋白質鏈穿過糙面內質網的l命出已^皮引發以後剪切自成熟蛋白質。大多數哺乳動物細胞並且甚至昆蟲細胞在相同的特異性下剪切分泌的蛋白質。然而，在某些情況下，分泌蛋白質的剪切並不是完全均勻的，其導致兩種或更多種蛋白質的成熟物質。另外，4艮久已經知道，分泌的蛋白質的剪切特異性最終由完全蛋白質的一級結構確定，即，它是多肽的胺基酸序列所固有的。
具有例如由沉積的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的成熟EML4-ALK多肽是指，通過在哺乳動物細月包(例如，3T3糹田月包，如下所述)中表達完全可讀框所產生的成熟形式的這種融合蛋白，其中完全可讀衝匡是由沉積的克隆或其它編碼成熟融合多肽的克隆的人DNA序列編碼的。
如所指出的，本發明的多4亥苦酸可以具有RNA的形式，如mRNA,或具有DNA的形式，包4舌，例如，cDNA和基因組DNA(通過克隆獲得或合成產生)。該DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，還稱作有義鏈，或它可以是非編碼鏈，還稱作反義4連。
本發明的分離的多核苷酸是核酸分子、DNA或RNA,其已離開它們的天然環境。例如，對於本發明來說，包含在載體中的重組DNA分子被認為是分離的。分離的DNA分子的另外的實例包括保持在異源宿主細胞中的重組DNA分子或在溶液中的經純化(部分地或基本上)的DNA分子。分離的RNA分子包括本發明的DNA分子的體內或體外RNA轉錄物。才艮據本發明的分離的核酸分子進一步包4舌上述合成產生的分子。本發明的分離的多核苷酸包括圖2A-B所示的DNA分子(SEQID NOs: 2和19 );圖1A-B所示的包含用於成熟EML4-ALK融合蛋白的編碼序列的DNA分子(SEQ ID NOs: 1和18);以及這樣的DNA分子，其包含顯著不同於上述序列的序列，但由於遺傳密碼的筒並，其仍然編碼本發明的ALK突變體多肽。遺傳密碼在本才支術領域是眾所周知的，因此本領域4支術人員可以常規地產生上述簡併變體。
在另一種實施方式中，本發明提供了一種分離的多核苷酸，該多核香酸編碼EML4-ALK融合多肽，其包括包含在上述沉積的cDNA克隆中的EML4-ALK融合核苷酸序列。優選地，上述核酸分子將編碼由沉積的cDNA克隆或另 一種克隆(其表達本文描述的全長EML4-ALK融合蛋白)編碼的成熟融合多肽。在另一種實施方式中，本發明^是供了一種分離的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼EML4-ALK融合多肽，其包含EML-4的N端胺基酸序列(SEQ IDNO: 3的殘基1-233或SEQ ID NO: 3的殘基1-495 )以及ALK的激酶結構域(SEQ ID NO: 5的殘基1116-1383 )。在一種實施方式中，包含ALK的^敫酶結構j或的多肽包4舌SEQ ID NO: 5的殘基1057-1620 (參見圖1，圖片B)。在另一種實施方式中，上述EML-4的N端胺基酸序列和ALK的激酶結構域分別由包含SEQ ID NO: 4的核普酸1-700或SEQ ID NO: 4的核苷酸1-1486和SEQ ID NO: 6的核苷酸3171-4860的核苷酸序列加以編碼。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸包含這樣的核苷酸序列，其具有互補於本發明的突變體ALK多核苷酸之一的序列。上述分離的分子，尤其是DNA分子，可作為^t罙針，用於通過與染色體的原位雜交進行基因作圖，以及用於衝企測EML4-ALK融合蛋白在人組織中的表達，例如，通過RNA印跡分沖斤，如在下面的F部分中進一步描述的。
本發明進一步涉及本文描述的分離的核酸分子的片斷。本發明的分離的EML4-ALK多核苷酸的片斷是指長度至少約15個核苷酸的片斷，更優選至少約20個核苷酸，進一步更優選至少約30個核普酸，並且甚至更優選至少約40個核苷酸，如本文所討i侖的，其可以用作i貪斷4採針和引物。當然，才艮據本發明，也可以4吏用長度約50-1500個核香酸的更大片斷，因為這些片斷對應於大多數(如果不是所有)沉積的cDNA的突變體ALK核普酸序列或如圖2所示(SEQ ID NO: 2)或其它克隆，其表達融合多核苷酸，如圖2A-B所示(SEQIDNOs:2或19)。長度至少20個核苷酸的片斷，例如，是指這樣的片斷，其包括20個或更多鄰4妄相應核苷酸序列(片斷由其書f生)的鹼基。本4頁域」技術人員可以用常失見方法產生上述DNA片斷，並且可以例如通過限制性內切核酸酶剪切或聲處理剪切可獲自沉積的cDNA克隆的DNA來完成，或才艮據本文披露的序列加以合成。可替換地，可以直接合成產生上述片斷。
本發明的優選的核酸片斷或探針包括這樣的核酸分子，其編碼EML4-ALK融合基因產物的融合接頭(參見圖1A-B，圖片B )。例如，在某些優選的實施方式中，本發明的分離的多核苷酸包4舌核苷酸序列/片斷，其包含圍繞EML4-ALK融合多核苷酸的融合接頭(SEQ ID NO: 2的核苷酸700-701或SEQ ID NO: 19的核苦酸1486-1487)的至少6個鄰接核苷酸(參見圖1A-B,圖片B(SEQ IDNOs:8和))。在另一種優選的實施方式中，本發明的分離的多核普酸包括編碼多肽的核普酸序歹'J/片斷，該多肽包含圍繞EML4-ALK融合多肽的融合接頭(SEQ ID NO: 1的殘基233-234或SEQ ID NO:18的殘基495-496 )的至少6個鄰接胺基酸(參見圖1A-B,底部圖片(SEQ ID NOs: 7和24))。
在另一個方面，本發明提供了一種分離的多核苷酸，其在嚴格雜交條件下雜交於如本文所描述的本發明的突變體ALK多核苷酸的一部分。"嚴格雜交條件"是指在42。C下在溶液中過夜溫育，其中所述溶液包含50%甲醯胺、5X.SSC (750mMNaCl、 75 mM檸4象酸三鈉)、50mM石粦酸鈉(pH7.6)、 5X Denhardt溶液、10。/。碌u酸右旋糖酐、以及20微克/ml變性的、切變的鮭魚精DNA,接著在約65°C下在0.1XSSC中洗滌過濾器。
27雜交於多核苷酸的"一部分"的多核苷酸是指這樣的多核苷酸
(DNA或RNA )，其雜交於參比多核苷酸的至少約15個核苷酸(nt), 更優選至少約20個nt，進一步更優選至少約30個nt,以及甚至更 <尤選約30-70個nt。如在上文所討i侖的和在下文更詳細描述的，這 些雜交於多核苷酸的"一部分"的多核苷酸可用作it斷4笨針和引物。
當然，才艮據本發明，雜交於更大部分參比多核苷酸(例如，在 圖2中描述的成熟EML4-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO: 2))，例 如，長度為部分50-750個nt,或雜交於整個長度的參比多核苷酸的 多核普酸也可以用作探針，因為多核苷酸對應於大多數(如果不是 所有)的沉積的cDNA的核苷酸序列或圖2A-B所示的核苷酸序列 (SEQ ID NOs: 2或19 ),或圖1A-B(圖片B)所示的核苷酸序歹'J( SEQ ID NOs: 7和24 )。
"長度至少20個核苷酸"的部分多核苷酸，例如，是指來自 參比多核苷酸的核苷酸序列的20個以上鄰接核苷酸。如所指出的， 這樣的部分可以診斷上用作探針(按照常規DNA雜交技術)或用 作引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)用於靶序列的擴增，如例如在 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.， Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.， eds.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中所描述的，將其全部4皮露內 容以引用方式結合於本文。當然，僅雜交於多聚腺苷酸序列(如圖 2所示的EML4-ALK序列(SEQ ID NO: 2 )的3'端多聚(腺香)段)或 僅雜交於T(或U)殘基的互補段序列的多核苷酸將不包括在本發明 的用來雜交於本發明的部分核酸的多核苷酸中，因為這才羊的多核苷 酸將雜交於任何包含多聚(腺苷)段或其補體的核酸分子(例如，實 際上任何雙鏈cDNA克隆)。
如所指出的，本發明的核酸分子，其編碼本發明的突變體ALK 多肽，可以包括但不限於那些單獨地編碼成熟多肽的胺基酸序列的 核酸分子；用於成熟多肽和另外序列的編碼序列，如那些編碼前導 或分泌序列的編碼序列，如前體蛋白序列、或原蛋白序列或前原蛋 白序列；成熟多肽的編碼序列，具有或沒有上述另外的編碼序列，
28連同另外的、非編碼序列，包括例如但不限於內含子和非編碼5， 和3，序列，如轉錄的、非翻i,序列，其在轉錄、mRNA加工中起作 用，包括剪接和聚腺苷酸化信號，例如，mRNA的核糖體結合和穩 定性；另外的編碼序列，其編碼另外的胺基酸如那些提供另外功能 的胺基酸。
因此，編石馬多肽的序列可以^皮融合到標i己序列，如對肽進4亍編 碼的序列，其促進融合多肽的純化。在本發明的該方面的某些優選 實施方式中，標記胺基酸序列是六組氨酸肽，如提供在pQE載體中 的標記(Qiagen， Inc.)，其中i午多可商業上獲4尋。如在Gentz w "/., 」Va" ^cad t/&4<§<5, 821-824 (1989)中所描述的，例如，六組氨酸 提供融合蛋白的方便純化。"HA"標記是另一種可用於純化的肽， 其對應於衍生自流感血凝素蛋白的表位，這已由Wilson a "/.， Ce〃 37.'767(1984)力口以描述。如下面所"i寸i侖的，其它這才羊的融合蛋白包 括本身在N端或C端融合到Fc的EML4-ALK融合多肽。
本發明進一步涉及本發明的核酸分子的變體，其編碼本文披露 的EML4-ALK融合多肽的部分、類似物或4汙生物。變體可以是天 然存在的，如天然等位基因變體。"等位基因變體"是指基因的多 種替換形式之一，其中基因佔據生物體的染色體上的給定基因座。 參見，4列長口， Genes II， Lewin， B.， ed., John Wiley & Sons, New York (1985)。可以利用本領域已知的誘變技術來產生非天然存在的變體。
這樣的變體包括那些由核苷酸取代、缺失或加成(添加)所產 生的變體。取fC、擊夾失或力。成可以涉及一個或多個核苷酸。可以在 編碼區、非編碼區、或兩者中改變變體。在編碼區中的變化可以產 生保守或非保守胺基酸取代、缺失或加成。其中尤其優選的是沉默 取代、加成以及缺失，其並不改變本文披露的突變體ALK多肽的 性能和活性(例如，激酶活性)。在這方面還尤其優選的是保守取 代。
本發明的進一步的實施方式包4舌分離的多核苷酸，其包含至少 90%相同於，以及更優選至少95%、 96%、 97%、 98%或99%相同於本發明的突變體ALK多核苷酸的核苷酸序列(例如，編碼具有 圖2所示的完全胺基酸序列(SEQ ID NO: l)的EML4-ALK融合多肽 的核苷酸序列，或編碼EML-4的N端和ALK的糹敫酶結構Jt或的核香 酸序列(參見圖1，圖片B;以及圖3和4);或互補於上述典型序 列的核香酸)。
具有至少，例如，95% "相同"於參比衝亥苷酸序列(其編石馬突 變體ALK多肽)的核苷酸序列的多核苷酸是指，多核苷酸的核苷 酸序列相同於參比序列，只是對於參比核苷酸序列(其編碼突變體 ALK多肽)的每100個核苷酸，多核香酸序列可以包4舌多達5個點 突變。換言之，為了獲得其核苷酸序列至少95%相同於參比核苷酸 序列的多核苷酸，參比序列中的多達5%的核苷酸可以擊夬失或用另 一種核苷酸取^，或參比序列中的總核苷酸的多達5%的核苷酸可 以被插入參比序列。參比序列的這些突變可以發生在參比核苷酸序 列的5，或3，端位置或這些末端位置之間的任何地方，其單獨地散布
4妄組中。
事實上，可以利用已知計算枳4呈序如Bestfit禾呈序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711 )來常規地確定是否任何特定的核酸分子至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%相同於，例如，圖2A-B所示的核苷酸序列 (SEQIDNOs:2和19)或相同於上述沉積的cDNA克隆的核香酸 序列。Bestfit釆用Smith和Waterman的局部同源算法，^c/wwces
Ma麼'482-489 (1981)，來發現兩個序列之間的最好 同源節段。當利用Bestfit或任何其它序列對比程序來確定特定序列 是否，例如，95%相同於才艮據本發明的參比EML4-ALK融合多核苷 酸序列或截短的ALK多核苷酸序列時，當然要設置參數，使得相 對於參比核苷酸序列的全長來計算同一性的百分比，以及在參比序 列中多達核苷酸總數5%的同源缺口 (間隙)是允許的。
30本發明在其範圍內包括這樣的核酸分子，其至少90%、 95%、 96% 、 97% 、 98%或99%相同於圖2所示的核酸序列(SEQ ID NO: 2 )， 或相同於沉積的cDNA的核酸序列，而不考慮它們是否編碼具有 ALK激酶活性的多肽。這是因為，甚至在特定核酸分子並不編碼具 有ALK激酶活性的融合多肽的情況下，本領域技術人員將仍然知 道如何將核酸分子用作，例如，雜交探針或聚合酶鏈反應(PCR)引 物。本發明的並不編碼具有激酶的多肽的核酸分子的應用尤其包括 (1 )分離cDNA文庫中的EML4-ALK缺失基因、或截短的ALK 基因、或其等位基因變體；(2)原位雜交(例如，"FISH")於中期 染色體擴展(染色體鋪展，chromosomal spreads )以提供EML4-ALK 缺失基因或截短的ALK基因的精確的染色體位置，如在Verma w Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)中所描述的；以及RNA印跡分析，用於4企測 在特定組織中EML4-ALK融合蛋白或截短的ALK激酶mRNA的 表達。
然而，優選的核酸分子具有這樣的序列，這些序列至少95%相 同於本發明的突變體ALK多肽或相同於沉積的cDNA的核S臾序列， 其事實上編碼具有ALK激酶活性的融合多肽。上述活性可以類似 於，但不一定相同於本文披露的EML4-ALK融合蛋白(全長蛋白 質、成熟蛋白質、或保留激酶活性的蛋白質片段)的活性，如用特 定生物分4斤法測-彈的。例如，通過確定ALK ;粦酸4b—個或多個酪 氨酸(其包含肽底物，例如，胰島素受體底物1或2(IRS1, IRS2)， 其是ALK激酶的底物)的能力可以糹企查ALK的激酶活性。
由於遺傳密碼的簡併，本領域技術人員將立即認識到，大量的 具有的序列至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%、或99%相同於沉 積的cDNA的核酸序列或圖2A-B所示的核酸序列(SEQ IDNOs: 2 和19)的核酸分子將編碼具有ALK活性的突變體多肽。事實上， 因為這些核普酸序列的簡併變體都編碼相同的多肽，所以這對於本 領域技術人員是顯而易見的，即使沒有進行上述比較測定。在本領 域將進一步明了，對於這樣的並不是簡併變體的核酸分子，合理數 目的核酸分子將同樣編碼保留ALK激酶活性的多肽。這是因為本
31領域技術人員完全明了較少可能或不可能顯著影響蛋白質功能的 胺基酸取代(例如，用第二種脂族胺基酸代替一種脂族胺基酸)。
例如，關於如何進行表型沉默胺基酸取代的指導提供在Bowie ef <a/.， "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," 5Wewce 247.' 1306-1310 (1990)中，其描 述了兩種主要方式來研究胺基酸序列對變化的耐受性。第一種方法 依賴進化過程，其中通過自然選擇來接收或排斥突變。第二種方法 利用基因工程來在克隆的基因的特定位置《1入胺基酸變化，以及利
用選擇或篩選來鑑定保持功能的序列。這些研究已揭示了，蛋白質 驚人地耐受胺基酸取代。熟悉這種技術的技術人員還明了，在蛋白 質的一定位置，哪些胺基酸變化可能是允許的。例如，大多數隱蔽 胺基酸殘基需要非極性側鏈，而表面側鏈的^f艮少特徵通常是保守 的。其它上述表型沉默取代描述在Bowie " a/.(上文)，以及其中 引用的參考文獻中。
本領域中眾所周知的和一般可獲得的DNA序列分析的方法可 以用來實施本發明的任何多核普酸實施方式。該方法可以採用這樣 的酶如DNA聚合酶I的克林諾片斷、SEQUENASE (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio )、 Taq聚合酵(Perkin Elmer )、耐 熱T7聚合酶(Amersham， Chicago, IL )、或重組聚合酶和校正外切 片亥@臾酶的糹且合4口由Gibco BRL ( Gaithersburg， Md.)出售的 ELONGASE擴增系統。優選地，該過程是藉助於儀器自動進行， 如Hamilton Micro Lab 2200 ( Hamilton, Reno, Nev, )、 Peltier Thermal Cycler ( PTC200; MJ Research, AVatertown， Mass.)以及ABI 377 DNA 觀'J序4義(Perkin Elmer )。
編石馬本發明的突變體ALK多肽的多4亥普酸序列可以^吏用部分 核苷酸序列加以延伸並釆用本4頁i或已知的各種方法來4企測上遊序 列如啟動子和調節元件。例如，可以採用的一種方法，"限制位點，， PCR，使用通用引物來挽回(恢復，retrieve)相鄰於已知基因座的 未知序歹'J ( Sarkar, G., PC7 MeAoA^^//c. 2: 318-322 (1993))。尤其 是，在存在接頭序列的引物和對於已知區特異性的引物的情況下首先擴增基因組DNA。示例性的引物是那些在本文的實施例2中描 述的引物。擴增序列然後經受第二輪PCR，其中使用相同的接頭引 物和第一種引物內部的另一種特異性引物。藉助於適當的RNA聚 合酶轉錄每輪PCR的產物並利用反轉錄酶進行測序。
利用基於已知區的趨異性引物，反向PCR還可以用來擴增或 延4申序列(Triglia W a/., iVwc/e/c ^c,'A i 仏8186 (1988))。利用 OLIGO 4.06引4勿分才斤豐欠4牛(National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.)、或另一種適當的程序，引物可以被設計成長度為22-30個 核普酸，具有50%或更大的GC含量，以及在約68-72。C的溫度下 退火成靶序列。該方法使用多種限制酶以在基因的已知區域中產生 適當的片斷。然後通過分子內連接反應環化該片斷並用作PCR模 板。
可以使用的另 一種方法是捕捉PCR，其涉及DNA片斷的PCR 擴增，其中DNA片斷相鄰於人和酵母人工染色體DNA中的已知序 歹'J (Lagerstrom " ,屍C7 Afe六111畫119 (1991))。在該 方法中，多限制酶消化和連接作用還可以用來在進行PCR以前將工 程雙鏈序列i文入DNA分子的未知部分中。可以用來4免回未知序列 的另一種方；去是4苗述在 Parker " "/., 7Vwc/e/c Jc/ds 79: 3055-3060 (1991)中的方法。另外，可以使用PCR、套式引物、以及 PROMOTERFINDER⑧文庫來步查(walk in )基因組DNA( Clontech, Palo Alto, Calif.)。這種方法避免需要篩選文庫並且可用於發現內含 子/外顯子接頭。
當篩選全長cDNA時，優選使用已大小選擇的文庫以包括更大 的cDNA。並且，隨機引物文庫是優選的，因為它們將包含更多序 列，其包含基因的5，區。隨才幾引物文庫可以尤其優選用於這樣的情 況，其中寡d(T)文庫並不產生全長cDNA。基因組文庫可以用於延 伸序列到5，和3'非轉錄調控區。
可商業上獲得的毛細管電泳系統可以用來分析測序或PCR產 物的大小或證實測序或PCR產物的核苷酸序列。尤其是，毛細管測
33序可以採用用於電泳分離的可流動聚合物，；敫光活化的四種不同的 螢光染料(對於每種核苷酸用一種)，以及通過電荷耦合器件照相
機檢測發射波長。利用適當的軟體(例如，GENOTYPERtm和 SEQUENCE NAVIGATORtm , Perkin Elmer)可以將車#出/光強度轉 換成電信號並且可以計算機控制從裝載樣品到計算機分析和電子 悽t據顯示的整個過程。毛細管電泳尤其優選用於小片DNA(可能 以有限量存在於特定樣品中)的測序。
C.載體和宿主細胞
本發明還4是供重組載體，其包含本發明的分離的多核苷酸； 宿主細胞，其是藉助於重組載體而基因工程的；以及通過重組:技術， 重組EML4-ALK多肽或其片斷的生產。
利用眾所周知的技術如侵染、轉導、轉染、轉位、電穿孔以及 轉化，可以將重組構建物引入到宿主細胞中。載體可以是，例如， 噬菌體、質粒、病毒或反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可以是可 複製的或複製缺陷的。在後一種情況下，病毒繁殖通常將僅發生在 互4卜宿主細月包中。
可以將多核苷酸連接於包含用於在宿主中繁殖的選擇性標記 的載體。通常，在沉澱物中，如^粦酸4丐沉澱物，或在與帶電荷脂質 的複合物中，引入質粒載體。如果載體是病毒，則利用適當的包裝 細胞系，它可以被體外包裝，然後^皮轉導到宿主細力包中。
優選包括相對於感興趣的多核苷酸的順式作用調控區的載體。 在引入宿主以後，適當的反式作用因子可以由宿主供》合，由互4卜載 體供給或由載體本身供給。關於這點，在某些優選的實施方式中， 載體提供特異性表達，其可以是可誘導的和/或細胞類型特異性的。 在上述載體中特別優選的是那些通過容易控制的環境因素(如溫度 和營養添加劑)可誘導的載體。
可用於本發明的表達載體包括衍生自染色體的載體、衍生自附 加體的載體以及衍生自病毒的載體，例如，衍生自細菌質粒、噬菌
34體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如杆狀病毒、乳多空病 毒、痘苗病毒、)腺病毒、雞痘病毒、作i狂犬病病毒以及反轉錄病毒) 的載體，以及衍生自其組合的載體，如黏粒和噬菌粒。
包含本發明的EML4-ALK多核苷酸的DNA插入片^殳應操:作性 地連4妄於適當的啟動子，如X噬菌體PL啟動子，大腸桿菌lac、 trp 以及tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子以及反轉錄病毒LTR的 啟動子(僅列舉幾種)。其它適宜的啟動子是本領域4支術人員已知 的。表達構建物將進一步包括轉錄起始位點，終止位點，以及在轉 錄區用於翻譯的核糖體結合位點。由構建物表達的成熟轉錄物的編 碼部分將優選包括在最初起始的翻i奪和終止密碼子(UAA、 UGA
或UAG )，其適當地定位在待翻i爭的多肽的末端。
如所指出的，表達載體將優選包括至少一種選擇性標記。這樣 的標記包括二氫葉酸還原酶或用於真核細"包i咅養的新黴素抗性基 因以及用於大腸桿菌和其它細菌中培養的四環素或氨節青酶素抗 性基因。適當宿主的代表性實例包括但不限於細菌細胞，如大腸杆 菌、鏈黴菌以及鼠傷寒沙門氏桿菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞； 昆蟲細胞如果蠅S2和夜蛾Sf9細胞；動物細胞如CHO、 COS以及 Bowes黑色素瘤細月包；以及才直物細月包。用於上述宿主細胞的適當的 培養基和條件在本領域是已知的。
在載體中，優選供細菌之用的載體包括可獲自Qiagen的 pQE70、pQE60禾口 pQE-9;可獲自Stratagene的pBS載體、Phagescript 載體、Bluescript載體、pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A;以 及可獲自Pharmacia的ptrc99a、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540、 pRIT5。其中優選的真核載體是可獲自Stratagene的pWLNEO、 pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG;以及可獲自Pharmacia的pSVK3、 pBPV、 pMSG和pSVL。其它適宜的載體對於本領域技術人員來說 將是顯而易見的。
在適合於供本發明之用的已知細菌啟動子中包括大腸桿菌lacl 和lacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、人PR和PL啟動子
35以及trp啟動子。適宜的真核啟動子包4舌CMV立即早期啟動子、 HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒LTR 的啟動子，如勞氏肉瘤病毒(RSV)的啟動子、以及金屬硫蛋白啟動 子，如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。
在酵母(釀酒酵母)中，可以^吏用多種載體，其包含組成型或 -漆導型啟動子如oc因子、乙醇氧化酶、以及PGH。關於綜述，參 見Ausubel " (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant Me^o<^y五w2y附0/.
"丄516-544 (1997)。
可以通過磷酸釣轉染、DEAE-葡聚糖介導轉染、陽離子脂質介 導轉染、電穿孔、轉導、侵染或其它方法來實現將構建物引入宿主 細胞。這樣的方法描述在許多標準實驗室手冊中，如Davis " a/., Basic Methods In Molecular Biology (1986)。
可以通過將增強子序列插入到載體中來增加DNA的轉錄，其 中DNA通過高等真核生物編碼本發明的EML4-ALK融合多肽。增 強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，其用來在^合定 的宿主細胞類型中增加啟動子的轉錄活性。增強子的實例包括 SV40增強子，其位於複製起點的後側(late side)(在鹼基對100 至270處)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在複製起點的後側上 的多瘤增強子，以及l^病毒增強子。
為了將翻譯蛋白分泌進入內質網的腔、進入周質間隙或進入胞 外環境，可以將適當的分泌信號加入到表達多肽中。該信號對於多 肽而言可以是內源的或它們可以是異源信號。
可以以-修飾形式，如融合蛋白(例如，GST-融合)，來表達多 肽，並且不l又可以包括分泌信號，而且包括另外的異源功能區。例 如，可以將另外的胺基酸(尤其是帶電荷的胺基酸)區加入到多肽 的N端中以在純化期間或在隨後的處理和貯存期間改善在宿主細 胞中的穩定性和持久性。同樣地，可以將肽部分加入到多肽中以促 進純化。可以在多肽的最終製備以後除去這樣的區域。將肽部分加
36入到多肽以引起分泌或排洩，從而改善穩定性以及促進純化(除了 別的之外)，在本領域是熟悉和常身見的技術。優選的融合蛋白包含 來自免疫球蛋白的異源區，其可用來溶解蛋白質。
通過眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離 子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、
羥基磷灰石層析和凝集素層析，EML4-ALK融合多肽可以回收和純 化自重組細胞培養物。更優選地，高效液相層析("HPLC")用於 純化。本發明的多肽包括天然純化產物，化學合成步驟的產物，以 及通過重組技術由原核生物或真核生物宿主產生的產物，其中上述 宿主包括，例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲以及哺乳動物細月包。 取決於在重組生產過程中採用的宿主，本發明的多肽可以是淨唐基化 的或可以是非糖基化的。此外，本發明的多肽還可以包括最初<奮飾 的曱硫氨酸殘基，在某些情況下作為宿主介導過程的結果。
因此，在一種實施方式中，本發明提供了一種通過在適合於表 達融合多肽的條件下培養重組宿主細胞並回收(恢復，recover)多 肽而用於產生重組EML4-ALK融合多肽的方法，如下所述。適合 於宿主細胞生長和從上述細胞表達重組多肽的培養條件是本領域 才支術人員^口的。參見，侈寸^口 ， Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM o/" eds., Volume 2， Chapter 16, Wiley Interscience。
D.分離的多狀
本發明還部分地提供了分離的突變體ALK激酶多肽以及其片 斷。在一種實施方式中，本發明提供了一種分離的多肽，該多肽包 含一種胺基酸序列，而該胺基酸序列至少95%相同於選自由以下組 成的組的序列
(a )編碼包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的胺基酸序列 的EML4-ALK融合多肽的胺基酸序列；(b )編碼EML4-ALK融合多肽的胺基酸序列，該EML4-ALK 融合多肽包含EML-4的N端氨基*列(SEQ ID NO: 3的殘基 1-233或SEQ ID NO: 3的殘基1-495 )以及ALK的激酶結構域(SEQ ID NO: 5的殘基1116-1383 );以及
(c )編碼多肽的胺基酸序列，該多肽包含圍繞EML4-ALK融 合多肽的融合接頭(SEQ ID NO: 1的殘基233-234或SEQ ID NO: 18 的殘基495-496 )的至少6個鄰接胺基酸。
在一種優選的實施方式中，4是供了本發明的重組突變體ALK 多肽，如上所述，其可以利用重組載體或重組宿主細月包來產生。
本領域中應當明了 ，可以變化EML4-ALK融合多肽或截短的 活性ALK激酶多肽的某些胺基酸序列而不會顯著影響突變體蛋白 質的結構或功能。如果設想在序列中的上述差異，則應當記住，在 蛋白質上將存在關鍵區域，其決定活性(例如，ALK的激酶結構域)。 通常，可以取代形成三級結構的殘基，只要使用了執行類似功能的 殘基。在其它情況下，如果變化發生在蛋白質的非關鍵區，則殘基 的類型可以是完全不重要的。
因此，本發明進一步包括EML4-ALK融合多肽的變化，其保 留基本的ALK激酶活性或其包括EML-4或ALK蛋白質的其它區， 如下文討i侖的蛋白質部分。這樣的突變體包括缺失、插入、倒位、 重複、以及類型取代(例如，用一種親水殘基取代另一種親水殘基， 但通常不用強親水殘基取代強疏水殘基)。較小變化或上述"中性" 胺基酸取代將通常對活性幾乎沒有影響。
通常看作保守取代的是脂族胺基酸Ala、 Val、 Leu以及lie之 間的彼此替代，羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu 的交換，醯胺殘基Asn和Gin之間的取代，石威性殘基Lys和Arg的 交換以及芳族殘基Phe、 Tyr之間的替代。本領域技術人員已知的保 守胺基酸取代的實例是芳族苯丙氨酸色氨酸酪氨酸；疏水的 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸；極性的穀氨醯胺天冬醯胺；鹼性的精 氨酸賴氨酸組氨酸；酸性的天冬氨酸穀氨酸；較小的丙氨酸絲
38氨酸蘇氨酸甲碌^氨酸甘氨酸。如上面詳細i兌明的，關於哪些胺基酸 變化可能是表型沉默的(即，不可能對功能具有顯著的有害影響)
的進一步指導可以在Bowie ef Science 247，上文中找到。
優選以分離的形式提供本發明的多肽，並且優選基本上是純化 的。重組產生的本發明的EML4-ALK融合多肽的變體可以通過在 Smith和Johnson,67.. 31-40 (1988)中描述的一步法基本上加以純化。
本發明的多肽包括圖2A-B的EML4-ALK融合多肽(SEQ ID NOs: 1和18 )(不管包括還是不包括前導序列)；胺基酸序列，該序 列編碼EML4-ALK融合多肽，其包含EML-4的N端胺基酸序列 (SEQ ID NO: 3的殘基1-233或SEQ ID NO: 3的殘基1-495 )和 ALK的激酶結構域(SEQ ID NO: 5的殘基1116-1383 );和胺基酸 序列，該序列編碼多肽，其包含圍繞EML4-ALK融合多肽的融合 接頭(SEQ ID NO: 1的殘基233-234或SEQ ID NO: 18的殘基 495-496)的至少6個鄰接胺基酸(還參見圖1A-B，底部圖片)；以 及這樣的多肽，其至少90%，優選至少95%,以及進一步更優選至 少96%、 97%、 98%或99%相似於上述多肽。
兩種多肽的"％相似性"是指相似性得分，其是通過利用Bestfit 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711 )和用於確定相似性的默認設置來比4交兩 種多肽的胺基酸序列而產生的。Bestfit使用Smith和Waterman的局 吾卩同源算法(力dva"ces /"^^//^/A/aAew""" 2z 482-489 (1981))來 發現兩種序列之間相似性最好的區段。
具有的胺基酸序列至少，例如，95% "相同"於本發明的 EML4-ALK融合多肽的參比胺基酸序列的多肽是指，多肽的胺基酸 序列相同於參比序列，只是對於突變體ALK多肽的參比胺基酸序 列的每100個胺基酸，多肽序列可以包括多達5個胺基酸變化。換 言之，為了獲得具有的胺基酸序列至少95%相同於參比胺基酸序列 的多肽，在參比序列中的多達5%的胺基酸殘基可以擊夾失或用另一種胺基酸取代，或在參比序列中總胺基酸殘基的多達5%的胺基酸 可以一皮插入到參比序列中。參比序列的這些變化可以發生在參比氨 基酸序列的氨基或羧基末端位置或發生在那些末端位置之間的任
內的一個或多個鄰4妾基團中。
當利用Bestfit或任何其它序列對比程序來確定特定序列是否， 例如，95%相同於根據本發明的參比序列時，當然要設置參數，使 得相對於參比氨基S臾序列的全長來計算同一性百分比，以及在同源 方面多達5%的參比序列中胺基酸殘基總數的缺口 (間隙)是允許 的。
本發明的EML4-ALK融合多肽可以用作SDS-PAGE凝膠或分 子篩凝月交過濾柱上的分子量標記，例如，利用本領域4支術人員熟知 的方法。
如下文進一步詳細描述的，本發明的多肽還可以用來產生融合 多肽特異試劑，如多克隆和單克隆抗體，或截短的多肽特異試劑， 其可用於測定來4全測突變體ALK多肽表達(如下所述)，或作為能 夠增強或抑制突變體ALK蛋白質的功能/活性的激動劑和拮抗劑。 另外，這樣的多肽可以用於酵母雙雜交系統以"捕衝足"EML4-ALK 融合多肽或截短的ALK激酶多肽結合蛋白，其還是才艮據本發明的 《吳選激動劑和4吉抗劑。該酵母^又雜交系統4苗述在Fields和Song, iV"&M 340: 245-246 (1989)中。
在另一個方面，本發明提供了一種肽或多肽，其包含本發明的 多肽的含有表4立的部分，例如，包含EML4-ALK融合多肽的融合 接頭的表位(參見圖1A-B，底部圖片)。這種多肽部分的表位是本 發明的多肽的免疫原性或抗原性表位。"免疫原性表位"被定義為 一部分蛋白質，當全蛋白是免疫原時其誘導抗體應答。這些免疫原 性表位^皮i人為限於分子上的幾個位置。另一方面，抗體可以結合的 蛋白質分子的區域被定義為"抗原性表位"。蛋白質的免疫原性表 <立的ft目通常少於抗原性表4立的目。參見，例如，Gey sen w a/.，
40屍rac. JV"//.」cfld 5W. S六3998-4002 (1983)。下文更詳細地描述 了本發明的融合多肽特異性抗體的生產。
由含有抗原性表位的肽或多肽引起的抗體可用來檢測才莫擬蛋 白質，而不同肽的抗體可以用於跟蹤蛋白質前體的不同區的命運， 其中蛋白質前體經受翻譯後加工。肽和抗肽抗體可以用於各種各樣 的用於才莫擬蛋白質的定性或定量測定，例如在竟爭測定中，因為研 究表明，在免疫沉澱測定中，甚至較短的肽(例如，約9個胺基酸) 可以結合和代替更大的肽。參見，例如，Wilson W Ce〃 37, 767-778 (1984) at777。本發明的抗肽抗體還可用於才莫擬蛋白質的純 化，例如，通過吸附層析，其中利用本領i或眾所周知的方法。下文 更詳細;也描述免疫測定形式。
重糹且突變體ALK多肽也在本發明的範圍內，並且可以利用本 發明的多核苷酸來生產，如在上文部分B中所描述的。例如，本發 明部分地提供了 一種通過在適合於表達融合多肽和回收多肽的條 件下培養重組宿主細胞(如上所述)來生產重組EML4-ALK融合多
肽的方法。適合於宿主細胞的生長和從上述細胞表達重組多肽的培 養條件是本領域技術人員熟知的。
E.突變體特異性試劑
可用於實施所4皮露方法的突變體ALK多肽特異性試劑尤其包 括融合多肽特異性抗體和AQUA肽(重同位素標記肽)，其對應於、 以及適合於檢測和量化在生物樣品中的EML4-ALK融合多肽表達， 其中生物樣品來自癌症，如哺乳動物的實體肉瘤或腫瘤。同樣有用 的是截短特異性試劑，如抗體、AQUA肽、或核酸糹笨4十，其適合於 檢測是否存在本發明的截短的ALK激酶多核苷酸或多肽。融合多 肽特異性試劑是任何試劑(生物的或化學的)，其能夠特異性地結 合於、才企測和/或量化在生物樣品中的已表達的EML4-ALK融合多 肽的存在/水平。該術語包括但不限於下文討論的優選的抗體和 AQUA肽試劑，以及等效試劑是在本發明的範圍內。
41抗體
適合於供實施本發明的方法使用的試劑包括EML4-ALK融合 多肽特異性抗體和TFG-ALK融合多肽特異性抗體。本發明的融合 特異性抗體是分離的一個抗體或多個抗體，其特異性地結合本發明 的EML4-ALK融合多肽(例如，SEQ ID NO: 1 )但並不顯著地結 合野生型EML-4或野生型ALK,或特異性地結合本文描述的 TFG-ALK融合多肽(例如，SEQ ID NO: 20 )但並不顯著地結合野 生型TFG或野生型ALK。其它適宜的試劑包括表位特異性抗體， 其特異性地結合於野生型ALK蛋白質序列的胞外結構域中的表位 (該結構域並不存在於本文披露的截短的、活性ALK激酶中)，因 此能夠衝全測衝羊品中野生型ALK的有無。
人EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽特異性抗體還可以結合於 其它哺乳動物物種，例如鼠或兔中的高度同源的和相當的表位肽序 列，並且反之亦然。可用於實施本發明的方法的抗體包括(a)單 克隆抗體，(b)純化的多克隆抗體，其特異性地結合於靶多肽(例 如，EML4-ALK融合多肽(參見圖1A-B,底部圖片)或TFG-ALK 融合多肽(參見圖1C,底部圖片)的融合接頭，(c)如在以上(a) -(b)中所描述的抗體，其結合其它非人物種(例如，小鼠、大鼠) 中的相當的和高度同源的表位或磷酸化位點，以及(d)上述(a) -(c)的片斷，其結合於由本文披露的示例性抗體結合的抗原(或 更優選表位)。
如本文中所使用的，術語"抗體"是指所有類型的免疫球蛋白， 包4舌IgG、 IgM、 IgA、 IgD以及IgE。抗體可以是單克隆或多克隆 的並且可以具有<壬4可起源物種，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、馬 或人，或可以是嵌合4元體。參見，例如，M. Walker " a/., A/o/ec. 7w附wwo/. 26: 403-11 (1989); Morrision W a/" /Voc. iV<^7. Jcad. Sc/. S六 6851 (1984); Neuberger W a/.， A^fwre 3".. 604 (1984)。抗體可以是4姿 照在美國專利第4,474,893號(Reading)或美國專利第4,816,567號 (Cabilly a a/.)中所披露的方法製備的重組單克隆抗體。抗體還可以
42是按照在美國專利第4,676,980號(Segel " "/.)中所4皮露的方法製備 的化學構建的特異性抗體。
本發明的EML4-ALK融合多肽特異性抗體的優選表位位點是 肽片斷，其基本上包括人EML4-ALK融合多肽序列(SEQIDNOs: 1和18)的約11至17個胺基酸，該片斷圍繞融合4妄頭(其存在於 短變體融合蛋白中的殘基233-234處和長變體融合蛋白中的殘基 495-496處(參見圖1A-B(底部圖片))。應當明了，特異性地結合更 短或更長的圍繞EML4-ALK融合多肽的融合接頭的肽/表位的抗體 是在本發明的範圍內。
類似地，可用於實施所4皮露方法的TFG-ALK融合多肽特異性 抗體的優選表位位點是一種肽片斷，其基本上包括人TFG-ALK融 合多肽序列(SEQIDNO:20)的約11至17個胺基酸，該片斷圍繞 融合4妻頭(其存在於殘基137-138處)(參見圖1C(底部圖片)。
本發明並不限於使用抗體，而是包括相當的分子，如蛋白質結 合結構域或核酸適體，其以融合蛋白質或截短的蛋白質特異性方 式，基本上結合於可用於本發明的方法的EML4-ALK或TFG-ALK 融合多肽特異性抗體所結合的相同表位。參見，例如，Neubergere/ A^ww 372: 604 (1984)。在下文中進一步描述的本發明的方法 中，可以適當地釆用上述相當的非抗體試劑。
可用於實施本發明的方法的多克隆抗體可以4要照標準:技術加 以製備，其中按照已知方法，用圍繞所期望的融合蛋白質特異性表 位(例如，本文描述的ALK融合蛋白的融合接頭)的抗原免疫適 宜的動物(例如，兔、山羊等)，乂人動物收集免疫血清，,人免疫血 清分離多克隆抗體，以及純化具有期望特異性的多克隆抗體。抗原 可以是合成的包含期望表位序列的肽抗原，按照眾所周知的技術加 以選擇和才勾建。參見，侈寸嗩口， Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 5， p. 75-76， Harlow & Lane Eds" Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, MeAcxiy 五wz，o/ogy' 207 264-283 (1991); Merrifield， 爿附.C7^附.Soc. S5: 21-49 (1962))。 4口下文進一 步描述的，可以對如本文所述製備的多克隆抗體進行篩選和分離。
43單克隆抗體還可以有利地用於本發明的方法，並且可以4安照
Kohler和Milstein的眾所周知的技術，A^^w 265.. 495-97 (1975); Kohler and Milstein,五w/: /附膽wo/. (5: 511 (1976);還參見Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel a/. Eds. (1989), 用雜 交瘤細胞系加以生產。如此產生的單克隆抗體是高度特異性的，並 且改善本發明所提供的測定方法的選擇性和特異性。例如，可以將
包含適當抗原(例如，包含EML4-ALK融合多肽的融合接頭的合 成肽)的溶液注射到小鼠中，並在足夠時間(與常規4支術一致)以 後，處死小鼠並獲得脾細胞。然後，通常在存在聚乙二醇的情況下， 通過用骨髓瘤細胞融合它們來固定脾細胞，以產生雜交瘤細胞。兔 融合雜交瘤，例如，可以如在美國專利第5，675，063號(K. Knight， 1997年10月7日/>布)中所描述的來產生。然後在適宜的選4奪培 養基如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中生長雜交瘤細胞，並篩 選上清液以獲得具有期望特異性的單克隆抗體，如下所述。通過常 失見方法如沉澱、離子交換或親和層析等，可以,人組織培養上清液回 收分泌的糹元體。
通過本領i或才支術人員已知的重組技術，還可以在大腸桿菌中產 生單克隆Fab片斷。參見，例如，W.Huse，5We"ce2^5: 1275-81 (1989); Mullinax d A/^7爿c"d Sc/. <57: 8095 (1990)。 i口果一種同種
型的單克隆抗體優選用於特定用途，則可以通過利用用來分離類別 轉換變體的同胞選擇才支術，乂人分泌不同同種型的單克隆抗體的親4戈 雜交瘤，直接、通過從最初融合進行選擇、或二次製備來製備特定 的同種型(Steplewski, " a/.，屍rac. Jcad< 2, 8653 (1985);
Spira " /纖歸/. M"/zo成7(. 307 (1984))。結合單克隆抗體的 位點的抗原可以通過PCR加以克隆並且單鏈抗體產生為噬菌體展 示重組抗體或在大腸4幹菌中的可溶抗體(參見，例如，Antibody Engineering Protocols, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor )。
更進一步i也，美國專利第5,194,392號，Geysen (1990)描述了 才僉測或確定單體(胺基酸或其它化合物)的序列的一^:方法，該序 列是拓樸相當的表位(即，"模擬表位")，其互補於感興趣抗體的淨爭定互^hf立(糹元原結合〗立點)。更一顧:i也，該方法涉及4企測或確定 單體的序列，該序列是拓樸相當的配體，其互補於感興趣的特定受 體的配體結合位點。類似地，美國專利第5,480,971號，Houghten" (1996),披露了線性d-C-烷基全烷基化寡肽和這樣的肽的集合 和文庫，以及利用上述寡肽集合和文庫來確定全烷基化寡肽的序列 的方法，其中全烷基化寡肽優先結合於感興趣的受體分子。因此， 本發明的含有表位的肽的非肽類似物也可以通過這些方法常失見地 力口以製備。
可以按照標準技術並針對表位和融合蛋白特異性，來篩選可用 於本發明的方法的抗體(不管是多克隆或單克隆)。參見，例如， C，w汰"a/., M"Ws五wz，o/ogy'廁.'264-283 (1991)。例如，可 以相乂于于肽文庫並通過ELISA來篩選抗體以確^f呆對於所期望的抗 原的特異性，以及如果需要的^舌，確^f呆〗義與，例如，本發明的 EML4-ALK融合多肽而不與野生型EML-4或野生型ALK的反應性 的特異性。還可以通過相對於包含靶蛋白的細胞製劑的蛋白質印跡 來試驗抗體以證實僅與所期望的耙具有反應性以及確保沒有明顯 結合於涉及ALK的其它融合蛋白。融合蛋白特異性抗體的生產、 篩選、以及應用是本領域^支術人員已知的，並且已有描述。參見， 侈寸^口，美國專矛P^開號20050214301, Wetzel " "/., September 29， 2005。
可用於本發明的方法的融合多肽特異性抗體可以呈現與其它 融合蛋白中的類似融合表位或與野生型EML-4、野生型TFG、以及 野生型ALK(其形成融合接頭)中的表位的某些有限的交叉反應性。 這並不是意外的，因為大多數抗體呈現一定程度的交叉反應性，並 且抗肽抗體將經常與相對於免疫肽具有高同源性或同 一性的表位 進4亍交叉反應。參見，例3口， Czer"汝，上文。通過蛋白質印跡連同 已知分子量的標記可以容易地表徵與其它融合蛋白的交叉反應性。 可以檢查交叉反應蛋白質的胺基酸序列以鑑定高度同源於或相同 於EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽序列並且抗體與其結合的位
45點。通過陰性選擇並利用肽柱上的抗體純化可以除去不期望的交叉
反應性(例如，選出結合野生型EML-4和/或野生型ALK的抗體)。
可用於實施本文所4皮露方法的本發明的EML4-ALK融合多肽 特異性抗體(以及TFG-ALK融合多肽特異性抗體)對於人融合多 肽是理想地特異性的，但並不僅限於結合人類本身。本發明包括抗 體的生產和應用，其中抗體還結合其它哺乳動物物種(例如，小鼠、 大鼠、猴)的保守的和高度同源的或相同的表位。通過與本文4皮露 的人EML4-ALK融合多肽序列(SEQ ID NOs: 1和18 )或本文4皮露 的人TFG-ALK融合多肽序列(SEQ ID NO: 20 )進行標準序列比較， 如利用BLAST,可以容易地鑑定在其它物種中的高度同源的或相 同的序列。
可以通過在4爭定測定形式中的應用，例3口;;庇式細月包術(FC)、 免疫組織化學(IHC)、和/或免疫細胞化學(ICC)，來進一步表徵 和i正實在本發明的方法中採用的抗體。在下面的部分F中進一步描 述了在上述方法中ALK融合多肽特異性抗體的應用。抗體還可以 有利地共軛於螢光染料(例如，Alexa488、 PE )、或標記如量子點， 連同其它信號轉導(磷酸-AKT、磷酸-Erk 1/2 )和/或細胞標記物(細 胞角蛋白)抗體用於多參數分析，如在下面的部分F中進一步描述 的。
在實施本發明的方法時，利用這些野生型蛋白質的抗體(z疇酸 特異性或總抗體)還可以有利地檢查在給定生物樣品中野生型 EML-4、野生型TFG、和/或野生型ALK的表達和/或活性。例如， 總ALK和^岸酸化-位點特異性抗體可商業上獲^尋(參見Cell Signaling Technology, Inc., Beverly MA, 2005/06 Catalogue, #，s 3341,3342)。如上所述，還可以4姿照標準方法來產生上述4元體。公 開了人EML-4 、 TFG、以及ALK的胺基酸序列(參見圖3A和4A-4C, 以及參比的SwissProt Accession Nos. )， 4口同7>開了來自其它4勿種的 這些蛋白質的序列那樣。
在生物才羊品(例^。，月中瘤才羊品)中，5f生型EML-4、 TFG、以 及野生型ALK表達和/或激活的4企測，連同EML4-ALK和/或
46TFG-ALK融合多肽表達，可以4是供關於是否融合蛋白單獨驅動腫 瘤、或是否野生型ALK也^L激活並驅動腫瘤的信息。這樣的信息 臨床上可用於評估耙向融合蛋白或野生型蛋白質、或兩者，或可能 最有利於抑制腫瘤的進展，以及有利於選擇適當的療法或它們的組 合。對野生型ALK激酶胞外結構域特異的抗體(其並不存在於本 文披露的截短的活性ALK激酶中)，可以特別用於確定突變體ALK ;敫酶的有無。
應當明了，在實施上述方法時，可以4吏用多於一種的抗體。例 如，可以同時採用一種或多種EML4-ALK融合多肽特異性抗體連 同對於另一種激酶、受體、或激酶底物(在其中表達EML4-ALK 融合多肽的癌症中，其懷疑被、或潛在被激活)特異的一種或多種 抗體，以在包含來自上述癌症的細胞的生物樣品中才企測這樣的其它 信號分子的活性。
本領域技術人員將明了 ，上述本發明的EML4-ALK融合多肽
分恆定結構域，從而、產生嵌合多:。這些融合i白可促進純化並i
示出增加的體內半壽期(半衰期)。例如，對於由人CD4-多肽的開 始的兩個結構i或和哺乳動物免疫J求蛋白的重鏈或輕鏈的恆定區的 各種結構i或構成的嵌合蛋白，情況就是如此(EPA 394，827; Traunecker " a/., A^we 33/: 84-86 (1988))。具有二石克連接的二聚體 結構(由於IgG部分)的融合蛋白還可以比單獨的單體EML4-ALK 融合多肽更有效地結合和中和其它分子(Fountoulakis W "/., / 腸c/z， ， 3958-3964 (1995))。
重同4立素標i己肽(AOUA肽)
可用於實施所4皮露方法的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽特 異性試劑還可以包4舌重同位素標記肽，其適合於生物樣品中已表達 的ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的絕對量化。已描述了 AQUA肽的生產以及AQUA肽用於複雜混合物中蛋白質(AQUA ) 的絕對量4b。參見WO/03016861， "Absolute Quantification of Proteinsand Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi W a/.以及Gerber " a/.淑/. JcW. t/.S.A ， . 6940-5 (2003) (將其教導的全部內容以引用方式結合於本文)。
AQUA方法採用將已知量的至少一種重同位素標記肽標準(其
品中，以《更通過與肽標準的比4交來確定生物才羊品中具有相同序列和 蛋白質修飾的肽的絕對量。簡單地i兌，AQUA方法具有兩個階,殳 肽內標準選4奪和i正實以及方法開發；以及利用i正實的肽內標準進4亍 實施以檢測和量化樣品中的耙蛋白。該方法是一種有力的技術，用 於檢測和量化在複雜的生物混合物中的給定肽/蛋白質，如細胞溶胞 產物，並且可以用來，例如，量化由於藥物處理而引起的蛋白質磷 酸化的變化，或量化在不同生物狀態蛋白質水平的差異。
通常，為了開發適宜的內標準，基於其胺基酸序列和用來消化 的特定蛋白酶，選擇在靶蛋白質序列內的特定肽(或修飾肽)。然 後通過固相肽合成產生該肽，使得 一 個殘基被相同的包含穩定同位 素(13C、 15N)的殘基替代。結果是這樣的肽，其化學上相同於通 過蛋白水解形成的其天然配對物，但容易通過MS並藉助於7-Da 質量移動加以區分。然後通過LC-MS/MS評估新合成的AQUA內 標準肽。通過反向層析、電離效率、以及藉助於碰撞誘導解離的片 段化，該方法提供了關於肽保留的定性信息。選擇用於天然和內標 準肽集合的信息和豐富的片斷離子，然後作為層析保留的函數快速 連續加以具體監測以形成基於肽標準的獨特分布的選擇反應監測
(LC-SRM)方法。
AQUA策略的第二階段是其實施以測量來自複雜混合物的蛋 白或《務飾蛋白的量。通常通過SDS-PAGE凝月交電泳來分級分離全細 胞溶胞產物，然後切除與蛋白質遷移一致的凝膠區。該過程以後接 著是在有AQUA肽存在的情況下進行凝膠內蛋白水解以及 LC-SRM分析(參見Gerber W 上文)。將AQUA肽摻加(穿刺， spiked )到通過用蛋白酶消化全細胞溶胞產物所獲得的複雜肽混合 物，然後經受免疫親和純化，如上所述。通過消化(例如胰蛋白酶消化)形成的天然肽的〗呆留時間和片,殳化才莫式相同於先前確定的
AQUA內標準肽；因此，利用SRM實驗的LC-MS/MS分衝斤導致內 標準和直接來自極端複雜肽混合物的分析物的高度特異和敏感的測量。
因為加入AQUA肽的絕對量(例如，250 fmol),所以曲線下 面的面積比可以用來確定在最初細月包溶月包產物中蛋白質或蛋白質 的磷酸化形式的精確的表達水平。此外，在凝膠內消化過程中當形 成天然肽時，內標準是存在的，使得從凝膠片的肽4是取效率、樣品 處理(包括真空離心)過程中的絕對損失、以及在引入LC-MS系 統期間的易變性並不影響天然和AQUA肽豐度的確定的比率。
開發了 一種AQUA肽標準，其用於通過IAP-LC-MS/MS方法 先前在靶蛋白內鑑定的已知序列。如果位點被》務飾，則可以開發一 種AQUA肽，其在位點內摻入特定殘基的修飾形式；以及開發第二 種AQUA肽，其摻入殘基的未修飾形式。以這種方式，兩種標準可 以用來檢觀'J和量化在生物樣品中位點的修飾和未修飾形式兩者。
還可以通過檢查蛋白質的基本胺基酸序列和確定由蛋白酶剪 切產生的肽的邊界來產生肽內標準。可替4奐地，可以用蛋白酶實際 消化蛋白質，然後可以對產生的特定肽片斷進4亍測序。適宜的蛋白 酶包括但不限於絲氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶， 一種與膜締合的 絲氨酸蛋白酶)、金屬蛋白水解酶(例如，PUMP1 )、胰凝乳蛋白酶、 組織蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶等。
按照一個或多個準則選擇靶蛋白內的肽序列，以優化使用該肽 作為內標準。優選地，選擇肽的大小以將在其它非輩巴蛋白中重複肽 序列的機會降到最低程度。因此，肽優選為至少約6個胺基酸。還 優化肽的大小以4吏電離頻率最大化。因此，比約20個胺基酸更長 的肽並不是優選的。優選的範圍為約7至15個胺基酸。還選4奪在 質"i普法過考呈中不可能是化學活性的肽序列，因此避免包含半胱氨 酸、色氨酸、或曱硫氨酸的序列。
49可以選擇並不包括靶區的修飾區的肽序列，使得肽內標準可以 用來確定蛋白質的所有形式的量。可替換地，圍繞修飾胺基酸的肽
內標準可以期望用來^U企測和量化革巴蛋白的修_飾形式。可以一起4吏
用用於》f飾和未^f奮飾區兩者的肽標準，以確定在特定才羊品中 <奮飾的 程度(即，確定修飾形式相當於蛋白質總量的多少部分)。例如， 用於已知在特定位點被磷酸化的蛋白質的磷酸化和非磷酸化形式 兩者的肽標準可以用來量化才羊品中石粦酸化形式的量。
利用一種或多種標記胺基酸來標記肽(即，標記是肽的實際部
分)，或4交少伊0選:l也可以在4要照標準方法合成以後連4妄才示i己。優選
地，標記是基於以下考慮事項所選擇的質量變化標記質量應是只
有移動片斷質量才有的，其中移動片斷質量是對低本底的光譜區進
4亍MS分析所產生的；離子質量特4i成分是標記部分的一部分，其 在MS分析中優選呈現獨特的離子質量特4正；標記的組分原子的質 量總和優選獨特地不同於所有可能的胺基酸的片斷。因此，通過在 所得到的質譜中的離子/質量模式，標記胺基酸和肽容易與未標記的 分開。優選地，離子質量特徵成分將質量賦予並不匹配4壬何20種 天然胺基酸的殘基質量的蛋白質片斷。
標記在MS的片革殳化條件下應是耐用的並且不會經受不利的片 段化。在一定範圍的條件下，尤其是在變性條件下，標記化學性能 應是有效的，並且標記標誌優選仍然可溶於所選4奪的MS 1￡衝系統 中。標記優選並不抑制蛋白質的電離效率並且不是化學活性的。標 記可以包含兩種或更多種同位素不同的物質的混合物以在每個標 記片斷位置產生獨特的質譜才莫式。穩定同位素，如2H、 13C、 15N、 17o、 180、或"S，屬於優選的標記。還可以製備摻入不同同位素標 記的肽內標準對。重同位素標記可以摻入其中的優選的胺基酸殘基 包括亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸以及苯丙氨酸。
按照它們的質荷(m/z)比，以及優選地還按照它們在色i普柱(例 如，HPLC柱)上的保留時間來表徵肽內標準。與相同序列的未標 記肽共洗脫的內標準^皮選擇為最佳內標準。然後通過任何適當的方 式，例如通過利用例如氬或氦作為碰撞氣體的碰撞誘導解離(CID)對肽進4亍分割，來分衝斤內標準。然後例如通過多級質"i普法(MSn)對 片斷進行分析，以獲得片斷離子i普，乂人而獲得肽片^殳化特^正。優選 地，肽片斷具有顯著的m/z比差異，以使得峰值對應於每個很好分 開的片斷，以及獲得靶肽特有的特徵。如果在第一階段未獲得適宜 的片斷特徵，則進行MS的另一階段，直到獲得獨特的特徵。
MS/MS和MSS譜中的片斷離子對於感興趣的肽通常是高度特 異的，並且，連同LC方法，可以高度選擇性地檢測和量化複雜蛋 白質混合物，如細胞溶胞產物，中的靶肽/蛋白質，其中細胞溶胞產 物包含悽t千或上萬種蛋白質。可以測定潛在地包含感興趣的革巴蛋白 /肽的任何生物樣品。優選採用粗製或部分純化的細胞提取物。通常， 樣品具有至少0.01 mg的蛋白質，通常濃度為0.1-10 mg/mL，並且 可以調節到期望的緩沖濃度和pH。
然後將對應於待檢測/量化的靶蛋白的已知量的標記肽內標準， 優選約10飛摩爾，加入到生物樣品，如細胞溶胞產物中。然後用 一種或多種蛋白酶消化摻加樣品適當的時間，以允許進行消化。然 後進4亍分離(例3口，通過HPLC、反才目HPLC、毛細管電;永、離子 交換層衝斤法等)以乂人才羊品中的其它肽分離標記內標準和其相應的靶 肽。樣t毛細管LC是一種優選的方法。
然後通過監測MS中的選擇反應來檢查每種分離的肽。這涉及 利用通過表4正肽內標準所獲得的先前知識，然後獲得MS,以連續 監測在MS/MS或MS"譜用於感興趣的肽和內標準兩者的特定離子。 在洗脫以後，計算肽標準和草巴肽峰的曲線下的面積(AUC)。兩個 面積的比率提供絕對量化，其可以加以歸一化，以獲得在分衝斤中佳: 用的細胞數目和蛋白質的分子量，從而提供每個細胞的精確的蛋白 質拷貝數。AQUA方法的進一步的細節描述在Gygi " 以及Gerber 上文中。
如上所述，可以期望製備AQUA內肽標準(重同位素標記肽) 以檢測和量化在本發明的突變體ALK多肽內的任何獨特位點(例 如，所4皮露的EML4-ALK融合多肽內的融合4妄頭)。例如，可以制
51備AQUA磷酸肽，其對應於EML4-ALK融合多肽的融合接頭序列 (參見圖1A-B(底部圖片))或其對應於EML4、 TFG、或ALK的 截殺豆點。肽才示準例:^可以產生用於EML4-ALK或TFG-ALK融合4妄 頭並且在AQUA方法中這樣的標準用來檢測和量化生物樣品中的 融合接頭(即，EML4-ALK融合多肽的存在)。
例如，本發明的示例性的AQUA肽包括胺基酸序列INQVYR (參見圖1，底部圖片)，其對應於直接地旁側EML4-ALK融合多 肽中的融合接頭的每個位點的三個胺基酸(參見SEQ ID NO: 7 )。 應當明了，還可以構建包含融合接頭序列(和另外的殘基，其下遊 或上遊)的更大的AQUA肽。類似地，可以可替換地構建更小的 AQUA肽，其包含少於上述序列的所有殘基U旦仍然包含融合4妾頭 本身的點)。上述更大或更短的AQUA肽在本發明的範圍內，並且 可以如上所述進行優選AQUA肽的選擇和生產(參見Gygi " "/., Gerber ", 上文)。
核酸探針
如在上述部分B中詳細描述的，由本發明提供的融合特異性試 劑還包括適合於檢測EML4-ALK多核苷酸或截短的ALK激酶多核 普酸的核酸探針和引物。上述期望的探針其中包括斷裂點探針，該 斷裂點l採4十隻於應於產生融合的野生型EML4和/或野生型ALK基因 中的斷裂點的兩側。在下面的部分F中描述了在測定中上述探針的 特定應用，如螢光原位雜交(FISH)或聚合酶鏈反應(PCR)擴增。 可以製備類似的斷裂點:探針以檢測TFG-ALK融合多核苷酸的存在 (參見圖1C(SEQIDNO:21))。
F.診斷應用和測定形式
可以以本領域技術人員已知的各種各樣的不同測定形式來實 施本發明的方法。
52免疫測定
多相免疫測定。在均相測定中，免疫反應通常涉及突變體ALK激 酶多肽-特異性試劑(例如，EML4-ALK融合多肽-特異性抗體)、 標記分析物、以及感興趣的生物樣品。在抗體結合於標記分析物以 後，產生自標記的信號被直接或間接地修飾。在均相溶液中進行免 疫反應和檢測其程度兩者。可以釆用的免疫化學標記包括自由基、 》文射性同位素、螢光染坤+、酶、噬菌體、輔酶等。還可以有利地採 用半導體納米晶體標記、或"量子點"，並且它們的製備和應用已得 到4艮好的描述。 一般i也參見，K. Barovsky, iV""ofec/z. Law cfe Article 14 (2004)以及其中引用的專利。
在多相測定方式中，試劑通常是生物樣品， 一種突變體ALK 激酶多肽-特異性試劑(例如，EML4-ALK融合特異性抗體)，以及 用於產生可檢測信號的適宜方式。可以使用如下文進一步描述的生 物樣品。抗體通常^皮固定在載體上，如珠、平4反或載玻片，並且接 觸在液相中的懷疑包含抗原的樣品。然後從液相中分離載體，並採 用用於產生這才羊的信號的方式來4企查載體相或液相的可4全測信號。 該信號與生物樣品中分析物的存在有關。用於產生可檢測信號的方 式包括W吏用放射性標記、螢光標記、酶標記、量子點等。例如，如 果待檢測的抗原包含第二結合位點，則在分離步驟以前，結合於該 位點的抗體可以共軛於可4企測基團並加入到液相反應溶液中。在固 體載體上可檢測基團的存在表明在試-驗樣品中存在抗原。適宜的免 疫測定的實例是放射免疫測定、免疫螢光方法、酶聯免疫測定等。
可以用於實施本文糹皮露的方法的免疫測定形式及其變化在本 4貞i或是眾戶斤周^口的。通常參見E. Maggio， Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., BocaRaton，Fla.);還參見，例如，美國專利 第 4,727,022 號 (Skold W a/., " Methods for Modulating Ligand畫Receptor Interactions and their Application"); 美國專矛J第 4,659,678號(Forrest e/1 a/" "Immunoassay of Antigens"); 美國專 矛J第 4,376,110 號(David & a/.," Immunometric Assays UsingMonoclonal Antibodies")。適合於形成試劑-抗體複合物的條件是本 領域技術人員熟知的。參見同前。EML4-ALK融合多肽-特異性單 克隆抗體可以用於"兩4立點，，或"夾心，，測定，其中單雜交瘤細月包 系作為標記單克隆抗體和結合單克隆抗體兩者的來源。這才羊的測定 描述於美國專利第4,376,110號中。可檢測試劑的濃度應是足夠的， 4吏得和本底相比可以4全測EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的結 合。
^安照已知^支術，如沉澱，可用於實施本文所4皮露方法的抗體可 以共軛於適合於診斷測定的固體載體(例如，多朱、平板、載玻片或 孔，其形成自諸如膠乳或聚苯乙烯等材料)。按照已知技術，抗體 或其它ALK融合多肽-結合試劑或截短的ALK激酶多肽-結合試劑 可以同樣共軛於可才企測基團如》文射性標記(例如，35S、 1251、 1311)、 酶標記(例如，辣根過氧化物酶、石威性磷酸酶)、以及螢光標記(例 如，螢光素)。
基於細胞的測定，如流式細胞術(FC)、免疫組織化學(IHC)、 或免疫螢光(IF),特別期望用於實施本發明的方法，因為這樣的測 定形式是臨床適用的，可以體內4全測突變體ALK激酶多肽表達， 以及避免活性人為變化的風險，其起因於為了獲得提取物而操作獲 自例如肺瘤樣品的細胞。因此，在某些優選的實施方式中，本發明 的方法是以流式細胞術(FC)、免疫組織化學(IHC)、或免疫螢光 (IF)測定形式力口以實施。
流式細胞術(FC )可以用來確定，在用目標在於抑制ALK激 酶活性的藥物進行治療之前、期間、以及以後，突變體ALK激酶 多肽在哺乳動物胂瘤中的表達。例如，可以通過流式細胞術分析來 自骨髓樣品的腫瘤細胞的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽表達和 /或激活、以及鑑定癌症細胞類型的標記等(如果希望如此)。可以 按照才示準方法來實施;克式細月包術。參見，例如，Chow " a/., C>towe^y 廣Co附附ww/c加'om1 C7/w/cof/ Q^ow掛力4(5.. 72—78 (2001)。 簡單和舉 例來說，可以採用用於血細胞計數分析的以下程序在37。C下用 2%多聚曱醛固定細胞10分鐘，接著在冰上的90%曱醇中進行透化
54作用30分鐘。然後可以用第一 EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽-特異性抗體對細胞進行染色，洗滌並用焚光標記第二抗體加以標 記。然後用流式細月包4義(例如，Beckman Coulter FC500 )並按照所 用儀器的具體程序對細胞進行分析。這樣的分析將鑑定在腫瘤中表 達的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的水平。用ALK-抑制治療 劑治療腫瘤以後類似的分析將揭示ALK融合多肽-表達月中瘤對ALK 激酶的耙向抑制劑的反應性。
免疫組織化學(IHC)染色還可以用來確定在用目標在於抑制 ALK激酶活性的藥物進行治療以前、期間、以及以後在哺乳動物癌 症(例如，實體瘤樣NSCLC)中突變體ALK激酶多肽的表達和/ 或激活狀態。可以按照眾所周知的技術進行IHC。參見，例如， Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 10, Harlow & Lane Eds.， Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。簡單和舉例來"i兌，通過 用二曱苯接著用乙醇對組織切片進行脫蠟；在水中然後在PBS中進 行水合；通過在檸檬酸鈉緩沖液中加熱載玻片來暴露抗原；在過氧 化氫中溫育切片；在阻斷溶液中阻斷；在第一抗-EML4-ALK或抗 -TFG-ALK融合多肽抗體和第二抗體中溫育載玻片；以及最後利用 ABC親和素/生物素方法並按照製造商的說明進行檢測來製備用於 免疫組織化學染色的石蠟包埋組織(例如，來自活檢的腫瘤組織)。
免疫螢光(IF)測定還可以用來確定在用目標在於4中制ALK 激酶活性的藥物進行治療以前、期間、以及以後，在哺乳動物癌症 中突變體ALK激酶多肽的表達和/或激活狀態。可以按照眾所周知 的才支術來進4亍IF。參見，例如，J.M. Polak and S. Van Noorden(1997) Introduction to Immunocytochemistry， 2nd Ed.; Royal Microscopy Society Microscopy Handbook 37, BioScientific/Springer-Verlag。簡單和舉例來i兌，患者才羊品可以淨皮固 定在多聚甲醛中，4妾著固定在甲醇中，用阻斷溶液如馬血清阻斷， 用相對於EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的第一抗體，4妻著用用 螢光染料如Alexa 488標記的第二抗體進行溫育，然後用落射螢光 顯微鏡進行分析。
55Alexa488、 PE)，或其它標記，如量子點，連同其它信號轉導(例 如，EGFR、石粦酸-AKT、石粦酸-Erk 1/2)和/或細月包標記物(例如， 細胞角蛋白)抗體用於多參數分析。
用於測量突變體ALK激酶多肽的各種各樣的其它程序，包括 酶聯免疫吸附測定(ELISA)、》文射免疫測定(RIA)、以及螢光5敫 活細胞分選術(FACS)，在本技術領域是已知的，並且提供用於i貪 斷改變或異常7K平的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽表達的基 礎。通過獲自正常哺乳動物受治療者(優選人)的體液或細月包4是取 物在適合於複合物形成的條件下結合於相對於EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽的抗體來建立這些融合多肽表達的正常或標準 值。可以通過各種方法，但優選通過光度法，來量化標準複合物形 成的量。將在受治療者、對照、以及來自活檢組織的疾病樣品中表 達的EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的量與標準值進4亍比較。標 準和受治療者值之間的偏差建立用於it斷疾病的參數。
肽和核酸測定
類似地，可以製備用於在生物樣品(包括來自腫瘤的細胞)中 檢測/量化已表達的突變體ALK激酶多肽的AQUA肽並用於標準 AQUA測定，如在上面的部分E中詳細描述的。因此，在本發明的 方法的某些4尤選實施方式中，ALK融合多肽-4爭異性試劑包4舌重同 位素標記的磷酸肽(AQUA肽)，其對應於包含EML4-ALK融合多 肽或TFG-ALK融合多肽的融合接頭的肽序列，如在上面的部分E 中所描述的。
可用於實施本發明的方法的突變體ALK多肽-特異性試劑還可 以是mRNA、寡核苷酸或DNA探針，其可以直4妄雜交於、以及才企 測生物樣品中的融合或截短的多肽表達轉錄物。在上面的部分B中 詳細討論了這樣的糹笨針。簡單和舉例來說，可以用螢光素標記的 RNA探針來探測甲醛固定的、石蠟包埋的患者樣品，接著用曱醯胺、 SSC以及PBS洗滌，然後用螢光顯孩i鏡進行分析。同樣優選的是FISH探針(包括斷裂點探針)，其允許螢光檢測基因重排，如在第2號染色體上的EML4-ALK缺失突變(參見實施例6 )。
編碼突變體ALK激酶多肽的多核苷酸還可以用於i貪斷目的。可以使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、反義RNA和DNA分子、以及PNA。多核普酸可以用來^r測和量化在活才企實體瘤iE織中的基因表達，其中EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽或截短的活性ALK;敫酶多肽的表達可以與疾病有關。例3口， i貪斷測定可以用來區別EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的缺少、存在、以及過表達，以及在治療性幹預過程中監測ALK融合多肽水平的調節。
在一種優選的實施方式中，與PCR探針的雜交可以用來鑑定對突變體ALK多肽進行編碼的核酸序列，其中PCR探針能夠檢測多核苷酸序列，包括基因組序列，其編碼ALK融合多肽或截短的ALK^敫酶多肽、或緊密相關分子。在上面的部分B中4苗述了這才羊的探針的構建和應用。探針的特異性，不管是製備自高度特異區，例如，在融合4妾頭中的IO個單一核苷酸，或4交少特異區，例如，3，編碼區，以及雜交或擴增的嚴格性(最大、高、中、或低)將確定探針是否僅鑑定天然存在序列(其編碼突變體ALK多肽)、等位基因、或相關序列。
探針還可以用於檢測相關序列，並且應優選包含至少50%的來自任何突變體ALK多肽編碼序列的核苷酸。本發明的雜交探針可以是DNA或RNA並且衍生自SEQIDNO:2、 19、以及21的核苷酸序列，最優選圍繞融合接頭(參見圖1A-C，底部圖片以及SEQ IDNO: 7、 24、以及26),或書亍生自基因糹且序列，其包4舌天然存在的EML-4、 TFG、以及ALK多肽的啟動子、增強子元件、以及內含子，如在上面的部分B中進一步描述的。
例如，本發明的EML4-ALK融合多核苷酸可以用於DNA或RNA分析、斑點印跡、或其它力荑基才支術；用於PCR才支術；或用於纖維素試紙、針、ELISA或晶片測定，其利用來自患者活4企的流體或組織以檢測改變的ALK多肽表達。這樣的定性或定量方法在本領域是眾所周知的。在一個特定方面，編碼本發明的突變體ALK多肽的核香酸序列可以用於這樣的測定，其檢測各種癌症(包括肺癌)的激活或誘導。突變體ALK多核苷酸可以通過標準方法加以標記，並在適合於形成雜交複合物的條件下加入到來自患者的流體或組織樣品中。在適當的溫育時間以後，洗滌樣品，量化信號，並與標準值比較。如果活檢或提取樣品中的信號量顯著不同於可比較的對照樣品，則核苷酸序列已雜交於樣品中的核苷酸序列，並且樣品中編碼EML4-ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的核苦酸序列的改變的水平的存在表明存在有關疾病。這樣的測定還可以用來在動物研究中、在臨床試驗中、或在監測個體患者的治療中評估特定治療方案的功效。
為了提供以突變體ALK激酶多肽的表達為4爭徵的疾病的i貪斷基礎，建立了表達的正常或標準分布。這可以通過在適合於雜交或擴增的條件下，使獲自正常受治療者(動物或人)的體液或細胞4是取物結合於編碼EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的序列或其片斷來完成。可以通過比較獲自正常受治療者的值與來自實驗的值(其中使用了已知量的基本上純化的多核苷酸)來量化標準雜交。可以將獲自正常樣品的標準值與獲自有疾病症狀的患者樣品的值進4亍比較。標準值與受治療者值之間的偏差用來確定疾病的存在。
在確定疾病並開始治療方案以後，可以^L則i也重複雜交測定以評估患者中表達水平是否開始近似在正常患者中觀測到的表達水平。由連續測定獲得的結果可以用來顯示在幾天至數月期間範圍的治療功效。
本發明的突變體ALK多核苷酸的另外的診斷應用可以涉及使用聚合酶鏈反應(PCR)， 一種優選的測定形式，其對於本領域技術人員而言是才示準的。參見，例^口 ， Molecular Cloninc^ ALaboratory Manual, 2nd. edition, Sambrook, J.， Fritsch, E. R andManiatis, T" eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)。 PCR寡聚體可以化學合成、酶促產生、或製備自重組源。寡聚體將優選由兩種核苷酸序列構成， 一種具有有義定
58向(5'至3，)以及另一種具有反義定向(3'至5'),在優4匕條件下用於鑑定特定基因或條件。相同的兩個寡聚體、寡聚體的嵌套集合、或甚至寡聚體的兼併庫可以在較少嚴格的條件下用於檢測和/或量H緊密相關的DNA或RNA序列。
還可以用來量化ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽的表達的方法包括》文射性標記或生物素化核苷酸、對照核酸的共擴增、以及實-驗結果^皮內插到其上的標準曲線(Melby ef "/., 乂 /wmw"o/.MdWs, ， . 235-244 (1993》Duplaa w 如a/. S/oc/z纖229-236(1993))。可以通過以ELISA形式進行測定來加速多個樣品的量化速度，其中以不同稀度提供感興趣的寡聚體，以及分光光度或比色反應給出快速量化。
在本發明的另一種實施方式中，本發明的突變體ALK多核苷酸、以及它們近側和遠側的相鄰基因ia區，可以用來產生雜交4果4十，其可用於對天然存在的基因組序列進行作圖。利用眾所周知的4支術，可以將序列作圖到特定染色體或到染色體的特異區。這樣的技術包括螢光原位雜交(FISH)、 FACS、或人工染色體構建，如酵母人工染色體、細菌人工染色體、細菌Pl構建或單染色體cDNA文庫，如在Price, C. M, 5/00di ev. 7, 127-134 (1993)以及Trask, B. J.,7^"AG^"w. 7.. 149-154 (199l)中所綜述的。
在一種優選的實施方式中，採用了 FISH (如在Verma w a/.Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, PergamonPress, New York, N.Y. (1988)中所描述的)並且FISH可以與其它物理染色體作圖技術和基因圖譜數據有關。基因圖譜的實例可以在1994 Genome Issue of Sc^wce (2(55: 1981f)中找到。在物5裡染色體圖譜上編碼EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽或截短的活性ALK激酶多肽的基因的位置和特定疾病、或特定疾病的素因之間的相關性可以有助於限制與遺傳疾病有關的DNA區。本發明的核苷酸序列可以用來4企測在正常、載體、或受影響個體之間的基因序列差異。雙色斷裂點FISH探針，例如，可以用來檢測樣品中突變體EML-4、TFG、和/或ALK基因的存在或缺少。
59染色體製備的原位雜交和物理作圖技術如利用確定的染色體標記進行的連鎖分析可以用於延伸基因圖謙。將基因放置在另 一種哺乳動物物種(如小鼠)的染色體上，經常可以揭示相關標記，即
使特定人染色體的數目或臂是未知的。通過物理作圖，可以將新序列分配給染色體臂、或其部分。這為研究者提供有價值的信息，以便利用定位克隆或其它基因發現技術來尋找疾病基因。在通過基因
連鎖將疾病或症候群粗略地定位到特定基因組區，例如，AT到11q22畫23 ( Gatti " a/" 7W^"re 336: 577-580 (1988))以後，4壬何序列作圖到該區域可以表示用於進一步研究的相關或調節基因。本發明的核苷酸序列還可以用來檢測在正常、載體、或受影響個體之間起因於易位、倒位等的染色體位置差異。
其它用於核酸檢測的適宜方法，如小溝結合共軛寡核苷酸探針(參見，例如，美國專利第6，951 ，930號，"Hybridization-TriggeredFluorescent Detection of Nucleic Acids")對於本領域技術人員來說已知的。
生物樣品
可用於實施本發明的方法的生物樣品可以獲自任何哺乳動物，其中存在或正發展以EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽的表達為特徵的癌症。在一種實施方式中，哺乳動物是人，並且該人可以是用於治療癌症，例如NSCLC,的ALK-抑制治療劑的候選者。該人4美選者可以是目前正用、或考慮用ALK激酶抑制劑，如WHI-131和/或WHI-154，進4亍治療的患者。在另一種實施方式中，哺乳動物是大動物，如馬或奶牛，而在其它實施方式中，哺乳動物是小動物，如狗或貓，已知其均發展癌症，包4舌肺癌。
任何包含來自哺乳動物癌症的細胞(或細胞4是取物)的生物才羊品適合於本發明的方法。在EML-ALK融合多肽的情況下，任何癌症，不管是實體還是非實體，都將是適宜的。在TFG-ALK的情況下，實體瘤是在本發明的方法的範圍內。例如，生物才羊品可以包含獲自滲出液的細胞，如胸膜滲出液的細胞。已知在許多晚期肺癌(包括NSCLC)患者中形成胸膜滲出液(形成在胸月空中的肺外側並且包含癌細胞的液體)，並且這樣的滲出液的存在是不良結果和短存活時間的預兆。已描述了用於獲得胸膜滲出液的標準技術並且在本領域是眾所周知的(參見Sahn， C"" C/ eWMW 3(2): 443-52 (1982))。利用腫瘤標誌、細^^角蛋白標誌或如所描述的陰性選擇的其它方法，循多不胂瘤細月包還可以獲自血;青(參見Ma W "/., ^""c"wcer23(1A): 49-62 (2003))。對於白血病患者，血清和骨髓樣品可以是特別優選的。對於涉及實體瘤的癌症，如肉瘤和癌，生物才羊品可以包含獲自腫瘤活檢的細胞，其可以按照標準臨床技術來獲得。例如，在各種各樣的癌症(包括成神經細胞瘤和神經外胚層癌症)中已 見
測到ALK的異常表達。參見，例如，Pulford""/.，上文。然而，僅在淋巴瘤中描述了 TFG-ALK易位突變體，而在實體瘤中先前未》見測到。
生物樣品可以包含來自癌症的細胞(或細胞提取物)，其中ALK融合多肽被表達和/或激活，但野生型ALK激酶則沒有。可替換地，4^品可以包含來自癌症的細^0其中突變體ALK多肽和野生型ALK激酶兩者均被表達和/或激活，或其中野生型ALK激酶和/或EML-4和/或TFG ^皮表達和/或活性的，但突變體ALK多肽則沒有。
按照標準技術，上述生物樣品的細胞提取物可以製備成粗製物，或經過部分(或完全)純化，並用於本發明的方法。可替換地，可以以優選的測定形式採用包含全細胞的生物樣品，如免疫組織化學(IHC)、流式細胞術(FC)、免疫螢光(IF)、以及螢光原位雜交(FISH),如上文進一步描述的。這樣的全細胞測定是有利的，因為它們將腫瘤細胞樣品的操作降到最低程度，因此降低了改變細胞的體內信號/激活狀態和/或引入人工信號的風險。全細胞測定還是有利的，因為它們僅在腫瘤細胞中表徵表達和信號，而不是腫瘤和正常細力包的混合物。
在實施所披露的用於確定是否一種化合物抑制以EML4-ALK或TFG-ALK融合基因和/或融合多肽為特徵的腫瘤的進展的方法時，還可以有利地採用包含來自哺乳動物骨髓移植模型或異種移檔:
61的細J包的生物衝羊品。優選的異種移才直(或移植受體)是小哺乳動物，
如小鼠，其躲藏(harbor)表達突變體ALK激酶多肽的人腫瘤。躲藏人腫瘤的異種移植在本領域是眾所周知的(參見Kal, Omcer 7>eWi 仏72: 155-69 (1995))並且躲藏人腫瘤的哺乳動物異種移植的生產被很好地描述(參見Winograd " /" Wvo. 1(1): 1-13 (1987))。類似地，骨髓移檔》溪型的產生和應用#^艮好地描述(參見，例如，Schwaller, e/"/.,五MS(9J /7.. 5321-333 (1998); Kelly W a/., 5/ood99.'310-318 (2002))。"以EML4-ALK或TFG-ALK融合多#亥苷酸和/或融合多肽為特徵的癌症"是指這樣的癌症，其中與不存在這樣的融合基因和/或融合多肽的癌症相比，存在這樣的突變體ALK基因和/或表達的多肽。
在評估包含來自哺乳動物癌症腫瘤的細胞的生物樣品中的突變體ALK多核苷酸存在或多肽表達時，代表細月包的對照樣品(其中沒有發生上述易位和/或融合蛋白)可以期望用於比4交目的。理想地，對照樣品包含來自特定癌症(例如，NSCLC)的亞型的細胞，上述亞型4戈表這才羊的亞型，其中並沒有發生突變(例如，EML4-ALK缺失突變)和/或並沒有表達融合多肽。因此，對照樣品與試驗生物樣品中水平的比較可以確定是否存在突變體ALK多核苷酸和/或多肽。可替換地，因為EML4-ALK和/或TFG-ALK融合多核苷酸和/或多肽可能不存在於大多數癌症中，所以類似地並不表達這樣的突變體ALK多肽(或躲藏突變體多核普酸)的任4可組織可以用作對照。
以下描述的方法對於以突變體ALK多核苷酸和/或多肽為特4￡的癌症、以及與其有關的治療決策將具有有價^直的診斷應用。例如，生物樣品可以獲自這樣的受治療者，其先前並沒有診斷為具有以EML4-ALK *夾失突變和/或融合多肽為特徵的癌症，也糹殳有經受4十對上述癌症的治療，並且該方法用來it斷上鑑定在這樣的受治療者中的腫瘤為屬於腫瘤(例如，NSCLC)的亞型，其中存在和/或表達EML4-ALK融合多核香酸和/或多肽。本發明的方法還可以用來監測在用組合物(包括ALK激酶-抑制治療劑或治療劑的組合)對受治療者進4於治療以後表達突變體ALK激酶多肽的癌症的進展或 抑制。
可以在初步評估或外科監#見步驟以後或以前進行這樣的診斷 測定。本發明的鑑定方法可以有利地用作診斷來確定患有癌症的患 者，如NSCLC ，其由EML4-ALK和/或TFG-ALK融合蛋白或由截 短的ALK激酶所驅動，這些患者將很可能對目標在於抑制ALK激 酶活性的療法起反應，如WHI-131和/或WHI-154或它們的類似物。 選擇上述患者的能力也將用於臨床評估未來ALK-把向療法的功效 以及用於給予患者的上述藥物的未來處方。
診斷方法
選擇性地鑑定癌症(其中存在EML4-ALK和/或TFG-ALK融 合多核苷酸和/或融合多肽)的能力使得能夠實現重要的新方法，其 用於精確地鑑定上述腫瘤(用於診斷目的)，以及獲得信息，當作 為單藥劑用來治療癌症時，該信息可用於確定這4羊的腫瘤是否可能 對ALK-抑制治療劑組合物起反應，或可能部分或完全地對靶向不 同激酶的抑制劑不起反應。
因此，在一種實施方式中，本發明提供了一種用於在來自哺乳 動物癌症的生物樣品中4全測突變體ALK多核苦酸和/或其編碼的突 變體ALK多肽的存在的方法，所述方法包括以下步驟
(a) 乂人哺乳動物癌症獲得生物才羊品；以及
(b) 利用至少一種試劑，其衝企測融合多核苷酸、或其編碼的 融合多肽(包含部分具有部分二級蛋白質的ALK)，以確定在所述 生物才羊品中是否存在ALK突變體多核苷酸和/或其編碼的突變體 ALK多肽。
在某些優選的實施方式中，癌症是實體瘤肉瘤或癌，而在一種 實施方式中，癌是肺癌，如NSCLC。在另一種優選的實施方式中， 突變體ALK多肽是一種融合多肽，其包含ALK ( SEQ ID NO: 5 ) 的殘基1116-1383並具有部分所述二級蛋白質。在另一種優選的實
63施方式中，二級蛋白質選自由EML-4 ( SEQ ID NO: 3 )和TRK-融 合基因(TFG)蛋白質(SEQ ID NO: 22)組成的組。在又一種優選 的實施方式中，融合多肽包含EML-4 ( SEQ ID NO: 3 )的殘基1-233 或殘基1-495或TFG ( SEQ ID NO: 22 )的殘基1-138。
在其它^尤選的實施方式中，融合多4亥苷酸包4舌EML4-ALK融 合多核苷酸(SEQ ID NO: 2或19 )或TFG-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO: 21),而在又一種實施方式中，融合多肽包4舌EML4-ALK融 合多肽(SEQIDNO: 1或18)或TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)。在又一種優選的實施方式中，融合多核苷酸是上述的一種 EML4-ALK融合多才亥香酸或多肽。
在更4尤選的實施方式中，該方法採用一種試劑，其包含 EML4-ALK融合多核芬酸和/或至少一種EML4-ALK融合多肽-淨爭 異性試劑(抗體或AQUA肽)，如上所述。在某些優選的實施方式 中，該試劑包括一種分離的試劑，其特異性地結合於或檢測 TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20 )或TFG-ALK融合多核苷酸 (SEQ ID NO: 21)， <旦並不結合於或衝企測野生型TFG或野生型 ALK。在其它優選的實施方式中，試劑是聚合酶鏈反應(PCR)採L 針或螢光原位雜交(FISH)探針。某些優選的實施方式採用重同位 素標記(AQUA )肽，其包含野生型ALK內的TFG-ALK融合多肽 或截短點的融合接頭的胺基酸序列。
在某些優選的實施方式中，以如上所述的流式細胞術(FC)、 免疫組織化學(IHC)、或免疫螢光(IF)測定形式來實施本發明的 診斷方法。在另一種優選的實施方式中，檢測了 EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽的活性。在其它優選的實施方式中，以如上所 述的螢光原位雜交(FISH)或聚合酶鏈反應(PCR)測定形式來實 施本發明的i貪斷方法。
本發明進一步提供了 一種用於確定化合物是否抑制以 EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苦酸和/或融合多肽為特徵的癌 症的進展的方法，所述方法包括以下步驟確定所述化合物是否抑制所述EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽在所述癌症中的表達和/ 或活性。在一種優選的實施方式中，利用至少一種試劑來確定ALK 融合多肽的表達和/或活性的抑制，其中所述i式劑檢測本發明的 EML4-ALK融合多核苷酸或多肽和/或本文披露的TFG-ALK融合 多核苷酸或多肽。在下面的部分G中更詳細地討論了適合於抑制 ALK激酶活性的化合物。
在上面的部分B和D中，進一步詳細地描述了可用於實施本 發明的方法的突變體ALK多核香酸4笨4十和多肽-特異性試劑。在一 種優選的實施方式中，ALK融合多肽-特異性試劑包含一種融合多 肽-特異性抗體。在另一種優選的實施方式中，融合多肽-特異性試 劑包含一種重同位素標記磷酸肽(AQUA肽)，其對應於ALK融合 多肽的融合接頭(參見圖1A-C(底部圖片))。在又一種優選的實施 方式中，融合多核苷酸-特異性試劑包含FISH探針，其對應於ALK 融合基因和/或野生型EML4、 TFG、或ALK基因的斷裂點的融合 接頭。
上述本發明的方法還可以可選地包括以下步驟確定所述生物 樣品中其它激酶，如野生型ALK和EGFR,或其它下遊信號分子的 表達或激活水平。描出ALK融合多肽表達/激活和其它激酶的表達/ 激活的4侖廓以及在糹合定生物才羊品中的途徑可以4是供以下有價值的 信息哪些激酶和途徑正驅動疾病，以及哪種治療方案因此可能是 最有益的。
化合物篩選
本文描述的新EML4-ALK融合多肽的發現還使得可以開發新 化合物，其抑制這種突變體ALK蛋白質的活性，尤其是其ALK激 酶活性。因此，本發明還部分地提供了一種用來確定一種化合物是 否抑制以EML4-ALK融合多核普酸和/或融合多肽為特^正的癌症的 進展的方法，所述方法包括以下步驟確定所述4匕合物是否抑制所 述EML4-ALK融合多肽在所述癌症中的表達和/或活性。在一種優 選的實施方式中，EML4-ALK融合多肽的表達和/或活性的抑制是
65利用至少 一種試劑力口以確定，其中所述試劑檢測本發明的融合多核 香酸和/或融合多肽。上面已描述了本發明的優選試劑。在下面的部
分G中更詳細地描述了適合於抑制ALK激酶活性的化合物。
化合物可以是，例如，激酶抑制劑，如小分子或抗體4中製劑。 它可以是相對於多種不同的激酶具有活性的泛激酶抑制劑，或激酶 特異性抑制劑。在下面的部分G中進一步詳細地討論了 ALK激酶-抑制化合物。可以在用抑制劑進4於治療之前和以後獲得患者生物衝羊 品，然後利用上述方法分析抑制劑對ALK激酶活性的生物效應， 包括下遊底物蛋白的磷酸化。這樣的藥效測定可以用於確定藥物的 生物活性劑量，其可以優選於最大耐受量。這樣的信息還可用於提 出通過證明藥物作用機制而認可的藥物。在下面的部分G中進一步 描述了具有上述期望的抑制特性的化合物的鑑定。
G癌症的治療性抑制
根據本發明，現已表明，其中表達EML4-ALK融合蛋白的哺 乳動物實體瘤癌症(NSCLC )的進展可以通過抑制上述癌症中ALK 激酶的活性加以體內抑制。類似地，如本文所描述的，其中表達 TFG-ALK融合蛋白的哺乳動物實體瘤癌症的活性可以類似地通過 抑制上述癌症中的ALK激酶活性加以體內抑制。通過用ALK激酶 -抑制治療劑，如小分子激酶抑制劑如WHI-131或WHI-154接觸癌 症(例如，腫瘤)可以抑制以突變體ALK多肽的表達為特4正的癌 症中的ALK活性。如在下面的實施例2中進一步描述的，利用示 例性類型的ALK-抑制治療劑，siRNA，通過抑制融合激酶可以實 現例如表達ALK融合蛋白的腫瘤的生長抑制。因此，本發明部分 地提供了 一種通過抑制突變體ALK激酶在癌症中的表達和/或活性 而用於抑制表達EML4-ALK融合多肽的癌症或表達TFG-ALK融合 多肽的實體瘤的進展的方法。
ALK激酶-抑制治療劑可以是4壬4可組合物，該組合物包含至少 一種化合物(生物的或化學的)，其直接或間接地抑制ALK激酶體 內的表達和/或活性，並且包括下面描述的示例性類型的化合物。這才羊的^:合物包4舌這才羊的治療劑(therapeutics),其直4妾4乍用於ALK 激酶本身、或改進ALK活性的蛋白質或分子，或其通過抑制ALK 的表達而間接起作用。這樣的組合物還包括僅包含單一 ALK激酶 抑制化合物的組合物，以及包含多種治療劑(包括那些相對於其它 RTK的治療劑)的組合物，其還可以包4舌非特異性治療藥劑如化療 藥物或通用轉錄抑制劑。
小分子抑制劑
在某些優選的實施方式中，可用於實施本發明的方法的ALK-抑制治療劑是靶向小分子抑制劑，如WHI-131和WHI-154、或它 們的類似物。WHI-131和WHI-154是ALK的會唑啉類小分子靶向 抑制劑，並且已描述了它們的性能。參見Marzec " a/., Lab. Invest. 85(12): 1544-54 (2005)。已經表明，這些4匕合物可以在'淋巴瘤細月包 中誘導凋亡和抑制增殖。激酶的其它小分子靶向抑制劑在本領域是 眾所周知的。例如，Gleevec (STI-571， Imatinib)，其特異性地結 合於並阻斷BCR-ABL融合激酶(以及其它激酶)的ATP-結合位點 從而防止該酶的石粦酸化和激活，可商業上獲得並且其性能是眾所周 ^口6勺。參見，侈寸^口， Dewar "/., S/ooc/ 7Q5(^人3127-32 (2005)。 Novartis, Inc.和Cephalon， Inc.目前正開發ALK的其它小分子抑制 劑。
小分子靶向抑制劑是一類分子，其通常通過特異性地、並且經 常不可逆地結合於酶的催化部位、和/或結合於酶內的ATP-結合槽 或其它結合位點(其防止酶採取其活性所必須的構象)來抑制它們 的耙酶的活性。可以利用ALK激酶三維結構的X射線晶體學模擬 或計算機模擬來合理地設計小分子抑制劑，或可以通過高通量篩選 抑制ALK的化合物文庫來發現小分子抑制劑。這衝羊的方法在本領 域是眾所周知的，並且已加以描述。例如，如上所述，通過才企查這 樣的化合物抑制ALK活性、^旦不抑制其它激酶活性的能力(在一 組激酶中)，和/或通過檢查在包含肺癌細胞的生物樣品中ALK活性 的抑制，可以證實ALK抑制的特異性。下面將進一步描述這樣的 篩選方法。
67抗體抑制劑
可用於本發明的方法的ALK激酶-抑制治療劑還可以是靶向抗 體，其特異性地結合於ALK活性所需要的關鍵催化或結合位點或 結構域，以及通過阻止配體、底物或次級分子接近ALK,和/或防 止酶釆取其活性所必須的構象，來抑制激酶。已^艮好地描述了人源 4b革巴特異性抗體的生產、嬸選、以及治療應用。參見，Merluzzi W"/.， 爿c/v C/,'w Pa仇4(2): 77-85 (2000)。可獲4尋用於高通量產生和篩選人 源化草巴特異性4中制抗體的商用4支術和系統，如Morphosys， Inc.的 Human Combinatorial Antibody Library(HuCAL⑧)。
已描述了各種抗受體激酶靶向抗體的生產以及它們在抑制靶 向受體的活性中的應用。參見，例如，美國專利7>開號20040202655, "Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers," October 14， 2004， Morton W "/.;美國專矛P^開號20040086503， "Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies," April 15， 2004， Raisch ; 美國專利7>開號20040033543,
"Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr，" February 19, 2004, Schwab "/。用於產生和應用受體酪氨酸激酶活 性-抑制抗體的準化方法在本領域中是已知的。參見，例如，歐洲專 利號EP1423428, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof," June 2， 2004， Borges W a/。
噬菌體展示方式還可以用來產生ALK-特異性抗體抑制劑，並 且用於噬菌體文庫構建和重組抗體選擇的程序提供在眾所周知的 參考教科書Current Protocols in Immunology, Colligan (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17， Section 17.1 中。還參見美國專利第6,319,690號，2001年11月20曰，Little W a/.; 美國專利第6,300,064號，2001年10月9日，Knappik Wa/.;美國 專利第5,840,479號，1998年11月24日，Little""/.;美國專利爿^ 開號20030219839， 2003年11月27曰，Bowdish可以產生展示在噬菌體表面上的抗體片斷的文庫(參見，例如，
美國專利6,300,064， 2001年10月9日，Knappik " a/.)並篩選用 於結合於受體蛋白質酪氨酸激酶(如ALK)的可溶的二聚體形式。 結合於RTK的可溶二聚體形式並用於篩選的抗體片斷被鑑定為候 選分子，用於阻斷細胞中草巴RTK的組成型激活。參見歐洲專利第 EP1423428號，齡gM " a/"上文。
在如上所述的抗體文庫篩選中鑑定的結合靶向抗體的ALK然 後可以進一步篩選它們在體外激酶測定和體內(在細胞系和/或腫瘤 中)激酶測定中阻斷ALK的活性的能力。如上所述，例如，通過 檢查這樣的抗體治療劑抑制ALK激酶活性、但並不抑制其它激酶 活性的能力(在一組激酶中)，和/或通過檢查在包含癌細胞的生物 樣品中ALK活性的抑制，可以證實ALK抑制。上文進一步描述了 篩選這樣的用於ALK激酶抑制的化合物的方法。
間4妄承卩製劑
可用於實施所4皮露方法的ALK-抑制化合物還可以是這樣的化 合物，其通過抑制蛋白質或分子而不是ALK激酶本身的活性來間 接地抑制ALK活性。這樣的抑制治療劑可以是靶向抑制劑，其調 節關鍵調節激酶的活性，其中關鍵調節激酶磷酸化或去磷酸化(因此 活化或去活化)ALK本身，或幹^尤配體的結合。如同其它受體酪氨 酸激酶一樣，通過連接物蛋白和下遊激酶(包括STAT5和AKT) 的網絡，ALK調節下遊信號。因此，通過乾向這些相互作用或下遊 蛋白質，可以抑制通過ALK活性的細胞生長的誘導和存活。目前 正在開發的可以以這種方式4吏用的藥物包括AVartmanin。
通過利用抑制為ALK採取其活性構象所必須的激活分子的結 合的化合物還可以間接地抑制ALK激酶活性。類似地，例如，已 描述了負調節PDGF受體酪氨酸激酶的抗PDGF抗體的生產和應 用。參見美國專利,>開號20030219839, "Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies," Bowdisha/.。
69利用ALK三維結構的X射線晶體學模擬或計算機模擬可以合 理地設計ALK活性的間接抑制劑，或可以通過高通量篩選用於抑 制關鍵上遊調節酶和/或必要的結合分子的化合物文庫來發現ALK 活性的間接抑制劑，其導致ALK激酶活性的抑制。這樣的方式在 本領域是眾所周知的，並且已有描述。如上所述，例如，通過檢查 上述化合物抑制ALK活性、^旦不抑制其它激酶活性的能力(在一 組激酶中)，和/或通過檢查在包含癌細胞(例如，NSCLC細胞)的 生物樣品中ALK活性的抑制，可以證實通過上述治療劑的ALK抑 制。下面將進一步描述用於鑑定化合物的方法，其中化合物抑制以 EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苷酸和/或融合多肽為特;f正的癌 症。
反義和/或轉錄抑制劑
ALK抑制治療劑還可以包括反義和/或轉錄抑制化合物，其通 過阻斷編石馬ALK的基因和/或EML4-ALK或TFG-ALK融合基因或 截短的ALK基因的轉錄來抑制ALK激酶活性。例如，已描述了通 過用於治療癌症的反義療法來抑制各種受體激酶，其包括VEGFR、 EGFR、 IGFR、 ^乂及FGFR。參見，侈'j^口，美國專矛J第6,734,017號； 第6,710,174號；第6,617,162號；第6,340,674號；第5，783，683號； 第5,610,288號。
按照已知技術，可以將反義寡核苷酸設計、構建，並用作相對 於輩巴基因的治療藥劑。參見，例^口 ， Cohen， J, 7VewA i^"rmaco/.
10(11): 435-437 (1989); Marcus-Sekura, ^wa/.萬/oc/ze附.172: 289-295 (1988); Weintraub， H., pp. 40-46 (1990); Van Der
Krol " 5,orec/m/々諸6(10): 958-976 (1988); Skorski " o/" iV"f/. ^cac/. Sc/. (1994) 9六4504-4508。最近已描述了利用EGFR 的反義RNA抑制劑來抑制人癌的體內生長。參見美國專利公開號 20040047847， "Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth in vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III Promoter," March 11， 2004， He a/.。 類4以 地，按照上述方法可以製備ALK-抑制治療劑，其包含至少一種相
70對於哺乳動物ALK基因的反義寡核苷酸(參見圖4(SEQ ID NO: 6)) 或EML4-ALK或TFG-ALK融合多核普酸或截短的ALK多核苷酸 (參見圖2A-C(SEQIDNO: 2、 19、以及21))。如下文進一步描述 的，可以製備和給予包含ALK-抑制反義化合物的藥物組合物。
小分子幹涉RNA
小分子幹涉RNA分子(siRNA )組合物(其通過RNA千涉過 程抑制ALK的翻譯，因而抑制其活性)，也可以期望用於本發明的 方法中。已很好地描述了 RNA幹涉，以及通過引入外源性小雙鏈 RNA分子(其包含互補於編碼靶蛋白的mRNA的序列)來選擇性 沉默靶蛋白表達。參見，例如，美國專利公開號20040038921， "Composition and Method for inhibiting Expression of a Target Gene，" February 26, 2004， Kreutzer W "/.;美國專利/>開號20020086356， "RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference," June 12， 2003, Tuschl " a/.;美國專利^>開號20040229266， "RNA Interference Mediating Small RNA Molecules," November 18， 2004， Tuschl "/.。
例如，如目前示出的(參見實施例2)，在表達融合蛋白的人 NSCLC細胞系中siRNA-介導的EML4-ALK融合蛋白表達的沉默選 擇性地抑制在那些細胞中的疾病的進展，但在並不表達突變體ALK 蛋白質的對照細月包中則不是如此。
已表明，雙鏈RNA分子(dsRNA)以高度保守的調節機制，稱作 RNA幹涉(RNAi)，阻斷基因表達。簡單地i兌，RNAse III Dicer將 dsRNA處理成大約22個核苷酸的小分子幹涉RNA(siRNA)，其作 為引導序列，以通過RNA誘導的沉默複合RISC來誘導靶特異 mRNA剪切(參見Hammond " 淑腳(2000) 404: 293-296 )。 RNAi涉及催化型反應，從而通過更長dsRNA的連續剪切來產生新 的siRNA。因此，不同於反義，RNAi以非化學計量方式降解靶RNA。 當給予細胞或生物體時，夕卜源性dsRNA顯示出可以引導通過RNAi 的內源性信使RNA(mRNA)的序列特異降解。現在可商業上獲得各種各樣的靶特異性siRNA產品，包括用於 它們表達和應用在哺乳動物細月包中的載體和系統。參見，例如， Promega, Inc. (promega.com); Dharmacon， Inc. (dharmacon.com)。 可 獲得關於用於RNAi的dsRNA的設計、構建、以及應用的詳細技術 手冊。參見，侈寸長口, Dharmacon，s "RNAi Technical Reference & Application Guide"; Promega,s "RNAi: A Guide to Gene Silencing"。 ALK-抑制siRNA產品也可以商業上獲得，並且可以適當地用於本 發明的方法。參見，例長口 ， Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Cat Nos. M-003162-03， MU-003162-03， D-003162-07至-10 (siGENOME SMARTselection and SMARTpool siRNAs)。
最近已確定，在哺乳動物中介導RNAi方面最有效的是長度少 於49個核苷酸、並且優選19-25個核苷酸的小dsRNA,其包含至 少一個基本上相同於部分輩巴mRNA序列的序列，以及該dsRNA最 佳地在一端具有至少一個l-4個核苦酸的突出端。參見美國專利7> 開號20040038921， Kreutzer a/.,上文；美國專利開號 20040229266, Tuschl ^ ,上文。在上述出X反物中詳細地描述了這 樣的dsRNA的構建，以及在藥物製劑中它們用來沉默靶蛋白的體 內表達。
如果在哺乳動物中待耙向的基因序列是已知的，例如，則可以 產生和試-驗21-23 ntRNA在哺乳動物細胞，如人或其它靈長類細胞 中介導RNAi的能力。如果需要，可以以適當的動物模型試驗那些 顯示出介導RNAi的21-23 ntRNA分子，以進一步評估它們的體內 有效性。已知的革巴位點，例如，基於對其它核酸分子(例如核酶或 反義)的研究確定為有效靶位點的靶位點，或那些已知與疾病或病 症有關的靶位點如那些包含突變或缺失的位點，也可以用來設計靶 向那些卩立點的siRNA分子。
可替4奐地，例如通過利用計算扭^斤疊算法，可以合理地i殳計/ 預測有效dsRNA的序列，其篩選感興趣的耙mRNA的耙位點。耙 序列可以被電子(電腦模擬，/ww7/co)分析成特定長度的所有片斷 或亞序列的清單，例如23個核苦酸片斷，其中利用定製Perl原本
72或商用序列分衝斤禾呈序3口 Oligo、 Mac Vector 、或GCG Wisconsin Package。
各種參數可以用來確定哪些位點是靶RNA序列內的最合適耙 位點。這些參^t包括^旦不限於二級或三級RNA結構、輩巴序列的核 香酸鹼基組成、靶序列的各種區之間的同源度、或在RNA轉錄物 中耙序列的相對位置。基於這些確定，可以選4奪RNA轉錄物內的 4壬 開號20030170891， September 11， 2003， McSwiggen J。最近還描述了 一種用於鑑定和選擇RNAi靶位點的算法。參見美國專利7>開號 20040236517， "Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA，，' November 25, 2004， Drlicaa/.。
通常使用的基因轉移技術包括磷酸釣、DEAE-葡聚糖、電穿孔 和《效注射以及病毒方法(Graham W (1973) Wra/. 52: 456; McCutchan a/., (1968), / Cawcer /wW. 4/: 351; Chu
(1987)， iVwc/.」c/<*": 1311; Fraley " (1980)， / 5/o/. CAe附.
10431; Capecchi (1980)， Ce〃 22: 479)。還可以利用陽離子脂質 體4誇DNA引入到細月包中(Feigner et al. (1987)， iVoc. 爿c"c .
7413)。商業上可獲4f的陽離子脂質劑型包括Tfx 50(Promega)或Lipofectamin 200(Life Technologies)。 可替換地,病 毒載體可以用來將dsRNA遞送到細胞並介導RNAi。參見美國專利 />開號20040023390, "siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors," Feb. 4， 2004， Davidsono/.。
用於哺乳動物細月包中的RNAi的壽爭染和載體/表達系統是商業 上可獲得的，並且已得到4艮好描述。參見，例如，Dharmacon， Inc., DharmaFECTTM系統；Promega, Inc., siSTRIKE U6 Hairpin系統； 還參見Gou " a/. (2003)屍五^S. 548， 113-118; Sui, G. W a/. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002)屍腦.淑/. ^c"d 99， 5515-5520; Yu " (2002)屍亂淑/. JcW.99， 6047-6052^ Paul, C. d C (2002)胸訓Ao&c/mo/c^ 19， 505-508; McManus " (2002) i 崩& 842-850。
然後通過將包含dsRNA的藥物製劑主會予哺乳動物，可以在哺 乳動物中利用製備的dsRNA分子來進4亍siRNA幹涉。以足以4中制 靶基因表達的劑量給予藥物組合物。通常可以以小於5 mg dsRNA/ 千克體重/天的劑量給予dsRNA，並且足以抑制或完全抑制靶基因 的表達。通常，dsRNA的適宜劑量將在0.01至2.5毫克/受體的千 克體重/天的範圍內，優選在0.1至200孩t克/千克體重/天的範圍內， 更優選在0.1至100微克/千克體重/的範圍內，甚至更優選在1.0至 50微克/千克體重/天的範圍內，以及最優選在1.0至25微克/千克體 重/天的範圍內。包含dsRNA的藥物組合物每天給予 一次，或例如 利用本領域眾所周知的緩釋劑型以多個亞劑量給予。如下文進一步 描述的，可以按照標準技術來製備和給予這樣的藥物組合物。
如上所述，通過製備包含治療有效量的這樣的dsRNA的藥物 製劑，並將該製劑給予患有表達EML4-ALK或TFG-ALK融合蛋白 或截短的活性ALK激酶的癌症的人受治療者，例如，通過直接注 射到腫瘤，上述dsRNA可以用來在癌症中抑制ALK表達和活性。 最近已描述了利用siRNA抑制劑來類似i也抑制其它受體酪氨酸激 酶，如VEGFR和EGFR。參見美國專利^>開號20040209832， October 21， 2004, McSwiggen ef ; 美國專利z>開號20030170891， September 11， 2003, McSwiggen;美國專利7>開號20040175703， September 9, 2004， Kreutzer 。
治療組合物；*合藥
可以通過本領域已知的任何方式，包括^旦不限於口服或腹膜途 徑，其包括靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、經皮、氣道(氣霧劑)、 直腸、陰道和局部(包括頰和舌下)給藥，將可用於實施本發明的 方法的ALK激酶-抑制治療組合物給予哺乳動物。
對於口服給藥，將通常以片劑或膠嚢劑的形式、作為散劑或顆 粒劑、或作為含水溶液或混懸劑，來提供ALK-抑制治療劑。用於口服的片劑可以包括與藥用賦形劑如惰性稀釋劑混合的活性組分、 崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、增香劑、著色劑以及防腐劑。 適宜的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、以及乳
if唐，而玉米澱4分和海藻酸是適宜的崩解劑。粘合劑可以包括澱4分和 明膠，而潤滑劑，如果存在的話，將通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑 石粉。如果需要的話，片劑可以塗布有一種材料如甘油單硬脂酸酯 或二石更脂酸甘油酯，以延遲在胃腸道中的吸收。
用於口服的膠嚢劑包括硬(明膠)膠嚢劑，其中活性組分與固 體稀釋劑混合，以及軟膠嚢劑，其中活性組分與水或油混合，如花 生油、液狀石蠟或橄欖油。對於肌內、腹膜內、皮下以及靜脈內應 用，本發明的藥物組合物將通常以無菌含水溶液或混懸劑提供，其
^L緩衝到適當pH和等滲性。適宜的含水載體包括林格氏液和等滲 氯化鈉。載體可以僅僅由含水緩沖液構成("僅僅"是指不存在任 何助劑或包膠物質，其可能會影響或介導ALK-抑制治療劑的攝 取)。這樣的物質包括，例如，膠束結構，如脂質體或衣殼，如下 所述。含水混懸劑可以包括懸浮劑如纖維素衍生物、海藻酸鈉、聚 乙烯吡咯烷酮和黃芪樹膠，以及溼潤劑如卵磷脂。用於含水混懸劑 的適宜的防腐劑包4舌對羥基苯曱酸乙酯和對羥基苯甲酸正丙酯。
ALK激酶-抑制治療組合物還可以包括孩i嚢劑以防止治療劑 (例如，dsRNA化合物)快速從體內消除，如控釋劑型，其包括植 入物和微嚢化遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容聚合物， 如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類、以及
而易見的。還可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.
商業上獲得該材料。脂質體混懸劑(包括脂質體，其靶向具有相對 於病毒抗原的單克隆抗體的感染細胞)也可以用作藥用載體。這些 混懸劑可以4要照本領域4支術人員已知的方法加以製備，例如，如在 美國專利第4,522,811號、PCT7^開WO 91/06309、以及歐洲專利 公開EP-A-43075中所描述的。微囊劑可以包含病毒外殼蛋白。該 病毒外殼蛋白可以衍生自或伴隨病毒，如多瘤病毒，或它可以是部
75分或全部人工的。例如，夕卜殼蛋白可以是多瘤病毒的病毒蛋白l和
/或病毒蛋白2、或其書f生物。
ALK-抑制組合物還可以包含遞送載體(包括脂質體，用於給 予受治療者)、載體和稀釋劑以及它們的鹽，和/或可以存在於藥用 劑型中。例如，用於遞送核酸分子的方法描述在以下文獻中Akhtar a/" 1992, r訓A Ce〃 Wo., 2， 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akbtar, 1995, Maurer "a/.， 1999， Mo/. Me*. Ao/" M， 129-140; Hofland和Huang, 1999， 屍/^附,/" "7, 165-192;以及Lee " a/" 2000， ACS Symp. Ser.， 752， 184-192。。 Beigelman等人，美國專利第6,395,713 號和Sullivan等人PCT WO 94/02595進一步描述了用於遞送核酸分 子的一45:方法。這些程序可以用來遞送實際上任何核酸分子。
可以通過本領域:技術人員已知的各種方法將ALK-抑制治療劑 給予哺乳動物肺瘤，上述方法包括^旦不限於，月交嚢化在脂質體中， 通過離子導入，或通過加入到其它載體中，如水凝月交、環糊精、生 物可降解的納米月交嚢、以及生物粘附孩"求，或通過蛋白質載體 (O'Hare和Normand,國際PCT ^>開號WO 00/53722 )。可替換地， 通過直接注射或通過使用灌注泵，局部遞送治療劑/載體組合。可以 利用標準針和注射器方法，或通過無針4支術如那些在Conry " "/., 1999， C7/". Ca"cw 5， 2330-2337和Barry " "/.,國際PCT 7>開 號WO 99/31262中所描述的無針:技術進^f亍組合物的直4妄注射(不管 是皮下、肌內、或皮內)。
ALK激酶-抑制治療劑的藥用劑型包括上述化合物的鹽，例如， 酸加成鹽，例如，鹽酸、氫溴酸、乙酸、以及苯磺酸的鹽。藥物組 合物或劑型是指具有一定形式的組合物或劑型，其適合於給予(例 如，系統給予)細胞或患者，包括例如人。適當的形式部分地取決 於應用或進入途徑，例如口月良、經皮、或通過注射。這樣的形式應 當不會阻止組合物或劑型到達草巴細l包。例如，注入血流的藥物組合 物應當是可溶的。其它因素是本領域已知的，並且包括諸如毒性和 形式等的考慮事項，其阻止組合物或劑型發揮其效應。導致系統吸收(即，藥物系統吸收或蓄積在血流中，接著分布
於全身)的給予途徑是所期望的並且包括但不限於靜脈內、皮下、 腹膜內、吸入、口服、肺內以及肌內。這些症會予途徑的每一種將 ALK-抑制治療機暴露於可接近的疾病組織或腫瘤。已表明，藥物進 入循環的速率是分子量或大小的函數。使用包含本發明的化合物的 脂質體或其它藥物載體可以潛在地將藥物定4立在，例如，某些組織 類型，如網狀內皮系統(RES)的組織。可以促進藥物締合於細胞 (如，淋巴細胞和巨噬細胞)表面的脂質體劑型也是有用的。通過 利用巨噬細胞和淋巴細胞免疫識別異常細胞(如癌細胞)的特異性， 這種方式可以提供增強藥物遞送到革巴細月包。
"藥用劑型"是指一種組合物或劑型，其便於將本發明的核酸 分子有效分布在最適合於它們所期望活性的物理位置。適用於具有 本發明的核酸分子的劑型的製劑的非限制性實例包括P糖蛋白抑 製劑(如Pluronic P85 ),其可以增強藥物進入CNS ( Jolliet-Riant 和Tillement， 1999, Fw油m. C"w. Ptom,/" /3, 16-26 );生物可降 解聚合物，如聚(DL-交酯-共羥基乙酸)微球，用於在腦內植入後的 糹爰釋遞送(Emerich " 1999， Ce〃 7harrap/^^ S， 47-58 ) ( Alkermes， Inc. Cambridge, Mass.);以及負荷納米孩吏粒，如那些由聚氰基丙烯 酸正丁酯構成的負荷納米孩i粒，其可以遞送藥物穿過血腦屏障並可 以？文變3申糹至元才聶取才幾命J ( /Vog 7Vewro-/ 5^c/w/ /^rwaco/ J5/o/ 屍矽c/n'"^乂 23， 941-949, 1999 )。可用於本發明的方法的ALK-抑制化 合物的遞送策略的其它非限制性實例包括在Boado d a/.， 1998, 屍/wr附.5W.' S7, 1308-1315; Tyler W "/., 1999, FE^S427， 280-284; Pardridge W "/" 1995,屍A04S L^4.， 92， 5592-5596; Boado, 1995， Wv Z>wgZ)e//\^y Aev., 75, 73-107; Aldrian-Herrada W a/.， 1998， 臉由cy4"A i &y" 2(5, 4910-4916;以及Tyler W "/" 1999, n, 96, 7053-7058中所描述的材料。
包含表面修飾脂質體(其含有聚乙二醇脂質(PEG修飾、或長 循環脂質體，或隱形脂質體))的治療組合物還可以適當地用於本發 明的方法。這些劑型提供一種用於在耙組織中增加藥物蓄積的方 法。通過單核吞噬細胞系統(MPS或RES)，這類藥物載體耐調理和消除，從而可以獲得更長的血液循環時間並增強組織暴露於月交嚢
化藥物(Lasic " /. C7z綴細.1995， 95, 2601-2627; Ishiwata " a/,, CTze附."t/〃. 1995, 43， 1005-1011 )。已表明，這才羊的脂質體選 擇性地蓄積在腫瘤中，大相無通過外滲和捕糹足在新血管形成的把組織 中(Lasic & "/.， 5We腳1995， 267， 1275-1276; Oku "《1995, Aoc/wTw. 1238， 86-90 )。長循環脂質體可增強DNA和
RNA的藥物動力學和藥凌丈學，尤其與已知蓄積在MPS的組織中的 常夫見陽離子脂質體相比(Liu W "/.， J. Biol. Chem. 1995， 42, 24864-24870; Choi W "/.,國際PCT公開號WO 96/10391; Ansell et al.，國際PCT />開號WO 96/10390; Holland " a/.,國際PCT 7〉開 號WO 96/10392)。與陽離子脂質體相比，長循環脂質體還可以在 更大程度上保護藥物免受核酶降解，其是基於它們避免蓄積在代謝 侵襲性MPS組織如肝和脾中的能力。
治療組合物可以包括藥物有效量的在藥用載體或稀釋劑中的 所期望的化合物。用於治療用途的可接受的載體或稀釋劑在製藥領 ;或是眾戶斤周^口 6勺，並且4苗述在<列^口 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, Ed. 1985)中。例如， 可以提供防腐劑、穩定劑、染料以及增香劑。其包括苯甲酸鈉、山 梨酸以及對羥基苯甲酸的酯。此外，可以4吏用抗氧化劑和懸浮劑。
藥物有效劑量是防止、抑制疾病狀態的發生、或治療疾病狀態 (減輕症狀到一定程度、優選所有症狀)所需要的劑量。藥物有效 劑量耳又決於疾病類型、所用的組合物、給藥途徑、4寺治療哺乳動物 的類型、所考慮的特定哺乳動物的物理特性、同時發生的用藥、以 及醫療領域技術人員將明了的其它因素。通常，給予0.1 mg/kg到 100mg/kg體重/天的活性組分之間的量，其取決於帶負電荷聚合物 的效能。
約O.l mg至約140 mg/千克體重/天的劑量水平可用於治療上述 病症(約0.5 mg至約7 g/患者/天)。可以結合於載體材料以產生單 劑量形式的活性組分的量隨待治療的宿主和特定的給予方式而變 化。劑量單位形式通常包含約1 mg至約500 mg之間的活性組分。
78應當明了，用於任何特定患者的具體劑量水平取決於各種因素，包 括所釆用特定化合物的活性、年齡、體重、 一般健康狀態、性別、 飲食、給藥時間、給藥途徑、排洩速率、藥物組合以及接受治療的 特定疾病的嚴重性。
為了給予非人動物，還可以將組合物加入到動物飼料或飲用水 中。可以方偵j也配製動物祠料和々欠用水組合物，佳j尋動物連同其々欠 食獲得治療適宜量的組合物。還可以方便地提供組合物作為預混合 料，用於加入到飼料或飲用水中。
可用於實施本發明的ALK-抑制治療劑可以包含如上所述的單 一化合物，或多種化合物的組合，不管是相同類型的抑制劑(即， 抗體抑制劑)、或不同類型的抑制劑(即，抗體抑制劑和小分子抑 製劑)。這樣的化合物組合在抑制融合蛋白-表達癌症的進展時可以 增加總治療效應。例如，治療組合物可以是小分子抑制劑，如單獨 的WHI-131和/或WHI-154,或連同輩巴向ALK活性的其它4中製劑和 /或其它小分子抑制劑。除一種或多種靶向抑制劑之外，治療組合物 還可以包括一種或多種非特異性化療藥物。最近已表明，這樣的組 合可以在許多癌症中提供協同腫瘤殺傷效應。這樣的組合在抑制 ALK活性和胂瘤體內生長方面的有效性可以如下所述加以評估。
突變體ALK激酶-抑制化合物的鑑定
本發明還部分地提供了 一種方法，用來確定一種化合物是否抑 制以EML4-ALK或TFG-ALK融合多核苷酸和/或融合多肽為特徵 的癌症的進展，其中通過確定該4匕合物是否4中制EML4-ALK或 TFG-ALK融合多肽或截短的ALK激酶多肽在癌症中的活性。在某 些優選的實施方式中，通過才全查包含來自骨髓、血液、胸膜滲出液、 或胂瘤的細力包的生物才羊品來確定ALK活性的抑制。在另一種〗尤選 的實施方式中，利用本發明的至少一種突變體ALK多核苷酸或多 肽-特異性試劑來確定ALK活性的抑制。試-驗化合物可以是如上所述的任何類型的治療劑或組合物。用 於評估化合物功效(體外和體內)的方法一皮^艮好建立並且在本領域
是已知的。例如，利用其中ALK ^皮激活的細胞或細胞提取物可以 試驗組合物體外抑制ALK的能力。 一組化合物可以用來試-驗化合 物對於ALK的特異性(不同於其它輩巴，如EGFR或PDGFR)。
可以4吏用的另 一種藥物篩選^支術可以高通量篩選對於感興趣 的蛋白質具有適當結合親合力的化合物，如在7>開的PCT申請 W084/03564中所描述的。以這種方法，當應用於突變體ALK多肽 時，大量的不同小試驗化合物被合成在固相基板上，如塑料針或某 些其它表面。試驗化合物與突變體ALK多肽、或其片斷反應，然 後洗滌。然後通過本領域眾所周知的方法4企測結合的突變體多肽 (例如，EML4-ALK融合多肽)。還可以將純化的突變體ALK多肽 直接塗布在平板上，用於上述藥物篩選技術。可替換地，非中和抗 體可以用來捕才足肽並將它固定在固體載體上。
對於發現是ALK體外活性的有效抑制劑的化合物，然後可以 檢查其體外抑制表達EML4-ALK或TFG-ALK融合多肽和/或截短 的ALK激酶多肽的癌症的進展的能力，其中利用，例如，哺乳動 物異種移才直躲藏人胂瘤，如NSCLC。以這種方式，可以在最衝竒密 地類似患者的生物裝置中觀測藥物的效應。可以通過用磷酸化-特異 性抗體進行分析來確定在癌細胞或周圍基質細胞中藥物改變4言號 的能力。還可以通過用凋亡特異性標誌如剪切的胱冬裂酶3和剪切 的PARP進行分析來，見測藥物在i秀導細胞死亡或抑制細胞增殖中的 有效性。類似地，可以採用由突變體ALK蛋白質驅動的哺乳動物 骨髓移植物(例如，小鼠)，其躲藏人白血病。在這種方式中，將 已知由突變體ALK激酶驅動的骨髓細胞移才直到小鼠中。可以監測 癌細胞的生長。然後可以用藥物治療小鼠，並外部觀測藥物治療對 癌症表型或進展的影響。然後處死小鼠並除去移植的骨髓，供通過 IHC和蛋白質印跡等進行分析。
這樣的化合物的毒性和治療功效可以通過在細胞培養或實—驗 動物中的才示準藥學禾呈序來確定，例4口，用於確定LD50 ( 50%群體
80的致死劑量)和ED50 (在50%群體中的治療有效劑量)。毒性和治 療效應之間的劑量比率是治療指數並且它可以表示為比率 LD50/ED50。呈現高治療指數的化合物是優選的。
上文和下文引用的所有參考文獻的教導以引用方式結合於本 文。以下實施例^又用來進一步說明本發明，而不是限制其範圍，其 由所附的^又利要求所限定。本發明包括本文教導的方法的改進和變 化，其對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
實施例1
通過全面磷B分布鑑定實體瘤中的ALK激酶活性
A.人NSCLC細胞系的分布
利用最近描述的、用於從複雜混合物分離和質"i普表徵^f多飾肽的 有力技術("IAP"4支術，參見Rush " "/.，上文)衝企查了在22種人 NSCLC細胞系(包括H2228)中激酶激活的全面磷酸化分布。利 用石舞酸酪氛&臾淨爭異寸生4元體(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411 )實施IAP才支術，來乂人NSCLC細 胞系的4是取物中分離並隨後表徵含磷酸酪氨酸的肽。
具體地說，IAP方式用來促進鑑定酪氨酸激酶，其對每個 NSCLC細胞系中的蛋白質磷酸化負責。尤其是，考慮到非典型的 或異常的激酶活性。
細胞培養
所有細胞培養試劑購買自Invitrogen， Inc.。檢查了總共41種人 NSCLC細胞系。人NSCLC細胞系，H520、 H838、 H1437、 H1563、 HI568、 HI792、 HI944、 H2170、 H2172、 H2228、 H2347、 A549、 H441、 HI703、 HI373、以及H358，獲自American Type Culture Collection,並培養在RPMI 1640培養基中，該培養基含有10%FBS 並加以調節以包含2 mML-穀氨醯胺、1.5 g/L石灰酸氫鈉、4.5 g/L葡
81萄糖、10mMHEPES、 l.OmM丙酮酸鈉、青黴素/鏈黴素。另外的 6種人NSCLC細胞系，HCC78、 Cal-12T、 HCC366、 HCC15、 HCC44、 以及LOU-NH91,購買自DSMZ並在包含10%FBS和青黴素/鏈黴 素的RPMI 1640中進行培養。將細胞保持在37。C的5% C02培養 箱中。
為了進行免疫親和沉澱和免疫印跡實-驗，4吏細力包生長至80%匯 合，然後在收穫以前在沒有FBS的RPMI培養基中飢餓過夜。
石舞酸肽免疫沉澱
將1億個細胞溶解在脲裂解緩衝液(20 mM N-羥乙基哌嗪 -N，-2-乙烷石黃酸、pH8.0、 9M脲、1 mM釩酸鈉、2.5mM焦磷酸鈉、 1 mM p-甘油磷酸)中。超聲處理溶胞產物並通過離心作用清除溶 月包產物。用DTT還原清除的溶月包產物，然後用石典乙醯胺烷基^R:, 如先前所描述的(參見Rush， & "/.，艦5/o&c/2"o/. Z (7人94-101 (2005))。然後用20 mM N-羥乙基哌"秦->^，-2-乙烷磺酸稀釋樣品4次 以降低脲濃度至2M，然後在室溫下用胰蛋白酶消化過夜同時溫和 搖動。
用Sep-Pak C18柱粗略純化消化的肽，如先前描述的(參見Rush Wa/.,上文)。冷凍並乾燥洗脫物並將乾燥肽〉容解在1.4 ml的MOPS IP緩衝液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2、 10 mM Na2P04、 50 mM NaCl)中並通過離心作用除去不溶物質。在4。C下用耦聯於蛋白質 G瓊脂糖珠(Roche)的160 的磷酸酪氨酸100抗體(細胞信號傳 導^支術)進4亍免疫;兄澱過夜。然後用1 ml MOPS IP糹差衝液洗滌該 玉朱3次，並用1 mlHPLC級冷dH20洗滌兩次。用60 jal 0.1% TFA 乂人珠洗脫石舞酸肽，4妄著用40 Jul 0.1% TFA進4亍第二次洗脫，然後匯 集級分。利用ZipTip柱(Millipore)濃縮洗脫的肽，並用LC-MS/MS 進4亍分才斤。用LTQ離子阱質i普4義(ThermoFinnigan )收集質i普。
82通過LC-MS/MS質譜法進行分析
濃縮IP洗脫物(IOO jil)中的肽並利用停止之後再行的提取尖管 (StageTips)(參見7 ，禍er " 」wa/. C7z縫，7抑..663-70 (2003)) 與洗脫的抗體分離。用1 pl的60。/。MeCN、 0.1% TFA將肽從樣吏柱 洗脫到7.6 pl的0.4%乙^/0.005°/。七氟丁酸(HFBA )中。
對每個磷酸肽樣品進行LC-MS分析兩次。用C18反相樹脂 (Magic C18AQ， 5pm顆粒，200 A孑L徑，Michrom Bioresources, Auburn, CA )裝填熔凝;圭石孩i毛細管柱(125 pim x 18 cm )。用自動 進樣器(LC Packings Famos， San Francisco, CA )將樣品(4 pL)裝到 此4主上，然後通過在0.1%曱酸中的7至30%乙腈的55分4中線']"生梯 度將樣品洗脫到質"i普4義中。利用具有在管線中的流動分流器的二元 HPLC泵(Agilent 1100， Palo Alto， CA )並以大約abc nl/min來遞送 梯度。用混合線性離子阱-7 Tesla離子回^走共振傅立葉變換」義 (LTQ畫FT, Thermo Finnigan， San Jose， CA ) 5寸洗脫肽離子進4亍質量 分析。
採用了頂七方法，從而基於在ICR細胞中的先前MS測量掃描 期間獲得的測量結果收集在線性離子阱中的7個數據相關MS/MS 掃描，其中同時才喿作線性離子阱和4專裡葉變換J義。以375-1800 m/z 進行MS掃描，其中自動增益控制(AGC)靶為8x106以及質量分 辨率為105。對於MS/MS， AGC是8xl06,動態排斥時間是25s， 以及通過電荷態篩選來4非斥單電4肓離子。
資料庫分析和賦值
利用TurboSequest專id牛(v.27， rev.l2)(ThermoFinnigan )和複合 正向/反向IPI人蛋白質資料庫，將MS/MS譜賦予肽序列。搜索參 數是胰蛋白酶作為蛋白酶；1.08 Da前體質量耐受性；在半胱氨 酸上的靜態修飾(+57.02146，醯胺曱基化)；以及在絲氨酸、蘇氨 酸和酪氨酸(+79.96633 Da,石粦酸化)，賴氨酸(+8.01420，
8313C615N2)，精氨酸(+6.02013, 13C6)以及曱硫氨酸(+15.99491， 氧化)上的動態修飾。靶/引誘物資料庫方式用來建立適當的得分-過濾準則以使建立的假-正貝武值率小於1%。除了過電荷相關XCorr 閾值(z-l, XCorr^1.5，對於z=2, XCon^2.2,對於z=3， XCorr^3.3 ) 以夕卜，需要賦值包含磷酸酪氨酸，以具有-5至+25 ppm的質量精度， 以及包含所有輕的或所有重的賴氨^/精氨酸殘基。
利用定製量化考呈序，Vista (Bakalarski " "/.，原稿在準備中) 進一 步評估通過這些準則的f武值以計算峰面積以及最終的每種肽 的重和輕形式之間的相對豐度。用在MS掃描中低於15的信噪鑑 定的肽不認為是定量。對於那些僅在條件之一下發現的肽而是使用 信噪比。
搜索了於2004年8月24日發布的NCBI人資料庫，該資料庫 包含27,175種蛋白質，其允許氧化型曱石克氨酸(M+16)和石粦酸化 (Y+80)作為動態修飾。由至少三位科學家綜述了支持賦值序列的最 終清單的所有i普(本文未示出)以確定它們的可靠性。
1,500種以上的磷酸酪氨酸位點、以及大於1，000種的酪氨酸磷酸化 蛋白質，其大多數是新的，並來自已檢查的細胞系(數據未示出)。 在i午多細月包系中，如EGFR、 Her2、 Her3、 EphA2以及Met,已知 與NSCLC信號有關的受體酪氨酸激酶觀測到被酪氨酸磷酸化。在 多種細胞系中觀測到高水平的EGFR磷酸肽，上述多種細胞系包括 HCC827和H3255,已知該兩種細月包系表達增加水平的EGFR的基 因活化形式，這證實了該方法可以鑑定已知在NSCLC細胞系中為 活性的受體酪氨酸激酶。
三種細胞系表達的受體酪氨酸激酶未在其它NSCLC細胞系中 〉(見測到。在HCC78、 H2228、以及H1703細月包系中分別^L測到來自 Ros、 ALK、以及PDGFRoc的大量酪氨酸石粦酸化肽。選擇高度表達 ALK的NSCLC細胞系H2228，用於進一步4全查。
84B.人NSCLC月中瘤才羊品的分布
IAP才支術，基本上如在上面的部分A中所描述的，隨後用來檢 查來自NSCLC患者的一組154個人腫瘤樣品的全面磷酸分布。組 織獲自中國第二湘雅醫院。
將冷凍組織樣品切成小片，均化在裂解緩衝液(20mMN-羥乙 基哌喚-N，-2-乙烷磺酸pH8.0、 9M脲、1 mN機酸鈉，補充有2.5 mM焦磷酸鈉、1 mM b-甘油磷酸，1 ml裂解緩衝液用於100 mg冷 凍組織)中，其中4吏用polytron兩次，每次20秒。然後對勻漿液進 4亍簡單超聲處理。用DTT還原清除的溶月包產物並用石典乙醯胺加以 烷基4匕，如先前所述(參見Rush W a/., 7V"A萬/o&c/wo/. 23(7" 94-101 (2005))。然後用20 mM N-幾乙基旅。秦->^，-2-乙烷磺酸稀釋樣品4次 以將脲濃度降低至2M，並在室溫下用胰蛋白酶消化過夜同時溫和 搖動。
用Sep-Pak C18柱粗略純化消化的肽，如先前描述的(參見Rush "a/.,上文)。冷凍並乾燥洗脫物並將乾燥肽溶解在1.4 ml MOPS IP 緩衝液(50 mM MOPS/NaOH pH 7.2、 10 mM Na2P04、 50 mM NaCl) 中並通過離心作用除去不溶物質。在4°C下用耦聯於蛋白質G瓊脂 糖珠(Roche)的160 的磷酸酪氨酸100抗體(細胞信號傳導技術) 進行免疫沉澱過夜。然後用1 ml MOPS IP緩衝液洗滌該珠3次， 並用1 ml HPLC級冷dH20洗滌兩次。用60 pi 0.1% TFA從珠洗脫 磷酸肽，接著用40^10.1。/TFA進行第二次洗脫，然後匯集級分。 利用ZipTip柱(Millipore)濃縮洗脫的肽，並用LC-MS/MS進行分 牙斤。用LTQ離子阱質i普4義(ThermoFinnigan ) 4t集質i普。
如上文在部分A中所描述的，進行磷酸肽免疫沉澱，接著進行 LC-MS/MS分光測定分析。基本上如上文在部分A中所描述的，進 行資料庫搜索和序列賦值，但利用於2004年8月24日發布的包含 27，970種蛋白質的NCBI人悽史據庫。
上述IAP分析鑑定了 2000種以上的非豐餘含磷酸酪氨酸的肽、 1,500種以上的石粦酸酪氨酸位點、以及1,000種以上的酪氨酸石粦酸化
85蛋白質，其來自已檢查的人腫瘤樣品(數據未示出)。在許多腫瘤
中，如EGFR、 Her2、 Her3、 EphA2以及Met,已知與NSCLC信
號有關的受體酪氨酸激酶再次7見測到^皮酪氨酸z疇酸化。在多個肺瘤 才羊品中再次7見測到高 K平的EGFR石粦酸肽，這i正實了該方法可以鑑 定已知在NSCLC細月包系中為活性的受體酪氨酸激酶。
在其它NSCLC細胞系和腫瘤中未觀測到5位患者樣品表達的 受體酪氨酸激酶。在患者CS010/11、 CS045、以及CS110L中觀測 到大量的來自ALK的酪氨酸磷酸化肽。這些三種腫瘤，其高度表 達ALK， ^皮選擇用於進一步檢查。
實施例2
三種ALK融^^基因的分離和測序
A.在人NSCLC細胞系的測序
鑑於在NSCLC細胞系H2228中4企測到ALK激酶的高磷酸化 水平，進行了在編碼ALK的激酶結構域的序列上的cDNA末端的 5'快速擴增，以便確定是否存在嵌合ALK轉錄物。
互補DNA末端的快速擴增
RNeasy Mini Kit ( Qiagen )用來/人H2228細月包系才是取RNA。通 過4吏用DNeasy Tissue Kit ( Qiagen )來提取DNA。藉助於5'RACE 系統(Invitrogen)來快速擴增cDNA末端，其中引物ALK-GSP1 用於cDNA合成而ALK-GSP2和ALK-GSP3用於嵌套式PCR反應。
5，RACE
圖5(圖片A )示出了通過5'RACE對EML4-ALK融合基因(短 變體)的檢測以及在2輪以後PCR擴增產物的檢測。用PCR純化 試劑盒(Qiagen )純化PCR產物並利用ALK-GSP3， 一種ABI3130 毛細管自動DNA測序4義(Applied Biosystems )進4亍測序。所得到
86的產物的序列分析揭示了 ALK的激酶結構域和C端糹皮融合到 EML-4基因N端(參見圖1，圖片B)。 EML4-ALK融合基因(短 變體)是框內的並將EML-4的開始的233個胺基酸融合到ALK的 最後的562個胺基酸(參見圖1,圖片B)。 EML-4和ALK基因均 位於第2號染色體上，因此通過該兩個基因座之間的基因缺失而產 生融合基因。
爿使用了以下引物
ALK-GSP1 ALK-GSP2 ALK-GSP3
;，-GCAGTAGTTGGGGTTGTAGTC (SEQ ID NO: 9) ;，-GCGGAGCTTGCTCAGCTTGT (SEQ ID NO: 10) ;'-TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 11)
PCR測定
進行RT-PCR分析以證實在融合蛋白中EML-4的N端是完整 的(參見圖6(圖片B))。cDNA的第一條鏈合成自2.5mg的總RNA， 其中藉助於具有寡(dT)20的Superscript III第一條鏈合成系統 (Invitrogen )。然後，藉助於引物對EML-Atg和ALK-GSP3來擴增 EML4-ALK融合基因。4昔助於引物只於EML-4-43和ALK-GSP3、 EML-4-94和ALK-GSP3、以及EML4-202和ALK-GSP3,來4企測 交互融合。對於基因組PCR，通過使用高保真Platinum Taq DNA聚 合酶(Invitrogen)並4昔助於引物對EML-4-atg和ALK-tga來進4亍融合 基因的擴增。
^吏用了以下引物
ALK-GSP3:5，國TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO:
12)
EML4畫Atg: 5'畫CGCAAGATGGACGGTTTGGC (SEQ ID NO:
13)
EML4畫43: 5'-TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 14)
87EML4-94: 5'國TGAAATCACTGTGCTAAAGGCGGC (SEQ ID NO: 15)
EML4-202: 5'-AAGCCCTCGAGCAGTTATTCCCAT (SEQ ID NO: 16)
ALK-Tga: 5，-GAATTCCGCCGAGCTCAGGGCCCAG (SEQ ID NO: 17)
值得注意的是，在EML4-ALK融合(短變體)中，ALK部分， 以在其它ALK融合(如發生在ALCL中的NPM-ALK融合)中觀 測到的在ALK中精確的相同點，被融合到EML-4部分。按照基因 組DNA，進一步對H2228細胞系中的ALK的激酶結構域進行測序 並發現是野生型。因此，在H2228中發現的缺失突變並不影響ALK 激酶結構域。另外，野生型EML-4僅在EML4-ALK融合蛋白(短變 體)中不存在的位點被酪氨酸磷酸化，這提示在融合蛋白中為保守的 N端巻曲螺旋結構域(參見圖1A)可以起作用，以二聚化和活化 ALK、以及促進與虔予生型ALK的相互作用。
B.在人NSCLC細月包系中的測序
類似地，鑑於在來自患者CS010A1、 CS045、以及CSllO的人 NSCLC肺瘤樣品中才企測到ALK激酶的高^岸酸化水平，進4亍了在編 碼ALK的激酶結構域的序列上的cDNA末端的5'快速擴增，以便 確定在這些腫瘤中是否存在嵌合ALK轉錄物。
基本上如上面在部分A中所描述的，進行互補DNA端的的快 速擴增和5'RACE,其中引物ALK-GSP1用於cDNA合成而 ALK-GSP2和ALK-GSP3用於嵌套式PCR反應。
圖5 (圖片C)示出了在兩個患者樣品中通過5'RACE對 EML4-ALK融合基因(短和長變體兩者)的檢測，在一位患者中 TFG-ALK融合基因的4企測，以及在2 4侖以後PCR擴增產物的4金測。 基本上如在上面的部分A中所描述的，對PCR產物進行純化和測 序。所得到的產物的序列分析揭示了 ALK的激酶結構域和C端以兩種不同的變體融合到EML-4基因N端(參見圖1A-1B，圖片B )。 EML4-ALK融合基因是框內的並將EML-4的開始的233個胺基酸 (短變體)或開始的495個胺基酸(長變體)融合到ALK的最後 的562個胺基酸(參見圖1A-1B，圖片B)。 EML-4和ALK基因均 位於第2號染色體上，因此通過這兩個基因座之間的基因缺失來產 生融合基因。在患者CS045中融合基因(短變體)的觀測結果證實 了在人細胞系H2228中這種突變體基因的發現。
TFG-ALK融合基因也是框內的並且將TFG的開始的138個氨 基酸融合到ALK的最後的562個胺基酸(參見圖1C,圖片B)。 TFG和ALK基因位於不同的染色體上(分別為第6號和第2號染 色體)，因此通過這兩個基因座之間的基因易位來產生融合基因。 有趣的是，TPG與ALK的融合發生在針對兩種EML4-ALK變體的 融合所觀測到的在ALK中的精確相同的點，這表明在實體瘤中在 此點ALK的截短可以經常發生。
如在上面的部分A中所描述的，使用相同的引物。基本上如在 上面的部分A中所描述的，進行RT-PCR分析，以證實EML-4和 TFG的N端在融合蛋白中是完整的(參見圖6(圖片B))。用於EML-4 和ALK的引物對是如在上面的部分A中所描述的。以下引物對用 於TFG:
TFG-F1: 5'-TTTGTTAATGGCCAGCCAAGACCC-3 (SEQ ID NO: 28)
值得注意的是，在兩種EML4-ALK融合變體中，ALK部分， 以在其它ALK融合(如發生在ALCL中的NPM-ALK融合)中只見 測到的在ALK中#奮確的相同點，故融合到EML-4部分。另外，野 生型EML-4僅在EML4-ALK融合蛋白中不存在的位點^皮酪氨酸磷 酸化，這提示在融合蛋白中為保守的N端巻曲螺旋結構域(參見圖 1A-1B)可以起作用，以二聚化和活化ALK、以及促進與野生型 ALK的相互作用。同樣值得注意的是，TG部分與ALK的融合也 發生在ALK中的精確相同的點，並且確實在人淋巴瘤中已描述了
89在此點的TFG與ALK的融合(參見Hernandez " a/. (2002)，上文)， 4旦在人實體瘤，如NSCLC，中先前並沒有描述。
實施例3
利用siRNA抑制ALK融合-表達哺乳動物實體瘤的生長
為了i正實ALK的截短的/融合形式正驅動在NSCLC細胞系 H2228以及來自患者CS010/11、 CS045、以及CSllO的NSCLC腫 瘤樣品中的細胞生長和存活，可以檢查siRNA (相對於ALK )抑制 這些細月包和胂瘤生長的能力。
ALK SMJArpool siRNA雙鏈體(專有靶序列-數據未示出)可 以購買自，侈'B口， DharmaconResearch, Inc. (Lafayette, CO)。非淨爭異 SM^Wrpool siRNA用作對照。藉助於電穿孔並用siRNA轉染細胞。 簡單;也i兌，利用方形波電穿孑W義(BTX Genetronics， San Diego， CA ) 對2 x 107個細月包(H2228 )發送月永衝一次(20ms; 275V, K562 20ms; 285V )，在室溫下溫育30分鐘，然後轉移到含有30 ml RPMI-1640/10% FBS的T150燒並瓦中。
藉助於CellTiter 96 AQueousOne溶液細月包增殖測定(Promega) 來確定能生存細月包的悽t目。通過4吏用OriginPro 6.1專欠件(OriginLab ) 來計算IC50 。
可以通過Cleaved-Caspase-3 ( Cell Signaling Technology)的流式細胞分析來確定在48小時時凋亡細胞的百分率。
免疫印跡分析揭示，在siRNA轉染進入H2228細胞或來自患 者CS010/11、 CS045、以及CSllO的腫瘤細胞以後72小時，ALK 的表達被特異性地和顯著地降低。ALK的負調節預期會導致細胞生 長的強抑制。用ALK siRNA治療也預期會導致這些實體瘤細胞的 增加的凋亡。這些結果將進一步表明，H2228細胞系和患者胂瘤中 的突變體/融合ALK糹敫酶正驅動這些NSCLC細力包的增殖和生長， 以及通過利用siRNA來抑制ALK激酶表達和活性可以抑制這樣的 生長和增殖。實施例4
利用WI-131和/或WI-154來抑制ALK融合-表達哺乳動物 實體瘤的生長
為了進一步i正實突變體ALK融合蛋白正驅動來自患者 CS010A1、 CS045、以及CSllO的NSCLC細胞系H2228和NSCLC 腫瘤細胞的生長和生存，可以用ALK激酶的靶向抑制劑，如WI-131 和/或WI-154,來處理細胞。WI-131和W-154是ALK激酶的喹唑 啉類小分子抑制劑，並且已描述了在T細胞淋巴瘤中它們相對於 NPM-ALK融合蛋白的活性。參見Marzecetal.，上文。
簡單;也"i兌，3#養NSCLC糹田月包，然後用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)並4安照製造商的建i義，進 行細胞生長抑制測定。簡單地說，將1000至5000個細胞接種到平 底96孔平板上並在含有10%FBS的完全培養基中生長。在24小時 以後，細胞培養基改變成含有10%FBS的100 pi完全生長培養基， 其包含各種濃度的藥物，然後另外溫育細胞72小時。將每種藥物 濃度施加於細胞的三個孔。在溫育結束時，將20 Jul的CellTiter 96 AQue。usOne溶液加入到每個孔中，並溫育平板l-4小時。利用Titan Multiskan Ascent微量板讀數器(Titertek Instrument)在490 nm處 讀出吸光度。生長抑制可以表示為讀自經治療細胞與未治療細胞的 吸光度百分率的平均^直土SD^直。重複測定至少三次。
這樣的分析預期會證實，ALK融合蛋白(EML4-ALK(短和長 變體)、TFG-ALK)正驅動人NSCLC腫瘤(其中表達這些突變體蛋 白質)亞型的生長和存活，以及通過利用革巴向4中製劑，如WI-131 和/或WI-154,來抑制融合ALK激酶的活性可以抑制上述細胞。實施例5
ALK融合蛋白驅動轉化哺乳動物細胞系的生長和存活
為了證實一種或多種ALK融合蛋白的表達可以將正常細胞轉 化成癌性表型，可以用上述cDNA構建物(實施例2 )來轉化3T# 細胞，其分別表達EML4-ALK (短和長變體)或TFG-ALK融合蛋白。
簡單;也i兌，將細月包保持在RPMI-1640培養基(Invitrogen)中， 其含有10。/。小牛血清(FBS)(Sigma)和1.0 ng/ml IL-3(R&D Systems)。 如前所述進4於反轉錄病毒上清液的生產和轉導。參見Schwaller " a/.: 五wZ)o / 77(7》5321-33 (1998)。用包含MSCV-Neo/EML4-ALK (或 TFG-ALK)載體的反轉錄病毒上清液轉導3T3細胞並選擇用於 G418 ( 1 mg/ml)。然後在PBS中洗滌細月包三次以後，通過平^反轉導 細胞來評估轉化細胞在軟瓊脂上生長的能力。如果需要，為了獲得 劑量反應曲線，3o上所述(參見實施例3 )用相》于于ALK的siRNA 處理細胞，並用CellTiter 96 AQue。us One溶液細胞增殖測定 (Promega)來確定能生存細月包的悽t目。可以4昔助於OriginPro 6.1 壽欠4牛(OriginLab )來計算IC5o。可以通過Cleaved-Caspase-3的流式 細月包分衝斤並利用對於此輩巴特異的抗體(Cell Signaling Technology ) 來確定在48小時時的凋亡細胞百分率。這樣的分析將表明， EML4-ALK融合蛋白(短或長變體)或TFG-ALK融合蛋白的表達 可以轉化3T3細胞，並且當這些細胞由ALK融合蛋白驅動時證實 在軟瓊脂上的存活和生長，以及進一步，在轉化細胞中抑制ALK 表達可導致降低的生存力和增加的凋亡。
實施例6
利用FISH測定iM全測EML4-ALK融合蛋白在人實體瘤中
的表達
如前所述，利用螢光原4立雜交(FISH)測定來檢測人NSCLC 肺瘤樣品中EML4-ALK融合蛋白(短變體)的存在。參見，例如，Verma ef a/. Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988)。檢查了 200個以上的石蠟包 埋人NSCLC肺瘤樣品。
ALK雙色、斷裂重4非才罙4十獲自Vysis ( Vysis， Dowers Grove， IL， USA)並按照製造商的說明加以使用，其中具有以下改進。簡單地 說，再水化石蠟包埋組織切片並在0.01M檸檬酸緩衝液(pH 6.0 ) 中經受孩"皮抗原恢復11分鐘。在37°C下，用蛋白酶(4mg/ml胃蛋 白酶，2000-3000U/mg)消化切片25分鐘，脫水並雜交於"i更置在37°C 下的FISH揮:4十18小時。在洗滌以後，將在Vectashield去於固劑(Vector Laboratories, Burlingame, CA )中的4，，6-二脒基-2-苯基吲。呆(DAPI; mg/ml)用於4亥-t比染色。
ALK重排探針包括在野生型序列(SEQ ID NO: 6 )中在ALK 基因的斷裂點(在核芬酸3171處)相反側的兩種不同標記的探針。 當被雜交時，天然ALK區將呈現為橙色/綠色融合信號，而在此基 因座處的重排(如在EML4-ALK缺失突變體中所發生的)將導致 分開的橙色和綠色信號。參見圖6。
FISH分析揭示了在所研究樣本總體中這種短變體EML4-ALK 突變的相對低發生率(229個樣品中有一個)。然而，鑑於世界範圍 內NSCLC的高發生率U又在美國每年有151，00個以上的新病例)， 預計有顯著悽t量的躲藏這種突變體ALK的患者，這些患者可以獲 利於ALK-抑制治療方案。
實施例7
利用PCR測定來險測人實體瘤中的ALK融合蛋白表達
如先前描述的，還可以利用基因組或反轉錄酶(RT)聚合酶鏈 反應(PCR)來檢測人實體瘤樣品中一種或多種ALK融合蛋白的 存在。參見，例3口， Cools " a/.， iV: 乂 Med. 1201-1214
(2003)。簡單和舉例來i兌，利用標準4支術，實體瘤才羊品可以獲自患 有例如NSCLC的患者。構建了相對於截短的ALK激酶或EML4-ALK融合蛋白(短或長變體)或TFG-ALK融合蛋白的PCR #笨針。RNeasy Mini Kit(Qiagen)可以用來乂人胂瘤才羊品4是取RNA 。可 以4昔助於DNeasy Tissue Kit(Qiagen)來^是取DNA。關於RT-PCR， cDNA的第一條鏈合成自，例如，2.5pg總RNA，其中4吏用，例如， 具有寡(dT)20的Superscript III第一條鏈合成系統(Invitrogen )。
然後，通過4吏用引物對，例如，EML4-202和ALK-GSP3來擴 增ALK融合基因(參見上面的實施例2)。對於基因組PCR,可以 藉助於高4呆真Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen )並4吏用引物 對，例如，EML4-202和ALK-GSP3進行融合基因(參見上面的實 施例2)的擴增。這樣的分析將鑑定患有以截短的ALK激酶(和/ 或EML4-ALK融合蛋白或TFG-ALK融合蛋白)的表達為特徵的實 體瘤的患者，該患者是利用ALK-抑制治療劑，如WHI-131和/或 WHI154,進行治療的4美選者。
權利要求
1. 一種分離的多核苷酸，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列至少95％相同於選自由下述組成的組的序列(a)編碼棘皮動物微管結合蛋白樣4/間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合多肽的核苷酸序列，所述融合多肽包括SEQID NO1或SEQ ID NO18的胺基酸序列；(b)編碼EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO19的核苷酸序列；(c)編碼EML4-ALK融合多肽的核苷酸序列，所述融合多肽包括EML-4的N端胺基酸序列(SEQ ID NO3的殘基1-233或SEQ ID NO3的殘基)以及ALK的激酶結構域(SEQID NO5的殘基1116-1383)；(d)包括EML-4的N端核苷酸序列(SEQ ID NO4的核苷酸1-700或SEQ ID NO4的核苷酸1-1486)以及ALK的激酶結構域核苷酸序列(SEQ ID NO6的核苷酸3348-4149)的核苷酸序列；(e)包括圍繞EML4-ALK融合多核苷酸的融合接頭(SEQID NO2的核苷酸700-701或SEQ ID NO19的核苷酸1486-1487)的至少6個鄰接核苷酸的核苷酸序列；(f)編碼包括圍繞EML4-ALK融合多肽的融合接頭(SEQID NO1的殘基233-234或SEQ ID NO18的殘基495-496)的至少6個鄰接胺基酸的多肽的核苷酸序列；以及(g)互補於(a)-(f)的任何核苷酸序列的核苷酸序列。
2. —種分離的多核苷酸，其在嚴格雜交條件下雜交於根據權利要 求1所述的多核苷酸，其中，所述進行雜交的分離的多核苷酸 在嚴格雜交條件下並不雜交於具有僅由A殘基或僅由T殘基 構成的核苷酸序列的多核苷酸。
3. 根據權利要求2所述的分離的多核苷酸，其中，所述多核苷酸 進一步包^"可^r測才示i己。
4. 一種用於產生重組載體的方法，包括將根據權利要求1所述的 分離的核酸分子插入到載體中。
5. —種通過根據權利要求4所述的方法產生的重組載體。
6. —種用於製備重組宿主細胞的方法，包括將根據權利要求5 所述的重組載體51入到宿主細胞中。
7. —種通過根據權利要求6所述的方法產生的重組宿主細月包。
8. —種用於產生重組EML4-ALK融合多肽或截短的活性ALK 多肽的方法，所述方法包括在適合於表達所述融合多肽的條件 下培養根據權利要求7所述的重組宿主細胞以及回收所述多 肽。
9. 一種分離的多肽，包括胺基酸序列，所述氨基S拼列至少95% 相同於選自由下述組成的組的序列(a)編碼包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 18的胺基酸 序列的EML4-ALK融合多肽的胺基酸序列；(b )編碼包括EML-4的N端胺基酸序列(SEQ ID NO: 3 的殘基1-233或SEQ ID NO: 3的殘基l-495)和ALK的激酶結構域(SEQ ID NO: 5的殘基1116-1383)的EML4-ALK融合多肽的氛基酸序列；以及(c )編碼包括圍繞EML4-ALK融合多肽的融合接頭(SEQID NO: 1的殘基233-234或SEQ ID NO: 18的殘基495-496)的至少6個鄰接胺基酸的多肽的胺基酸序列。
10. —種利用根據權利要求5所述的重組載體或根據權利要求7所述的重《且宿主細月包產生的重組EML4-ALK融合多肽或截4豆的活性ALK多肽。
11. 一種分離的試劑，其特異性地結合於或^r測^4居權利要求9所述的EML4-ALK融合多肽，1旦並不結合於或4企測野生型EML-4或野生型ALK。
12. 根據權利要求11所述的分離的試劑，其中，所述試劑是抗體或重同位素標記(AQUA)肽。
13. 根據權利要求11所述的分離的試劑，其中，所述試劑是聚合酶鏈反應(PCR)探針或螢光原位雜交(FISH)探針。
14. 才艮據權利要求12所述的重同位素標記(AQUA)肽，其中，所述肽包括野生型ALK中的EML4-ALK融合多肽或截短點的融合接頭的胺基酸序列。
15. —種用於在來自哺乳動物癌症的生物衝羊品中才全測突變體ALK多核苷酸和/或其編碼的突變體ALK多肽的存在的方法，所述方法包括以下步艱朵(a) 從哺乳動物癌症獲得生物樣品；以及(b) 利用至少一種試劑，所述試劑檢測融合多核苦酸、或其編碼的融合多肽，包含具有部分二級蛋白質的部分ALK，以確定在所述生物樣品中是否存在ALK突變體多核苷酸和/或其編碼的突變體ALK多肽。
16. 才艮據4又利要求15所述的方法，其中，所述癌症是實體瘤肉瘤或癌。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中，所述癌是肺癌。
18. 才艮據斥又利要求17所述的方法，其中，所述肺癌是非小細月包肺癌(NSCLC)。
19. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述突變體ALK多肽是融合多肽，所述融合多肽包括具有部分所述二級蛋白質的ALK(SEQ ID NO: 5)的殘基1116-1383。
20. 根據權利要求15或16所述的方法，其中，所述二級蛋白質選自由EML-4(SEQ ID NO: 3)和TRK-融合基因(TFG)蛋白質(SEQ ID NO: 22)組成的組。
21. 才艮據權利要求20所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML-4(SEQ ID NO: 3)的殘基1-233或殘基1-495或TFG(SEQID NO: 22)的殘基1-138。
22. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述融合多核香酸包括EML4-ALK融合多核苦酸(SEQ ID NOs: 2或19)或TFG-ALK融合多核芬酸(SEQ ID NO: 21)。
23. 才艮據4又利要求15所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML4-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 1或18)或TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)。
24. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述融合多核苷酸是根據權利要求1所述的融合多核苷酸。
25. 才艮據權利要求15所述的方法，其中，所述融合多肽是才艮據權利要求9所述的融合多肽。
26. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述試劑包括根據權利要求1所述的多核苷酸和/或根據權利要求11所述的至少一種試劑。
27. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述試劑包括分離的試劑，所述分離的試劑特異性地結合於或檢測TFG-ALK融合多肽(SEQ ID NO: 20)或TFG-ALK融合多核苷酸(SEQ ID NO:21)， {旦並不結合於或4全測野生型TFG或野生型ALK。
28. 根據權利要求27所述的方法，其中，所述試劑是抗體或重同位素標記(AQUA)肽。
29. 根據權利要求27所述的方法，其中，所述試劑是聚合酶鏈反應(PCR)探針或螢光原位雜交(FISH)探針。
30. 才艮據權利要求28所述的方法，其中，所述重同位素標記(AQUA)肽包括^f生型ALK中的TFG-ALK融合多肽或截短點的融合接頭的胺基酸序列。
31. 才艮據權利要求15所述的方法，其中，所述方法以流式細胞術(FC)、免疫組織化學(IHC)、或免疫螢光(IF)測定形式來實施。
32. 才艮據4又利要求15所述的方法，其中，所述方法以螢光原位雜交(FISH)或聚合酶鏈反應(PCR)測定形式來實施。
33. 根據權利要求15所述的方法，其中，才企測所述ALK融合多肽的活性。
34. —種用於確定一種化合物是否抑制以ALK融合多肽的表達為特4正的哺乳動物實體瘤的進展的方法，所述方法包括確定所述化合物是否在所述癌症中抑制所述ALK融合多肽的表達和/或活性的步驟。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中，所述ALK融合多肽包括ALK(SEQ ID NO: 5)的殘基1116-1383和一部分所述二級蛋白質。
36. 根據權利要求34所述的方法，其中，所述二級蛋白質選自由EML-4(SEQ ID NO: 3)和TRK-融合基因(TFG)蛋白質(SEQ IDNO: 22)組成的組。
37. 衝艮據4又利要求36所述的方法，其中，所述融合多肽包括EML-4(SEQ ID NO: 3)的殘基1-233或殘基1-495或TFG(SEQID NO: 22)的殘基1-138。
38. 根據權利要求34所述的方法，其中，利用至少一種檢測根據權利要求1所述的多核苷酸的試劑、和/或至少一種根據權利要求11所述的試劑、和/或至少一種衝僉測TFG-ALK融合多核香酸或多肽的試劑，來確定所述ALK融合多肽的表達和/或活性的抑制。
39. —種用於對表達EML4-ALK融合多肽的癌症的進展進行抑制的方法，所述方法包括抑制所述EML4-ALK融合多肽在所述癌症中的表達和/或活性的步-驟。
40. —種用於對表達TFG-ALK融合多肽的實體瘤的進展進行抑制的方法，所述方法包括抑制所述TFG-ALK融合多肽在所述癌症中的表達和/或活性的步驟。
41. 根據權利要求39或40所述的方法，其中，所述癌症或所述實體瘤是肺癌。
42. 根據權利要求41所述的方法，其中，所述肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。
43. #4居權利要求39或40所述的方法，其中，用包括WHI-131和/或WHI-154 、或它們的類似物的組合物來抑制所述EML4-ALK融合多肽或所述TFG-ALK融合多肽的表達禾口/或活性。
全文摘要
根據本發明，現已在人實體瘤，例如非小細胞肺癌(NSCLC)中鑑定了新的涉及第2號染色體的基因缺失和易位，其導致結合部分間變性淋巴瘤激酶(ALK)激酶與部分二級蛋白質的融合蛋白。二級蛋白質包括棘皮動物微管結合蛋白樣4(EML-4)和TRK-融合基因(TFG)。保留ALK酪氨酸激酶活性的EML4-ALK融合蛋白被證實可以驅動以這種突變為特徵的NSCLC的增殖和存活。因此，本發明部分地提供了分離的多核苷酸和載體，其編碼所披露的突變體ALK激酶多肽，用於檢測它的探針，分離的突變體多肽，重組多肽，以及用於檢測融合和截短的多肽的試劑。所披露的這種新融合蛋白的鑑定使得可以用新方法來確定在生物樣品中這些突變體ALK激酶多肽的存在，本發明還提供了對抑制蛋白質的化合物進行篩選的方法，以及對以突變體多核苷酸或多肽為特徵的癌症的進展進行抑制的方法。
文檔編號C07H21/02GK101466721SQ200780021431
公開日2009年6月24日 申請日期2007年4月13日 優先權日2007年4月13日
發明者建 俞, 克拉裡薩·裡科瓦, 蘿拉·沙利文, 安東尼·波塞馬託, 瓊·麥克尼爾, 赫伯特·哈克, 郭愛蘭, 顧挺磊 申請人:細胞信號技術公司